경구 수유 및 미세 주입에 의한 성인 모기의 실험적 바이러스 감염
Summary
경구 수유 및 흉강내 주사 감염을 포함하는 이 방법론은 아르보 바이러스 감염에 대한 중장 및/또는 침샘 장벽의 영향을 효과적으로 평가할 수 있습니다.
Abstract
척추동물에 대한 감염성 병원체인 모기 매개 바이러스(MBV)는 많은 모기 종에 의해 전파되어 공중 보건에 심각한 위협이 됩니다. 일단 섭취되면 바이러스는 모기 중장 장벽을 극복하여 체액림프에 도달해야 하며, 그곳에서 잠재적으로 침샘으로 퍼질 수 있습니다. 모기에 물리면 이 바이러스는 새로운 척추동물 숙주에게 퍼집니다. 마찬가지로 모기는 다른 바이러스를 집어 올릴 수 있습니다. 일반적으로 바이러스의 아주 작은 부분만이 장을 통해 침샘으로 들어갈 수 있습니다. 땀샘으로의 이러한 바이러스의 전염 효율은 다른 모기 종에서 발견되는 두 가지 물리적 장벽, 즉 중장 장벽과 침샘 장벽의 영향을 받습니다. 이 프로토콜은 이집트숲모기의 경구 수유 및 흉강내 주사 감염 후 타액선에서 바이러스 검출 방법을 제시합니다. 또한, 내장 및/또는 침샘이 바이러스 확산을 방해하는지 여부를 결정하면 이집트숲모기에 의해 전염되는 MBV의 위험 평가에 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
모기 매개 바이러스(Mosquito-borne virus, MBVs)는 이질적인 RNA 바이러스 그룹으로, 모기 매개체에서 잔류하다가 척추동물 숙주로 퍼질 수 있다1. 임상적으로 중요한 MBV는 주로 Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae 및 Peribunyavividae 2,3의 4가지 바이러스 계열에 분포합니다. 최근 수십 년 동안 이러한 바이러스는 전 세계적으로 보고되어 공중 보건 문제를 일으켰습니다. 가장 잘 알려진 MBV 중 하나인 뎅기열 바이러스(DENV)는 지난 20년 동안 100개 이상의 국가에서 가장 널리 퍼진 신종 또는 재출현 아르보 바이러스가 되었습니다4. 내륙에서 지카 바이러스(Zika virus, ZIKV)가 발견된 이후, 아프리카 대륙의 거의 모든 열대 및 아열대 국가와 영토에서 인간 ZIKV 감염이 보고되었다5. 바이러스 전파 위험을 평가하기 위해 최근 몇 년 동안 많은 연구가 이러한 바이러스에 대한 모기 벡터 능력에 초점을 맞추었습니다 6,7. 따라서 매개체 매개 질병을 효과적으로 예방하고 통제하는 것이 중요합니다.
이집트숲모기(Ae. aegypti)는 실험실에서 가장 쉽게 사육되는 모기 중 하나로, DENV, ZIKV, 치쿤구니야 바이러스(CHIKV) 및 황열병 바이러스(YFV)의 중요한 매개체입니다8. 오랫동안 Ae. aegypti는 아프리카 대륙과 동남아시아에서만 발견되었지만 최근 몇 년 동안 거의 모든 대륙을 식민지화했습니다9. 또한, Ae. 이집트는 지속적으로 성장하고 있으며, 10 세기 말까지20 % 증가 할 것으로 예상됩니다. 2004년부터 2009년까지 중국에서는 Ae가 뚜렷하게 증가했습니다. 더 높은 일일 온도로 인한 DENV에 대한 이집트 벡터 역량11. 병원성 매개체로서의 이집트의 지위는 중국에서 크게 상승했다. 따라서 이러한 문제를 해결하기 위해서는 Ae의 벡터 능력을 조사할 필요가 있습니다. 이집트는 바이러스를 전염시킵니다.
haematophagous 절지 동물로서, 암컷 모기는 척추 동물 숙주의 피부를 관통하고 혈액을 먹습니다. 모기는 때때로 바이러스에 감염된 숙주로부터 바이러스를 얻은 다음 바이러스를 새로운 숙주로 옮깁니다. 이와 같이, 벡터 능력을 결정하기 위해, 모기는 실험실 설정12에서 공급 시스템을 통해 아르보 바이러스를 함유하는 인공 혈액 식사를 공급받는다. 개별 모기는 감염 후 며칠 후에 머리, 몸통, 타액 분비물로 분리됩니다. 바이러스 감염, 전파 및 전파 속도를 측정하기 위해 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR) 또는 플라크 분석을 통해 바이러스 역가를 검출했습니다. 그러나 모든 모기가 중장 감염을 일으키는 것은 아니며 혈액 공급 후 다음 숙주에게 바이러스를 옮길 수 있는 능력이 있습니다. 이는 모기의 생리적 장벽과 관련이 있어 병원체가 체내로 침투하는 것을 방지하고 모기의 선천성 면역에 중요한 역할을 한다13. 중장 장벽, 특히 중장 감염 장벽(MIB) 및 중장 탈출 장벽(MEB)은 바이러스가 벡터를 전신적으로 감염시킬 수 있는지 여부와 확산 효율성에 영향을 미칩니다. 그것은 또한 침샘 감염을 나타내고 장벽을 탈출하는 타액선과 같은 다른 조직의 감염 분석을 방해합니다13,14. 벡터에서 중장 및 침샘의 감염을 더 잘 특성화하기 위해, Ae에서 아르보바이러스의 경구 수유 및 흉강내 접종을 위한 상세한 프로토콜. 이집트가 본원에 제시되어 있다. 이 프로토콜은 Aedes spp.의 DENV 및 ZIKV 감염과 같은 다양한 모기 매개체의 추가 아르보 바이러스 감염에 적용될 수 있으며 실행 가능한 절차로 판명될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법의 목표는 경구 수유 및 흉부 내 접종을 통해 벡터 능력을 평가하여 모기 매개 바이러스에 대한 포괄적인 위험 평가를 제공하는 것이었습니다.
구강 수유 실험에서 충혈 된 모기를 골라내어 새 용기로 옮겨야하므로 작업자에게 심각한 위험을 초래할 수 있습니다. 그 이유는 감염되지 않은 모기를 포함한 모든 모기가 감염원이 될 수 있기 때문이다19. ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 우한 과학 기술 계획 프로젝트 (2018201261638501)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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