Mikrotübül taktoidlerinin kendi kendine montajı
Summary
Bu makalede, bitki bazlı bir mikrotübül çapraz bağlayıcısı olan MAP65 ve kalabalıklaştırıcı ajan olarak PEG kullanılarak taktoidler şeklinde mikrotübül montajlarının oluşumu için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Hücre iskeleti, değişiklikleri yönlendirecek bir yönetici olmadan, hücre içindeki büyük iç organizasyondan ve yeniden yapılanmadan sorumludur. Bu, özellikle mikrotübüllerin hücre bölünmesi sırasında mili oluşturduğu mitoz veya mayoz sırasında geçerlidir. İş mili, hücre bölünmesi sırasında genetik materyali ayırmak için kullanılan makinedir. In vitro olarak kendi kendini organize eden iğler oluşturmaya doğru, yakın zamanda mikrotübülleri, minimum mikrotübül ile ilişkili protein seti ve kalabalıklaştırıcı ajanlarla iğ benzeri montajlara dönüştürmek için bir teknik geliştirdik. Spesifik olarak, bitkilerden bir antiparalel mikrotübül çapraz bağlayıcısı, mayadan Ase1 homologu ve memeli organizmalardan PRC1 olan MAP65 kullanılmıştır. Bu çapraz bağlayıcı, mikrotübülleri uzun, ince, iğ benzeri mikrotübül kendi kendini organize eden montajlar halinde kendi kendine organize eder. Bu düzenekler ayrıca sıvı kristal taktoidlere benzer ve mikrotübüller mezojenler olarak kullanılabilir. Burada, bu mikrotübül taktoidlerini oluşturmak ve ayrıca floresan mikroskobu kullanarak montajların şeklini ve fotobeyazlatma sonrası floresan geri kazanımı kullanarak bileşenlerin hareketliliğini karakterize etmek için protokoller sunulmaktadır.
Introduction
Mitoz yoluyla hücre bölünmesi, yaşamı sürdürmek için en önemli biyolojik süreçlerden biridir. Tübülin dimerlerinden oluşan mikrotübül filamentleri, bu işlemin temel yapısal elemanlarıdır. Kromozomlar hücre merkezinde hizalandığında metafazda oluşturulan geçici makineye, ipliklerle kaplı bir tezgahın mili gibi olan şekli nedeniyle mitotik iğ denir (Şekil 1A). Birçok organizmada, mikrotübüllerin metafazda yoğunlaştırılmış kromozomları hücrenin merkezine itmek ve çekmek, hizalamak ve anafazda onları ayıracak mikrotübüllere bağlamak için kullanıldığı iyi bilinmektedir (Şekil 1B, C). İş mili hem mayoz (Şekil 1B) hem de mitozda (Şekil 1C) oluşur, iplik gibi merkezi eksenin etrafına sarılmamış, ancak arayüze paralel çalışan birçok üst üste binen mikrotübülden yaratılmıştır. Bu mikrotübül bazlı yapıların oluşturulması, çapraz bağlanan ilişkili proteinleri ve kromozomları itmeye ve çekmeye yardımcı olmak için motor görevi görebilen ilişkili enzimleri gerektirir1.
Mayotik iğler üzerine yapılan çalışmalar, mikrotübüllerin kısa, dinamik olduğunu ve çapraz bağlı dizilerde 2,3,4,5,6 üst üste bindiğini göstermiştir (Şekil 1Di). Bu kısa mikrotübüllerin fiziksel organizasyonu nedeniyle, mayotik iş mili bir sıvı kristal taktoide benzer (Şekil 1E). Gerçekten de, iğlerin sıvı kristal taktoidlerden bekleneceği gibi birleştiği ve birleştiği gösterilmiştir5.
1960’lı yıllara dayanan birçok çalışma, mitotik iş mili 7,8,9,10 içinde iki tip mikrotübül olduğunu belirlemek için fiksasyon, seri bölümler ve elektron mikroskobu kullanmıştır. İlk tip, iş mili direğini kinetochore’a bağlayan kinetochore mikrotübülleri olarak adlandırılır. İkinci tip, kromozomları geçerek büyüyen ve orta bölgede üst üste binen polar veya polar mikrotübüller olarak adlandırılır (Şekil 1Dii)8,9,10. Üçüncü bir tip, iğin dışında bulunan ve kutupları hücre kenarına bağlayan astral mikrotübüller olarak adlandırılır; Bu mikrotübül örgütleri mevcut tartışmanın kapsamı dışındadır. Mikrotübüller için nükleasyon merkezlerini etkileyen augmin6 ve gama-tübülin halka kompleksi arasındaki etkileşim üzerine son zamanlarda yapılan çalışmalar yapılmıştır, bu da Şekil 1D’deki gibi daha kısa mikrotübüllere sahip mitotik bir iğle sonuçlanır.
Mikrotübüller geniş olduklarından daha uzun olduklarından, yüksek en-boy oranına ve yüksek sertliğe sahip olduklarından, sıvı kristal moleküllerinin ölçeklendirilmiş versiyonları gibidirler. Yumuşak madde fiziğinde, atomlar ve moleküller, çekirdeklenme ve kristallerin erimesi de dahil olmak üzere faz geçişlerinin fiziksel mekanizmalarını çıkarmak için minimum etkileşimler kullanılarak yaklaştırılmıştır11. Benzer şekilde, mikrotübüller, sıvı kristal moleküllerinin ölçeklendirilmiş versiyonları olan mezo ölçekli nesnelerdir ve nematik fazların izotropik olanlardan çekirdeklenmesi ve büyümesi de dahil olmak üzere sıvı kristal dinamiğinin fiziği hakkında fikir verir. Ayrıca, yukarıda tartışıldığı gibi, mayotik iğ, sıvıkristal moleküllerinin izotropik durumundan 3,4,5 çekirdeklenen ve büyüyen nematik bir durum olan sıvı kristal taktoidinki gibi özellikler gösterir. Taktoidler için, çekirdeklenme ve büyüme diğer kristallerinki gibidir (yani, nispeten yüksek konsantrasyonda mezojen [sıvı kristalleri oluşturan moleküller] gerektirir). Taktoidin benzersiz “iğ” şekli, nematik faza hizalanan sıvı kristal mezojenlerinin lokal hizalamasından gelir (Şekil 1E). Yuvarlak bir kristal oluşturamazlar çünkü moleküller oldukça asimetriktir. Mikrotübüllerin doğası göz önüne alındığında, yüksek yerel mikrotübül konsantrasyonundan yapılan mitotik iğ makinelerinin, taktoid veya iğ olarak adlandırılıp adlandırılmadığına bakılmaksızın aynı şekle sahip olması şaşırtıcı değildir. Taktoitler, konik uçlarda kutuplarla (Şekil 1Ei) bipolar veya homojen olabilir, kutuplar sonsuzlukta etkili bir şekilde (Şekil 1Eii).
İş mili oluşumunun önemi göz önüne alındığında, iyonik türler 12,13, tükenme etkileşimleri yaratan kalabalık ajanlar 14,15 ve spesifik mikrotübül çaprazbağlama proteinleri 13,16,17,18,19 yoluyla demetler halinde mikrotübül yoğuşmasını göstererek in vitro olarak kendi kendini organize eden iğ oluşumuna yönelik çabalar devam etmektedir. 21. Şaşırtıcı bir şekilde, bu ajanların hepsi mikrotübüllerin lokal konsantrasyonunu arttırmak için çalışsa da, genellikle uzun mikrotübül demetleriyle sonuçlanırlar, ancak taktoidlerle sonuçlanmazlar. Bu demetlerin uzun olmasının bir nedeni, onları oluşturan mikrotübüllerin de uzun olması olabilir. Daha kısa mikrotübüller kullanan son çalışmalar,15’in sonunda konik olmayan daha uzun demetler de bildirmiştir; Bu durumda, demetler, demetlerin genişlemesine neden olan motor proteinleri ile bir arada tutulur ve böylece onları daha uzun hale getirir. Burada açıklandığı gibi, konik, iş mili benzeri montajlar için ekstansiyon olmayan çapraz bağlayıcılara sahip kısa mikrotübüllere ihtiyaç vardır.
Son zamanlarda, çekirdeklendirici stabil mikrotübüllerin varlığında antiparalel çapraz bağlayıcı MAP65 kullanılarak mikrotübül taktoidlerinin oluşturulmasını sağlamak için bir teknik geliştirdik22. Mikrotübüllerin kısa olması gerekiyordu, ancak mikrotübül uzunluğundaki bilinen birkaç düzenleyici, mikrotübülleri dinamik kararsızlığa veya uçtan uca tavlamaya karşı kapatabilir. Bunun yerine, büyümeden sonra filamentleri çekirdeklendirmek ve stabilize etmek için GMPCPP kullanıldı. Bu, taktoidlere kendi kendini organize edebilen yüksek yoğunluklu kısa mikrotübüller oluşturmaya izin verdi. Bu taktoidler birefringans altında bakıldığında homojendi. Kısa mikrotübüllere ek olarak, taktoidleri oluşturmak için spesifik bir antiparalel çapraz bağlayıcı olan MAP65 kullanılmıştır (Şekil 2). MAP65, PRC1 / Ase1 mitotik çapraz bağlayıcılar ailesinde bitki mikrotübül ile ilişkili bir proteindir23. MAP65, kendisine ve mikrotübüllere bağlanmak için güçlü bir afiniteye sahip bir dimer olarak bulunur24. Aktin filamentleri 25,26,27 ile gözlenen, bipolar olan ve sıvı kristallerin sıvı benzeri özelliklerine sahip olan mayotik iğ ve taktoidlerin aksine, mikrotübül taktoidlerinin katı benzeri22,28 olduğu gözlenmiştir.
Burada, mikrotübül taktoidlerinin oluşturulması ve montajların şeklini ve floresan bazlı teknikler kullanılarak bileşenlerin hareketliliğini karakterize etmek için protokoller sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yöntemler mikrotübül taktoidleri oluşturmak için çeşitli makalelerde kullanılmıştır (Şekil 2)22,28. Bu deneyler, çoğu hücre tipinde mitotik veya mayotik iğin şeklini ve stabilitesini kontrol eden örgütsel ilkeleri ortaya çıkarmaya yardımcı olmak için biyolojik olarak ilgilidir. Ek olarak, mikrotübüller, sıvı kristallerin izotropik fazlardan nematik fazları nasıl çekirdeklendirdiği ve büyüttüğü hakkında daha fazla bilgi edinmede yardımcı olabilecek model sıvı kristal mezojenleridir.
Burada özetlenen prosedür, mikrotübül kendi kendine organizasyonu keşfetmek için çeşitli avantajlara sahiptir. İlk olarak, laboratuvara başlamadan önce lise öğrencileri de dahil olmak üzere birçok öğrenci tarafından laboratuvarda çok az ön bilgi veya eğitim ile gerçekleştirilmiş olan oldukça tekrarlanabilir. Taktoidler çift refringent22’dir, floresan mikroskobuna ek olarak iletilen ışıkta görüntülenmelerini sağlar, bu yöntemi birçok laboratuvar için erişilebilir kılar ve bu deneysel prosedür, üst düzey araştırmalara ek olarak eğitim amaçlarına uyarlanabilir. Son olarak, bu süreç biyolojik sistemleri soyulmuş, indirgemeci bir yaklaşımla anlamaya ve araştırmaya devam etmek için yollar açarak, her bir ek koşulun, proteinin veya katkı maddesinin taktoidlerin ve belki de nihayetinde iğin kendi kendine organizasyonunu nasıl değiştirebileceğini anlamasını sağlar. Daha iyi biyomimikri için hedefler arasında aktivite, akışkanlık ve filament polarite sıralaması bulunur.
Deneyi etkileyen ve beklenmedik sonuçlar veren birkaç faktör olabilir. Örneğin, taktoidler oluşmuyorsa (Şekil 2) ancak fan benzeri desenler gözlenirse, MAP65 muhtemelen mevcut değildir veya mikrotübüllere bağlanmaz22,28. Bu, MAP65 floresan kanalında da belirgin olmalıdır, çünkü GFP-MAP65 mikrotübüllere bağlı olmayacaktır.
Taktoidler oluşmazsa ve arka plan cam üzerinde lekeler olarak görünüyorsa, bunun nedeni yüzey kaplaması olabilir. Bir kez gerçekleştirildikten sonra, silanizasyon kapaklarda sadece 1 ay sürer. Yıprandığında, tübülin spesifik olmayan bir şekilde maruz kalan yüzeye bağlanabilecektir. Bu bağlanma garip desenlerde gerçekleşecektir.
Taktoidler oluşmazsa ve tübülin çeşitli şekil ve boyutlardaki agregalarda gözlenirse, bunun nedeni düşük kaliteli tübülin olabilir. Tubulin, mikrotübül polimerizasyonu yerine bu yol dışı agregasyonu yönlendirebilecek ilk agregaları çıkarmak için santrifüj edilebilir. Yüzey tübüline bağlanıyorsa, çözeltideki tübülü de tüketebilir. Mikrotübüllerin polimerizasyonu için kritik konsantrasyonun altındaki düşük tübülin konsantrasyonları, agregalara neden olabilir.
FRAP deneylerinde, MAP65 kanalı herhangi bir iyileşme göstermiyorsa (Şekil 5), fotobeyazlatmanın mikrotübüllere fotozarar vermiş olması mümkündür. Fotohasar, filamentlerin lokalize tahribatına neden olur. Bu, iletilen kanalda muayene ile kontrol edilebilir. Mikrotübül taktoidleri, iletilen kanalda, çevredeki su ile yüksek indeksli kırılma uyumsuzluğu yoluyla görülebilir. Işık kaynaklı fotohasar, fotobeyazlatmaya tabi tutulan ROI’nin bulunduğu yerde iletilen ışık görüntülemede yanık izi veya kontrast kaybı olarak görünecektir. Bu meydana gelirse, proteinlerin fotohasarını inhibe etmek için lazer veya ışık gücü azaltılmalıdır.
Bu prosedür ve yaklaşımda karşılaşılan çeşitli zorluklar vardı. Bir sorun, uzunluk ölçümlerinin şu anda resme tıklanarak elle gerçekleştirilmesidir. Bu yöntem, basit olsa da, yüksek belirsizliğe neden olabilir. Enine kesiti kullanan ve bir Gaussian’a uyan genişlik ölçümü, boyutu ölçmek için daha iyi bir yöntemdir. Uzunluk için benzer bir yöntem kullanılabilir. İkinci bir sorun, bazen, taktoidlerin, çok uzun ve ince oldukları için bükülebilmeleridir. Bu, uzunluğu ölçmeyi daha zor hale getirir. Kontur uzunluğu, parçalı bir çizgi kullanılarak ölçülebilir, ancak bir segment her eklendiğinde belirsizlik eklenir.
Bilimsel bir bakış açısına göre, bu yaklaşımın sıvı kristaller veya iğler için bir model olarak kullanımı için başka zorlukları da vardır. İlk zorluk, mikrotübüllerin oluşturduğu taktoidlerin uzun, ince şekli olmuştur (Şekil 3 ve Şekil 4). Önceki yayınlarda belirtildiği gibi22, mikrotübül taktoidleri bipolar değil, homojen taktoidlerdir. Bu, şekli oluşturan mikrotübüllerin, yapının uçlarına işaret edecek şekilde yeniden yönlendirilmediği anlamına gelir. Bunun yerine, tüm mikrotübüller uzun eksene paraleldir ve “kutuplar” sonsuzlukta bulunur. Bu, moleküler sıvı kristaller veya hatta sıvı kristal mezojenler olarak da işlev görebilen aktin veya DNA için gözlemlenen taktoidlerden çok farklıdır. Bu diğer sistemlerde, taktoidler bipolar ve çapraz polarizörlerde bakıldığında, çubukların yeniden yönlendirilmesinin belirgin işaretlerini gösterirler.
Bu sistemdeki ikinci büyük zorluk, mikrotübüllerin taktoid içinde hareketsiz olmasıdır. Bu, mikrotübüllerin geri kazanımı çok düşük olduğu için FRAP deneylerinden ve analizlerinden açıktır. Katı benzeri yapıları, mikrotübül taktoidlerini büyük ölçekli sıvı kristal analogları kadar az değerli kılar. Bir sıvı kristalin nematik fazı hem sıvı (sıvı) hem de kristal (organize) özelliklere sahip olmalıdır. Şekil iş mili için doğru gibi görünse de, hareketsizlik sistemi model bir mitotik iş mili olarak daha az heyecan verici hale getirir. Öte yandan, bu konu, sistemde daha fazla akışkanlık yaratmak için deneylerin nasıl değiştirilebileceğini araştırmak için fırsatlar sunmaktadır.
Bu bilimsel zorluklar, sistem hakkında yeni bilgilere izin verecek heyecan verici fırsatlar sunmaktadır. Mikrotübül taktoidlerini daha bipolar hale getirmek için, daha kısa mikrotübüller kullanılabilir. Bununla birlikte, mikrotübüllerin aktinin yaptığı gibi uzunluğu kontrol etmek için çok iyi karakterize edilmiş kapak proteinlerine sahip olmadıkları için ek bir zorluk vardır. Çekirdeklenme ve büyüme kullanımı, kısa mikrotübüller yapmak için çok yüksek konsantrasyonlarda tübülin ve GMPCPP kullanılmasını gerektirir. Yüksek tübülin konsantrasyonu, sistemde daha fazla sayıda filamentle sonuçlanır, bu da taktoidleri birbirinden ayırmayı zorlaştırır. DARPin33 gibi yeni mikrotübül kapasitörlerinin eklenmesi bu duruma yardımcı olabilir. Mikrotübüllerin hareketsiz olmasının ikinci sorunu, mitozda kullanılan motorların tetramerleri olan kinesin-534 gibi motor proteinlerinin eklenmesiyle hafifletilebilir. Alternatif olarak, dimerik kinezin-1’in yapay dimerleri kullanılabilir15.
Daha fazla akışkanlık eklemenin bir başka yolu, mikrotübüllerin dinamik kararsızlıklarını, mikrotübüllerin büyümesini ve küçülmesini gerçekleştirmelerine izin vermektir. Şu anda, kararlı GMPCPP filamentleri ile tohumlanan ve daha sonra dinamik kararsızlığa uğrayan mikrotübüller, bir iğ veya taktoid oluşturmak için istenenden çok daha uzundur, bu da fanlar veya demetler gibi çok uzun organizasyonlara neden olur. Bu nedenle, mikrotübül dinamik kararsızlığının eklenmesi, dokuntoid şeklini korumak için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Uzunluğu kontrol edebilen ilişkili proteinlerin ve enzimlerin eklenmesi bu sorunu hafifletebilir. Örneğin, kinezin-1335 gibi kinezinlerin depolimerize edilmesi veya katanin36 gibi enzimlerin kesilmesi muhtemelen gerekli olacaktır. Bu deneyler karmaşık ve zordur, ancak sonuçlar ne ortaya çıkarsa çıksın çok anlayışlı olacaktır. Gelecekteki deneyler hangi yöne giderse gitsin, mikrotübül taktoidleri oluşturmak için burada geliştirilen platform, mikrotübül organizasyonunun fiziksel temeli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, tüm yaz 2021 Ross Lab üyelerine, özellikle de K. Alice Lindsay’e yardımları için teşekkür eder. Bu çalışma, NSF BIO-2134215’ten S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee ve J.L. Ross’u destekleyen bir hibe ile desteklendi. KECK Vakfı’ndan (Rae Anderson, USD, kurşun PI) gelen bir hibe, R. Branch ve P. Chauhan’ı kısmen destekledi.
Materials
| 2% Dichlorodimethylsilane | GE Healthcare | 118945 | A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year. |
| 5-minute epoxy | Bob Smith Industries | For sealing experimental chambers | |
| Acetone | Fisher | 32900HPLC | 100% |
| BL21 cells | Bio Labs | C2527I | Competent bacterial cells used to express MAP65 |
| Catalase | Sigma | C30-500MG | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C for upto one year. |
| Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm) | Fisher | 12544-AP | For experimental chambers |
| Dithiothreitol | Sigma | 43815-5G | A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded. |
| EGTA | Sigma | E3889-10G | Tubulin buffer base ingredient |
| Eppendorf 0.5 ml tubes | Eppendorf | 05 402 18 | For holding experimental solutions |
| Ethanol | Fisher | 111000200 | 200 proof |
| Filter paper | Whatman | 1004-110 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers |
| Fluorescence microscope with high NA objectives | Nikon | Ti-E, W2 Confocal | For imaging experiments |
| Freezer -20°C | Fisherbrand | 13986148 | For storing reagents |
| Freezer -80°C | Thermo scientific | 328223H01-C | For storing proteins. |
| Glass containers for silanization | Michaels | For preparing experimental chambers – treating cover glasses | |
| Glass slides | Fisher | 12544-4 | For experimental chambers |
| Glucose | Sigma | G7528-250G | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C. |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-250KU | Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4°C for upto one year. |
| GMPCPP | Jenna Bioscience | NU-4055 | Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20°C for upto one year. |
| Heating element for microscope | Okolab stage top incubator | For imaging experiments | |
| Imidizole | Sigma | I2399 | Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65 |
| Kimwipes | Fisher | 34155 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers. |
| KOH | Sigma | P250-500 | 1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time. |
| Liquid Nitrogen | Airgas | NI 230LT22 | To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended) |
| MAP65 protein | Ram Dixit | A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 μM solution. This working solution is stored at 4°C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26). | |
| MgSO4 | Sigma | MKCJ940 | Tubulin buffer ingredient |
| NTA-Nickel beads | Qiagen | 30210 | Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins |
| Optomicroscan | Nikon | 405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest | |
| PEM80 | Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4°C for upto one year. | ||
| Permanent double-sided tape | 3M – Scotch | 34-8724-5691-7 | For experimental chambers |
| Petri dish | Fisher | FB0875713 | For humid chamber |
| PIPES | Sigma | P7643-100G | Tubulin buffer base ingredient |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443-250G | A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year. |
| Polyethylene Glycol | Affymetrix Inc | 19966 500 GM | A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4°C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it. |
| Positive displacement pipette | Eppendorf | For pipetting viscous liquids | |
| Racks for coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72240 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
| Refrigerator 4°C | Fisherbrand | For storing reagents | |
| Tubulin Labeled | Cytoskeleton | TL590M | lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
| Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
| UV-Ozone | Jelight | Model 342 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
| Stackreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
| Turboreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
References
- Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).
- Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. Oocyte meiotic spindle assembly and function. Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).
- Brugués, J., Needleman, D. Physical basis of spindle self-organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).
- Brugués, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles. Cell. 149 (3), 554-564 (2012).
- Gatlin, J. C., et al. Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules. Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).
- Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle. Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).
- Inoue, S., Sato, H. Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules. Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).
- Allenspach, A. L., Roth, L. E. Structural variations during mitosis in the chick embryo. Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).
- Theg, D. E. Cytoplasmic microtubules in different animal cells. Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).
- Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare. Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).
- Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. . Principles of Condensed Matter Physics. , (1995).
- Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastré, D. Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines. Biophysical Journal. 101 (1), 205 (2011).
- Needleman, D. J., et al. Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).
- Ross, J. L., Fygenson, D. K. Mobility of taxol in microtubule bundles. Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).
- Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. Cilia-like beating of active microtubule bundles. Science. 333 (6041), 456-459 (2011).
- Brandt, R., Lee, G. Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).
- Hirokawa, N. Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins. Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).
- Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173 (1989).
- MacRae, T. H. Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).
- She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly. Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).
- Walczak, C. E., Shaw, S. L. A MAP for Bundling Microtubules. Cell. 142 (3), 364-367 (2010).
- Edozie, B., et al. Self-organization of spindle-like microtubule structures. Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).
- Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling. Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).
- Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).
- Scheff, D. R., et al. Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments. Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).
- Weirich, K. L., et al. Liquid behavior of cross-linked actin bundles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).
- Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. Self-organizing motors divide active liquid droplets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).
- Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. Crowder and surface effects on self-organization of microtubules. Physical Review E. 103 (6), 062408 (2021).
- Stanhope, K. T., Ross, J. L. Microtubules, MAPs, and motor patterns. Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).
- Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg (2022)
- Lantzsch, I., et al. Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans. eLife. 10, 58903 (2021).
- Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60. Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).
- Pecqueur, L., et al. A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).
- Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
- Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP. Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).
- McNally, F. J., Vale, R. D. Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules. Cell. 75 (3), 419-429 (1993).
