זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה
Summary
מתודולוגיה זו, שכללה הזנה דרך הפה וזיהום בהזרקה תוך חזה, יכולה להעריך ביעילות את ההשפעה של מחסומי המעי התיכון ו / או בלוטת הרוק על זיהום arbovirus.
Abstract
וירוסים המועברים על ידי יתושים (MBVs), שהם פתוגנים מדבקים לבעלי חוליות, מופצים על ידי מיני יתושים רבים, ומהווים איום חמור על בריאות הציבור. לאחר בליעתם, הנגיפים חייבים להתגבר על מחסום היתושים באמצע המעי כדי להגיע להמולימפה, משם הם עלולים להתפשט לבלוטות הרוק. כאשר יתוש עוקץ, וירוסים אלה מופצים לפונדקאים חדשים בעלי חוליות. באופן דומה, היתוש עלול לקלוט וירוסים שונים. באופן כללי, רק חלק זעיר מהווירוסים עשוי להיכנס לבלוטות הרוק דרך המעיים. יעילות ההעברה של נגיפים אלה לבלוטות מושפעת משני מחסומים פיזיים הנמצאים בזני יתושים שונים: מחסומי אמצע המעי ומחסומי בלוטות הרוק. פרוטוקול זה מציג שיטה לזיהוי וירוסים בבלוטות הרוק של Aedes aegypti לאחר הזנה דרך הפה וזיהום בהזרקה תוך חזה. יתר על כן, קביעה אם המעיים ו / או בלוטות הרוק מעכבים את התפשטות הנגיפים יכולה לסייע בהערכות הסיכון של MBV המועברים על ידי Aedes aegypti.
Introduction
וירוסים המועברים על ידי יתושים (MBVs), קבוצה הטרוגנית של נגיפי RNA, יכולים להישאר בווקטורים של יתושים ולאחר מכן להתפשט לפונדקאים בעלי חוליות1. MBVs החשובים מבחינה קלינית מופצים בעיקר בארבע משפחות וירוסים, כלומר Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae ו– Peribunyavividae 2,3. בעשורים האחרונים, וירוסים אלה דווחו בכל רחבי העולם, וגרמו לבעיות בריאות הציבור. כאחד ה- MBV הידועים ביותר, נגיף דנגי (DENV) הפך לנגיף הארבו המתעורר או המתעורר מחדש הנפוץ ביותר ביותר מ -100 מדינות במהלך 20 השנים האחרונות4. מאז גילוי נגיף הזיקה (ZIKV) בפנים הארץ, כמעט כל המדינות והטריטוריות הטרופיות והסובטרופיות ביבשת דיווחו על זיהומי ZIKV אנושיים5. על מנת להעריך את הסיכון להעברת הנגיף, מחקרים רבים בשנים האחרונות התמקדו בכשירות וקטור יתושים לנגיפים אלה 6,7. כתוצאה מכך, חיוני למנוע ולשלוט ביעילות במחלות המועברות על ידי וקטורים.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), אחד היתושים הקלים ביותר לגידול במעבדה, הוא וקטור חשוב של DENV, ZIKV, וירוס Chikungunya (CHIKV) ווירוס קדחת צהובה (YFV)8. במשך זמן רב, Ae. aegypti נמצא אך ורק ביבשת אפריקה ובדרום מזרח אסיה, אך בשנים האחרונות הוא התיישב כמעט בכל היבשות9. יתר על כן, השפע העולמי של Ae. aegypti גדל בהתמדה, עם גידול מוערך של 20% עד סוף המאה10. משנת 2004 עד 2009 בסין, חלה עלייה ניכרת ביכולת הווקטור Ae. aegypti עבור DENV עקב טמפרטורות יומיומיות גבוהות יותר11. מעמדו של Ae. aegypti כווקטור הפתוגני עלה משמעותית בסין. כתוצאה מכך, כדי להתמודד עם אתגרים אלה, יש צורך לחקור את היכולת הווקטורית של Ae. aegypti להעביר וירוסים.
כפרוק רגליים המטופגי, נקבת היתוש מנקבת את עורו של פונדקאי בעל חוליות וניזונה מהדם. יתושים אכן רוכשים מדי פעם וירוסים מפונדקאים נגועים בנגיף ואז מעבירים את הנגיפים לפונדקאי חדש. לכן, כדי לקבוע כשירות וקטורית, יתושים מוזנים בקמח דם מלאכותי המכיל ארבו-וירוסים באמצעות מערכת הזנה בסביבת מעבדה12. יתושים בודדים מופרדים לראשים, לגוף ולהפרשות רוק מספר ימים לאחר ההדבקה. כדי למדוד את שיעורי ההדבקה, ההפצה וההעברה של הנגיף, טיטרים של וירוסים זוהו על ידי PCR כמותי של שעתוק לאחור (qRT-PCR) או בדיקת פלאק. עם זאת, לא כל היתושים מפתחים זיהומים באמצע המעי ואת היכולת להעביר וירוס לפונדקאי הבא לאחר הזנת הדם. היא קשורה למחסומים הפיזיולוגיים של היתושים, המונעים מפתוגנים לחדור לגוף וממלאים תפקיד חיוני בחסינות המולדת שלהם13. מחסומי אמצע המעי, במיוחד מחסום הזיהום של המעי התיכון (MIB) ומחסום המילוט של המעי התיכון (MEB), משפיעים על היכולת של הנגיף להדביק את הווקטור באופן מערכתי ועל היעילות שבה הוא מתפשט. זה חוסם את הניתוח של זיהום של רקמות אחרות, כגון בלוטות רוק אשר גם להציג זיהום בלוטת הרוק לברוח מחסומים13,14. כדי לאפיין טוב יותר את הזיהום של המעי התיכון ובלוטות הרוק בווקטור, פרוטוקול מפורט להאכלה אוראלית וחיסון תוך חזה של arbovirus ב Ae. aegypti מוצג כאן. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם על זיהומים נוספים arbovirus במגוון רחב של וקטורים יתושים, כגון זיהום DENV ו ZIKV ב Aedes spp., והוא יכול להוכיח להיות הליך מעשי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטרת שיטה זו הייתה לספק הערכת סיכונים מקיפה של נגיף אחד המועבר על ידי יתושים על ידי הערכת יכולת וקטורית באמצעות הזנה אוראלית וחיסון תוך חזי.
בניסוי האכלה דרך הפה, יש לקטוף יתושים חרוטים ולהעבירם למיכל חדש, דבר המהווה סיכון חמור למפעילים. הסיבה לכך היא שכל יתוש, כולל יתושים לא…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של ווהאן (2018201261638501).
Materials
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al. Mosquito Innate Immunity. Insects. 9 (3), (2018).
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection–a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
