Infecção viral experimental em mosquitos adultos por alimentação oral e microinjeção
Summary
Essa metodologia, que incluiu alimentação por via oral e infecção por injeção intratorácica, foi capaz de avaliar efetivamente a influência das barreiras do intestino médio e/ou glândulas salivares na infecção por arbovírus.
Abstract
Os vírus transmitidos por mosquitos (MBVs), que são patógenos infecciosos para vertebrados, são transmitidos por muitas espécies de mosquitos, representando uma grave ameaça à saúde pública. Uma vez ingeridos, os vírus devem ultrapassar a barreira do intestino médio do mosquito para chegar à hemolinfa, de onde podem potencialmente se espalhar para as glândulas salivares. Quando um mosquito pica, esses vírus são espalhados para novos hospedeiros vertebrados. Da mesma forma, o mosquito pode pegar vírus diferentes. Em geral, apenas uma pequena porção de vírus pode entrar nas glândulas salivares através do intestino. A eficiência de transmissão desses vírus para as glândulas é afetada pelas duas barreiras físicas encontradas em diferentes espécies de mosquitos: as barreiras do intestino médio e as barreiras das glândulas salivares. Este protocolo apresenta um método para detecção de vírus em glândulas salivares de Aedes aegypti após alimentação oral e infecção por injeção intratorácica. Além disso, determinar se o intestino e/ou as glândulas salivares impedem a disseminação viral pode auxiliar na avaliação de risco de MBVs transmitidos pelo Aedes aegypti.
Introduction
Os vírus transmitidos por mosquitos (MBVs), um grupo heterogêneo de vírus de RNA, podem persistir em mosquitos vetores e subsequentemente se espalhar para hospedeiros vertebrados1. Os MBVs clinicamente importantes estão distribuídos majoritariamente em quatro famílias de vírus: Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae e Peribunyavividae 2,3. Nas últimas décadas, esses vírus têm sido relatados em todo o mundo, causando problemas de saúde pública. Como um dos MBVs mais conhecidos, o vírus da dengue (DENV) tornou-se o arbovírus emergente ou reemergente mais prevalente em mais de 100 países durante os últimos 20 anos4. Desde a descoberta do vírus Zika (ZIKV) no interior, quase todos os países e territórios tropicais e subtropicais do continente relataram infecções humanas pelo VZIK5. Com o objetivo de avaliar o risco de transmissão do vírus, inúmeros estudos nos últimos anos têm focado na competência do mosquito vetor para esses vírus 6,7. Como resultado, é fundamental prevenir e controlar eficazmente as doenças transmitidas por vetores.
O Aedes aegypti (Ae. aegypti), um dos mosquitos mais facilmente criados em laboratório, é um importante vetor do DENV, ZIKV, Chikungunya virus (CHIKV) e vírus da febre amarela (YFV)8. Durante muito tempo, o Aedes aegypti foi encontrado apenas no continente africano e no sudeste asiático, mas nos últimos anos colonizou quase todos oscontinentes9. Além disso, a abundância global de Aedes aegypti vem crescendo continuamente, com um aumento estimado de 20% até o final do século10. De 2004 a 2009, na China, foi evidente o aumento da competência do vetor Aedes aegypti para o DENV devido às temperaturas mais elevadas no dia-a-dia11. O status do Aedes aegypti como vetor patogênico aumentou significativamente na China. Consequentemente, para enfrentar esses desafios, é necessário investigar a competência vetorial do Aedes aegypti para transmitir vírus.
Como um artrópode hematófago, a fêmea do mosquito perfura a pele de um hospedeiro vertebrado e se alimenta do sangue. Os mosquitos ocasionalmente adquirem vírus de hospedeiros infectados por vírus e, em seguida, transferem os vírus para um novo hospedeiro. Assim, para determinar a competência vetorial, os mosquitos são alimentados com uma farinha de sangue artificial contendo arboviroses por meio de um sistema de alimentação em ambiente de laboratório12. Os mosquitos individuais são separados em cabeças, corpos e secreções de saliva vários dias após a infecção. Para medir a infecção, disseminação e taxas de transmissão do vírus, os títulos virais foram detectados por PCR quantitativo de transcrição reversa (qRT-PCR) ou ensaio de placa. No entanto, nem todos os mosquitos desenvolvem infecções do intestino médio e a capacidade de transferir um vírus para o próximo hospedeiro após a alimentação sanguínea. Está ligada às barreiras fisiológicas dos mosquitos, que impedem a penetração de patógenos no organismo e desempenham papel vital em sua imunidade inata13. As barreiras do intestino médio, particularmente a barreira de infecção do intestino médio (MIB) e a barreira de escape do intestino médio (MEB), influenciam se o vírus poderia infectar o vetor sistemicamente e a eficiência com que ele se espalha. Dificulta a análise da infecção de outros tecidos, como as glândulas salivares, que também apresentam infecção das glândulas salivares e barreiras de escape13,14. Para melhor caracterizar a infecção do intestino médio e glândulas salivares no vetor, um protocolo detalhado para alimentação oral e inoculação intratorácica de arbovírus em Aedes aegypti é apresentado. Este protocolo pode ser aplicado a arboviroses adicionais em uma variedade de mosquitos vetores, como a infecção por DENV e ZIKV em Aedes spp., e pode ser um procedimento praticável.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo deste método foi fornecer uma avaliação de risco abrangente de um vírus transmitido por mosquitos, avaliando a competência do vetor por meio de alimentação oral e inoculação intratorácica.
No experimento de alimentação oral, os mosquitos ingurgitados precisam ser colhidos e transferidos para um novo recipiente, representando um sério risco para os operadores. Isso porque qualquer mosquito, inclusive mosquitos não infectados, pode ser fonte de infecção<sup class="xref…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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