用于检测人类精子功能缺陷的生物标志物的流式细胞术分析
Summary
本方案提供了一种实用的解决方案，允许使用单个细胞仪测量人类精子中的细胞凋亡、线粒体膜电位和DNA损伤。
Abstract
传统的精液参数分析被广泛用于评估男性生育能力。然而，研究发现，~15% 的不孕症患者在常规精液参数中没有异常。需要更多的技术来解释特发性不孕症和检测细微的精子缺陷。目前，精子功能的生物标志物，包括精子凋亡、线粒体膜电位（MMP）和DNA损伤，在分子水平上揭示了精子生理学，并能够预测男性的生育能力。
使用流式细胞术 （FCM） 技术，可以在人类精液样本中快速、准确、精确地测量这些标志物中的每一个，但如果所有生物标志物都需要使用单个细胞仪进行检测，时间成本会大大增加，并且结果可能会受到阻碍。在该方案中，在收集并立即在37°C下孵育液化后，使用膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸酯（FITC）/碘化丙啶（PI）染色进一步分析精液样品的精子凋亡。用5,5’，6,6′-四氯-1,1’，3,3′-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（JC-1）探针标记MMP，采用精子染色质结构测定（SCSA）和吖啶橙（AO）染色评估DNA损伤。因此，精子功能标志物的流式细胞术分析可以成为诊断不孕症和评估精子功能的实用可靠的工具包。
Introduction
不育症已成为一个公共卫生问题，男性不育症占所有病例的 40%-50% 1,2。尽管传统的精液质量分析在确定男性生育潜力方面起着重要作用，但大约 15% 的不育症患者具有正常的精子参数，例如精子数量、活力和形态学3。此外，常规精子检查的重复性差，提供的精子功能信息有限，不能准确评估男性生育能力或反映精子的细微缺陷。已经开发了多种技术来测试精子功能，例如半氮化试验（HZA）、精子渗透试验、低渗透膨胀试验、抗精子抗体试验，但这些方法耗时且容易受到操作者的主观影响。因此，有必要开发快速准确的精子功能分析方法。
FCM是1970年代发展起来的一种快速单细胞分析技术，已广泛应用于细胞生物学和医学的各个领域。FCM 是一种用于评估精子功能的强大工具，可分析用特定荧光探针标记的精子4。精子通过单通道或多通道激光，激光束产生散射光和发出的荧光。散射光包括前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），它们反映了被测细胞的大小和细胞粒度或内部结构。这些信号由计算机系统收集、显示和分析，从而快速准确地测量精子的一系列特征。因此，FCM是一种快速、客观、多维、高通量的技术，在精子分析领域越来越受到关注。FCM的应用可以弥补传统方法的不足，为精子内部结构和功能的检测提供了新的途径。
精子凋亡与男性生育能力密切相关5.精子凋亡的检测是在分子水平上评价精子功能的重要指标。FCM 被广泛认为是使用 Annexin V-FITC/PI 染色检测精子凋亡的可靠且灵敏的方法。其基本原理是磷脂酰丝氨酸（PS）在细胞凋亡早期从细胞膜的内层转移到其外层。膜联蛋白 V 是一种 Ca2+ 依赖性磷脂蛋白（通常由 FITC 标记），对 PS 具有高亲和力，因此可检测暴露于细胞膜外表面的 PS6。坏死和细胞凋亡可以结合 Pl 染色来区分。因此，膜联蛋白V-FITC/PI双染色方法被广泛使用，因为它快速、简单、易于检测不同的凋亡精子细胞。
成熟的哺乳动物精子含有大约 72-80 个线粒体7，这表明精子线粒体保留的生物学原因8.已发现精子线粒体在维持精子活力和生育能力方面发挥重要作用9.JC-1 染色剂可用作多种细胞类型中 MMP 的指示剂，是用于精子线粒体活性评估的最常用荧光染料之一10。JC-1 是一种阳离子染料，在线粒体中电位依赖性地积累。JC-1 在 525 nm（绿色）处具有最大荧光发射，当与具有高电位 （ΔΨm， 80-100 mV） 的膜结合时形成 J-聚集体11，导致荧光发射偏移至 ~590 nm（橙红色）。因此，精子线粒体去极化由红/绿荧光强度比的降低指示，FCM可用于检测人类精液样本中的MMP水平。
SCSA 方法由 Evenson 等人发明12，被认为是一种精确且可重复的测试，在 1,024 × 1,024 通道尺度上具有独特的双参数数据（红色与绿色荧光）13。在受损精子中，DNA和精子核中改变的蛋白质通过AO标记，DNA链的断裂通过红色荧光测量，而完整的双链在FCM14中发出绿色荧光。如今，已经开发了许多方法来估计精子DNA的完整性。然而，与SCSA不同的是，这些检测通常是劳动密集型的，并且缺乏诊断男性不育症的能力。SCSA 检测结果与人类 DNA 妊娠和流产显着相关，提供了令人信服的证据，证明 SCSA 可能可用于人类精液分析，并可能作为不孕症临床医生的宝贵工具15.
染色质完整性、MMP 和细胞凋亡反映了精子功能的不同方面，因此，这些生物标志物的组合可以更全面地了解精子状态。FCM 可用于单独测量人类精液样本中的染色质完整性、MMP 或细胞凋亡。尽管FCM的费用和染料的成本限制了这些技术在生殖健康临床实验室中的广泛应用，但它们在生育能力估计方面的价值正在被接受。
然而，由于每个实验都需要对精子样本进行预处理，并且所有预处理的样本都需要尽快进行测试，因此使用单个FCM同时测量样本的所有三种生物标志物可能会导致某些实验的等待时间过长，并阻碍结果的可靠性。这是因为在等待过程中，如果方案没有正确安排，将所有三个实验完全考虑在内，精子会受到额外的损害。本文提出了一种方案，该方案可在单次流式细胞术中实现所有三种生物标志物的流畅测量，而不会因等待时间过长而导致实验质量的实质性影响。
Protocol
Representative Results
Discussion
染色质完整性、MMP 和人类精子凋亡已被发现是生殖结果的重要预测因子。世卫组织最新发布的人类精液检查和处理实验室手册（第六版）也强调了其中一些指标（染色质完整性和细胞凋亡）作为超出精子计数等常规参数基本检查的扩展检查18。最近的出版物还表明，这些指标可能是对外部危险暴露反应的更敏感的标志，表明它们有可能在早期阶段识别生殖损伤19,20。将这些指标与常规检查相结合，还可以更全面地了解精子功能障碍的特征和人群中男性生殖损伤的复杂性。
有几个关键问题在很大程度上决定了使用FCM进行精子分析的成功。首先，精子MMP和细胞凋亡的测量需要在精液液化后立即进行检查。为了最大限度地降低时间成本，两名技术人员可以分别负责MMP的预处理和样品的凋亡分析。由于细胞凋亡的预处理更简单，因此它比MMP分析更快地转移到流式细胞术步骤。对于 SCSA 分析，新鲜精液样本应在液化后立即冷冻保存。然后，精子样本可以在液氮中储存相对较长的时间，不需要立即检查。
因此，实验的现场时间成本可以压缩到40分钟，这是MMP分析的持续时间加上精子分析的流式细胞术步骤。其次，必须分别决定每批样品在流式细胞术平台中的设门设置。可以选择散点图中具有透明细胞亚群的精子样本作为参考来绘制门控区域。第三，由于该实验的指标没有被广泛接受的临床参考值，因此历史结果可以作为质量控制的重要工具。还鼓励在每批测量中设置阳性和阴性对照，特别是对于 SCSA 和 MMP。
这里提供的精子分析的代表性结果是使用Accuri C6得出的。但是，该技术只需稍作修改即可应用于其他商业平台。通常，总共需要 5 × 106 个精子细胞才能满足所有指标的测量要求。如果样本的精子浓度远低于平均水平，则对精液量的需求就会增加。
与常规精子参数类似，人类精子的染色质完整性、MMP 和凋亡也存在明显的个体内差异21。因此，对不同时间收集的样本进行多次测试可以更准确地估计精子功能损伤水平。虽然在进行流式细胞术分析的精子取样前没有建议的禁欲期，但可以采用世卫组织建议的常规精子分析的2-7天射精禁欲。它可能有助于提高实验室之间以及从同一男性收集的不同样本之间结果的可比性。
这种方法的一个主要局限性是，三种测试的生物标志物中的两种——细胞凋亡和线粒体膜电位——需要新鲜的精液样本。这可能会限制它们的应用范围，仅限于可以向实验室提供精液样本的男性。对于DNA损伤（SCSA）的测试，应在实验前准备参考样品以校准流式细胞仪。值得注意的是，本方案的应用需要在实验室中使用FCM仪器，这对许多临床实验室来说仍然是一个相当大的挑战，尽管在某些地区与第三方服务合作可能是另一种选择。
此外，染料和其他试剂的费用对于可能需要检查的男性来说也是一个经济因素。最后，如果使用不同品牌或版本的 FCM 来检查生物标志物，则可能需要修改协议。总之，本文提出了一种实用的方法，通过单台流式细胞术机器估计人类精子损伤的三种生物标志物。这可以提供有关男性生殖健康的宝贵信息，并补充常规精子检查。
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢所有现场工作人员的帮助和受访者的合作。
Materials
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
- Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
- Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
- Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
- Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
- Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
- Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
- Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666 (2021).
- Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
- Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
- Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
- Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
- Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA®). Methods in Molecular Biology. 927, 147-164 (2013).
- Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
- Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
- Zhang, H. -. B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
- . WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022)
- Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
- Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
- Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).
