Examen de l’effet des pesticides sur les neurones de Caenorhabditis elegans
Summary
Les nématodes Caenorhabditis elegans jeunes adultes sont exposés à différentes concentrations de pesticides commerciaux ou d’autres toxiques pendant 2 à 24 h. Ensuite, différents neurones peuvent être visualisés à l’aide de souches exprimant la fluorescence. Cet article montre comment exposer les nématodes aux pesticides et évaluer les dommages aux neurones.
Abstract
Caenorhabditis elegans est un puissant organisme modèle utilisé dans de nombreux laboratoires de recherche pour comprendre les conséquences de l’exposition aux polluants chimiques, aux pesticides et à une grande variété de substances toxiques. Ces nématodes sont faciles à utiliser et peuvent être utilisés pour générer de nouveaux résultats de recherche, même dans le laboratoire de biologie de premier cycle. Une série de laboratoires de plusieurs semaines de projets de recherche authentiques dirigés par des étudiants forme les étudiants à une boîte à outils de techniques et d’approches en mesures comportementales, en biologie cellulaire et en microscopie qu’ils appliquent ensuite à leurs projets. Une technique de cette boîte à outils consiste à quantifier le pourcentage de neurones présentant des dommages neurodégénératifs à la suite d’une exposition à un toxique chimique comme un pesticide. Les nématodes C. elegans jeunes adultes peuvent être exposés à différentes concentrations de pesticides disponibles dans le commerce ou d’autres types de toxiques pendant 2 à 24 h. Ensuite, les étudiants de premier cycle peuvent visualiser différents sous-types de neurones en utilisant des souches de C. elegans exprimant la fluorescence. Ces techniques ne nécessitent pas de logiciel de traitement d’image sophistiqué et sont efficaces même à faible grossissement, ce qui rend inutile le besoin d’une microscopie confocale coûteuse. Cet article montre comment traiter les nématodes avec des pesticides et comment imager et marquer les neurones. Il fournit également un protocole simple pour la microscopie et l’analyse de la morphologie des neurones. Les matériaux utilisés pour cette technique sont peu coûteux et facilement disponibles dans la plupart des départements de biologie de premier cycle. Cette technique peut être combinée avec des mesures comportementales telles que la locomotion, le ralentissement basal ou la ponte pour mener une série d’expériences potentiellement publiables et donner aux étudiants de premier cycle une expérience de recherche authentique à un coût très faible.
Introduction
Caenorhabditis elegans est un excellent organisme modèle pour la formation en laboratoire dans les cours de sciences biologiques pour les étudiants de niveau d’introduction et intermédiaire. Cette procédure de laboratoire peut être utilisée dans le cadre d’un module de plusieurs semaines qui explore divers effets des pesticides couramment utilisés sur le comportement de C. elegans et la biologie cellulaire. Les étudiants peuvent apprendre à concevoir et à réaliser des projets indépendants qui leur enseignent des compétences en analyse de données et en présentation. Cet article se concentre sur les protocoles d’exposition de C. elegans à des mélanges de pesticides, puis sur l’observation et l’analyse des effets sur la morphologie des neurones.
Les mélanges de pesticides chimiques pour pelouse sont largement utilisés à des fins résidentielles et agricoles et peuvent être achetés dans n’importe quel magasin de jardinage local. On s’inquiète de plus en plus de la sécurité de ces produits chimiques pour les humains et la faune 1,2,3. Les étudiants peuvent lire la littérature scientifique et choisir un pesticide pour l’évaluation expérimentale et, ce faisant, peuvent en apprendre davantage sur la biologie de base et la neurobiologie, ainsi que sur d’importantes compétences de laboratoire telles que la conception et l’analyse expérimentales, et des compétences générales en laboratoire telles que le pipetage et les dilutions en série, la microscopie disséquante, la microscopie fluorescente, la photographie numérique et la production de figures.
Les protocoles décrits dans cet article peuvent être autonomes dans un cours de niveau intermédiaire en biologie ou en neurosciences ou faire partie d’un module de plusieurs semaines qui pourrait également inclure des mesures de comportements régis par des groupes particuliers de neurones. Par exemple, décrit dans ce protocole est une évaluation de la morphologie des neurones cholinergiques qui régissent la locomotion à l’aide d’une souche de nématode qui exprime la GFP (LX 929) dans les neurones cholinergiques4. Ces souches peuvent être obtenues à des prix très bas auprès du Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). Les souches exprimant la GFP dans les neurones dopaminergiques (OH 7457), les neurones cholinergiques (LX 929) ou mCherry exprimées dans tous les neurones (PVX4) sont toutes de bons choix. Les élèves ont également pu mesurer la locomotion et obtenir des données pour accompagner l’évaluation de la morphologie. Une description complète d’un projet de groupe d’étudiants de plusieurs semaines peut être trouvée dans Susman5.
Ce projet de groupe d’étudiants est assez peu coûteux et facile à mettre en place pour des groupes de quatre étudiants. Les matériaux nécessaires comprennent un microscope à dissection, l’accès à un microscope composé à fluorescence pouvant avoir un appareil photo numérique attaché, des plaques de Petri et l’accès à une gélose de croissance des nématodes, des bactéries à croissance limitée (souche OP50, de la CGC), un brûleur Bunsen à flamme gazeuse ou une lampe à alcool, un autoclave, un fil de platine et des fournitures de laboratoire générales comme des micropipetters, des lames de microscope, couvercles et pipettes Pasteur en verre. Selon le toxique chimique examiné par les groupes d’étudiants, les étapes du protocole peuvent devoir se dérouler sous une hotte ou avec des gants. Ce protocole utilise des mélanges chimiques solubles dans l’eau (non volatils) et toutes les procédures de manipulation sécuritaire recommandées par le fabricant sont suivies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles décrits dans ce manuscrit fonctionnent avec succès seuls ou dans le cadre d’un projet de groupe d’étudiants indépendant de plusieurs semaines. Les protocoles se prêtent également à des expériences exploratoires autonomes d’une semaine. Les souches de nématodes sont bon marché et faciles à entretenir dans le laboratoire de recherche. Les élèves peuvent facilement apprendre à cueillir les vers avec un pic à vers ou à les déplacer en rinçant les plaques avec de l’eau et en leur perme…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail décrit dans ce manuscrit a été réalisé pour une classe de niveau intermédiaire en neurosciences. Les fonds pour les réactifs et les fournitures ont été fournis par le département de biologie du Vassar College. Les microscopes et le système d’imagerie numérique ont également été fournis par le département de biologie du Vassar College. L’auteur remercie tous les nombreux étudiants qui ont suivi ce cours.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
References
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