Проточный цитометрический анализ биомаркеров для выявления функциональных дефектов сперматозоидов человека
Summary
Настоящий протокол представляет собой практическое решение, позволяющее измерять апоптоз, мембранный потенциал митохондрий и повреждение ДНК в сперматозоидах человека с помощью одного цитометра.
Abstract
Для оценки мужской фертильности широко используется традиционный анализ параметров спермы. Тем не менее, исследования показали, что ~15% бесплодных пациенток не обнаруживают никаких аномалий в обычных параметрах спермы. Для объяснения идиопатического бесплодия и выявления малозаметных дефектов сперматозоидов необходимы дополнительные технологии. В настоящее время биомаркеры функции сперматозоидов, включая апоптоз сперматозоидов, мембранный потенциал митохондрий (ММП) и повреждение ДНК, выявляют физиологию сперматозоидов на молекулярном уровне и способны предсказывать мужскую фертильность.
С помощью методов проточной цитометрии (FCM) каждый из этих маркеров можно быстро, точно и точно измерить в образцах спермы человека, но временные затраты значительно увеличиваются, и результаты могут быть затруднены, если все биомаркеры необходимо тестировать с помощью одного цитометра. В этом протоколе после сбора и немедленной инкубации при 37 °C для разжижения образцы спермы были дополнительно проанализированы на апоптоз сперматозоидов с использованием окрашивания аннексина V-флуоресцеина изотиоцианата (FITC)/йодида пропидия (PI). ММП был мечен 5,5′,6,6′-тетрахлор-1,1′,3,3′-тетраэтил-бензимидазолилкарбоцианинойодидом (JC-1), а повреждение ДНК оценивали с помощью анализа структуры хроматина сперматозоидов (SCSA) с окрашиванием акридиновым оранжевым (АО). Таким образом, проточный цитометрический анализ маркеров функции сперматозоидов может быть практичным и надежным инструментарием для диагностики бесплодия и оценки функции сперматозоидов как на лабораторном, так и на постельном уровне.
Introduction
Бесплодие стало проблемой общественного здравоохранения, причем мужское бесплодие составляет 40%-50% всех случаев 1,2. Несмотря на то, что традиционный анализ качества спермы играет важную роль в определении мужской фертильности, примерно 15% пациентов с бесплодием имеют нормальные параметры спермы, такие как количество, подвижность иморфология сперматозоидов. Кроме того, рутинные обследования сперматозоидов имеют плохую повторяемость, предоставляют ограниченную информацию о функции сперматозоидов и не могут дать точную оценку мужской фертильности или отразить тонкие дефекты сперматозоидов. Для проверки функции сперматозоидов было разработано множество методов, таких как анализ гемизоны (HZA), анализ проникновения сперматозоидов, тест на гипоосмотическое набухание, тест на антиспермальные антитела, но эти методы отнимают много времени и уязвимы для субъективного влияния операторов. Поэтому необходимо разработать быстрые и точные методы анализа функции сперматозоидов.
FCM — это технология быстрого анализа отдельных клеток, разработанная в 1970-х годах, которая широко используется в различных областях клеточной биологии и медицины. FCM – это надежный инструмент для оценки функции сперматозоидов, который анализирует сперматозоиды, помеченные специальным флуоресцентным зондом4. Сперматозоиды проходят через одно- или многоканальные лазеры, а рассеянный свет и излучаемая флуоресценция производятся лазерным лучом. Рассеянный свет включает в себя прямой рассеянный свет (FSC) и боковой рассеянный свет (SSC), который отражает размер испытуемой ячейки и зернистость или внутреннюю структуру ячейки. Эти сигналы собираются, отображаются и анализируются компьютерной системой, и, следовательно, ряд характеристик сперматозоидов измеряется быстро и точно. Таким образом, FCM является быстрым, объективным, многомерным и высокопроизводительным методом, который привлекает все большее внимание в области анализа спермы. Применение FCM может восполнить недостатки традиционных методов и обеспечивает новый подход к определению внутренней структуры и функции сперматозоидов.
Апоптоз сперматозоидов тесно связан с мужской фертильностью5. Обнаружение апоптоза сперматозоидов является важным показателем для оценки функции сперматозоидов на молекулярном уровне. FCM широко известна как надежный и чувствительный метод обнаружения апоптоза сперматозоидов с помощью окрашивания Annexin V-FITC/PI. Основной принцип заключается в том, что фосфатидилсерин (ФС) переносится из внутреннего слоя клеточной мембраны в ее наружный слой на ранней стадии апоптоза. Аннексин V представляет собой Ca2+-зависимый фосфолипидный белок (обычно меченый FITC), который обладает высоким сродством к ФС, таким образом, обнаруживает ФС при контакте с внешней поверхностью клеточной мембраны6. Некроз и апоптоз можно выделить в сочетании с окрашиванием Pl. Поэтому широко используется метод двойного окрашивания Annexin V-FITC/PI, так как он быстро, прост и легко обнаруживает различные апоптотические сперматозоиды.
Зрелые сперматозоиды млекопитающих содержат примерно 72-80 митохондрий7, что указывает на биологическую причину сохранения митохондрий сперматозоидов8. Было обнаружено, что митохондрии сперматозоидов играют важную роль в поддержании подвижности и фертильности сперматозоидов9. Краситель JC-1, который может быть использован в качестве индикатора ММР в различных типах клеток, является одним из наиболее популярных флуорохромов для оценки митохондриальной активности сперматозоидов10. JC-1 представляет собой катионный краситель, который потенциально накапливается в митохондриях. JC-1 имеет максимальное флуоресцентное излучение на длине волны 525 нм (зеленый) и образует J-агрегаты 11 при связывании с мембранами с высоким потенциалом (ΔΨm, 80-100 мВ), что приводит к сдвигу флуоресцентного излучения до ~590 нм (оранжево-красный). Следовательно, на митохондриальную деполяризацию сперматозоидов указывает снижение соотношения интенсивности красной/зеленой флуоресценции, и FCM может быть использована для определения уровней MMP в образцах спермы человека.
Методология SCSA была изобретена Evenson et al.12 и считается точным и воспроизводимым тестом с уникальными данными о двух параметрах (красная и зеленая флуоресценция) на шкале 1024 × 1024 каналов 13. В поврежденных сперматозоидах ДНК и измененные белки в ядрах сперматозоидов мечутся АО, а разрывы цепи ДНК измеряются красной флуоресценцией, в то время как неповрежденные двойные нити излучают зеленую флуоресценцию в FCM14. В настоящее время разработано множество методов оценки целостности ДНК сперматозоидов. Однако, в отличие от SCSA, эти анализы часто являются трудоемкими и не позволяют диагностировать мужское бесплодие. Результаты теста SCSA в значительной степени коррелируют с ДНК человека, беременностью и выкидышем, предоставляют убедительные доказательства того, что SCSA может быть полезна при анализе спермы человека и может служить ценным инструментом для клиницистов бесплодия15.
Целостность хроматина, ММР и апоптоз отражают различные аспекты функции сперматозоидов, и, таким образом, комбинация этих биомаркеров может обеспечить более полное представление о статусе сперматозоидов. FCM может быть использован для отдельных измерений целостности хроматина, MMP или апоптоза в образцах спермы человека. Несмотря на то, что стоимость FCM и красителей ограничивают широкое применение этих методов в клинических лабораториях для поддержания репродуктивного здоровья, их значение для оценки плодовитости принимается.
Однако, поскольку каждый из экспериментов требует предварительной обработки образцов спермы, и все предварительно обработанные образцы должны быть протестированы как можно скорее, одновременное измерение всех трех биомаркеров для образца с помощью одного FCM может привести к длительному времени ожидания некоторых экспериментов и препятствовать надежности результатов. Это связано с тем, что сперматозоиды получают дополнительные повреждения во время процесса ожидания, если протокол не составлен должным образом с учетом всех трех экспериментов. В данной работе представлен протокол, который обеспечивает плавное измерение всех трех биомаркеров в одной цитометрии без существенного ущерба для качества эксперимента, вызванного длительным временем ожидания.
Protocol
Representative Results
Discussion
Было обнаружено, что целостность хроматина, ММР и апоптоз сперматозоидов человека являются ценными предикторами репродуктивных исходов. В последнем опубликованном лабораторном руководстве ВОЗ по исследованию и обработке спермы человека (шестое издание) некоторые из этих показателей (целостность хроматина и апоптоз) также выделяются как расширенные исследования, выходящие за рамки базового обследования рутинных параметров, таких как количество сперматозоидов18. Недавние публикации также свидетельствуют о том, что эти индикаторы могут быть более чувствительными маркерами реакции на внешнее опасное воздействие, что указывает на их потенциал для выявления репродуктивного ущерба на болееранней стадии. Сочетание этих показателей с рутинными обследованиями также может обеспечить более полное понимание профиля дисфункции сперматозоидов и сложности нарушения мужской репродуктивной функции в популяции.
Существует несколько ключевых моментов, которые в значительной степени определяют успех анализа спермы с помощью FCM. Во-первых, измерение ММП сперматозоидов и апоптоза требует немедленного обследования после разжижения спермы. Чтобы свести к минимуму временные затраты, два специалиста могут по отдельности взять на себя предварительную обработку MMP и анализ апоптоза образца. Поскольку предварительная обработка апоптоза проще, она будет переведена на этап проточной цитометрии быстрее, чем анализ MMP. Для анализа SCSA свежие образцы спермы должны быть криоконсервированы сразу после сжижения. Образцы спермы могут храниться в жидком азоте в течение относительно длительного периода времени и не требуют немедленного исследования.
Соответственно, затраты времени на проведение эксперимента на месте могут быть сокращены до 40 минут, что составляет продолжительность анализа MMP плюс проточный цитометрический этап анализа спермы. Во-вторых, настройка стробирования на проточной цитометрической платформе должна решаться для каждой партии образцов отдельно. Образцы сперматозоидов с четкими подгруппами клеток на диаграмме рассеяния могут быть выбраны в качестве эталона для построения области стробирования. В-третьих, поскольку не существует общепринятых клинических референсных значений для показателей этого эксперимента, исторические результаты могут быть использованы в качестве важного инструмента контроля качества. Кроме того, рекомендуется устанавливать положительный и отрицательный контроль в каждой партии измерений, особенно для SCSA и MMP.
Репрезентативные результаты анализа спермы, представленные здесь, получены с помощью Accuri C6. Тем не менее, этот метод может быть применен и к другим коммерческим платформам с незначительными изменениями. Как правило, для измерения всех показателей требуется в общей сложности от 5 ×10 6 сперматозоидов. Если концентрация сперматозоидов в образце намного ниже среднего уровня, потребность в объеме спермы возрастет.
Как и в случае с обычными параметрами сперматозоидов, также наблюдаются внутрииндивидуальные различия в целостности хроматина, ММП и апоптозе сперматозоидов человека21. Соответственно, многократные тесты образцов, собранных в разное время, могут дать более точную оценку степени повреждения функции сперматозоидов. Несмотря на то, что не существует рекомендуемого периода воздержания перед забором спермы для проточного цитометрического анализа, 2-7 дней эякуляторного воздержания, рекомендованные ВОЗ для рутинного анализа спермы, могут быть приняты. Это может помочь улучшить сопоставимость результатов между лабораториями и между различными образцами, взятыми у одних и тех же мужчин.
Основным ограничением этого метода является то, что два из трех протестированных биомаркеров – апоптоз и потенциал митохондриальной мембраны – требуют свежих образцов спермы. Это может ограничить их применение мужчинами, которые могут предоставить образцы спермы в лабораторию. Для теста на повреждение ДНК (SCSA) референсные образцы должны быть подготовлены до начала эксперимента для калибровки проточного цитометра. Следует отметить, что применение настоящего протокола требует наличия в лаборатории прибора FCM, что по-прежнему является серьезной проблемой для многих клинических лабораторий, хотя в некоторых регионах альтернативным выбором может быть сотрудничество со сторонней службой.
Кроме того, расходы на красители и другие реагенты также являются финансовым фактором для мужчин, которые могут нуждаться в обследовании. Наконец, протокол может нуждаться в модификации, если для исследования биомаркеров используются разные марки или версии FCM. Таким образом, в данной работе представлен практический подход к оценке трех биомаркеров повреждения сперматозоидов человека с помощью однопроточной цитометрической машины. Это может дать ценную информацию о мужском репродуктивном здоровье и дополнить рутинное обследование спермы.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех полевых сотрудников за помощь и интервьюируемых за сотрудничество.
Materials
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
- Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
- Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
- Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
- Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
- Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
- Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
- Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666 (2021).
- Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
- Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
- Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
- Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
- Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA®). Methods in Molecular Biology. 927, 147-164 (2013).
- Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
- Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
- Zhang, H. -. B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
- . WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022)
- Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
- Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
- Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).
