Analisi citofluorimetrica di biomarcatori per la rilevazione di difetti funzionali degli spermatozoi umani
Summary
Il presente protocollo fornisce una soluzione pratica che consente di misurare l’apoptosi, il potenziale di membrana mitocondriale e il danno al DNA negli spermatozoi umani con un singolo citometro.
Abstract
L’analisi convenzionale dei parametri seminali è ampiamente utilizzata per valutare la fertilità maschile. Tuttavia, gli studi hanno rilevato che ~ 15% dei pazienti infertili non mostra anomalie nei parametri seminali convenzionali. Sono necessarie ulteriori tecnologie per spiegare l’infertilità idiopatica e rilevare sottili difetti dello sperma. Attualmente, i biomarcatori della funzione degli spermatozoi, tra cui l’apoptosi degli spermatozoi, il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e il danno al DNA, rivelano la fisiologia degli spermatozoi a livello molecolare e sono in grado di prevedere la fertilità maschile.
Con le tecniche di citometria a flusso (FCM), ciascuno di questi marcatori può essere misurato in modo rapido, accurato e preciso in campioni di sperma umano, ma i costi in termini di tempo aumentano sostanzialmente e i risultati potrebbero essere ostacolati se tutti i biomarcatori devono essere testati con un singolo citometro. In questo protocollo, dopo la raccolta e l’incubazione immediata a 37 °C per la liquefazione, i campioni di sperma sono stati ulteriormente analizzati per l’apoptosi degli spermatozoi utilizzando la colorazione con isotiocianato di annessina V-fluoresceina (FITC)/ioduro di propidio (PI). L’MMP è stato marcato con la sonda 5,5′,6,6′-tetracloro-1,1′,3,3′-tetraetil-benzimidazolilcarbocanina ioduro (JC-1) e il danno al DNA è stato valutato utilizzando il test della struttura della cromatina spermatica (SCSA) con colorazione arancione acridina (AO). Pertanto, l’analisi citofluorimetrica dei marcatori di funzione degli spermatozoi può essere un kit di strumenti pratico e affidabile per la diagnosi di infertilità e la valutazione della funzione degli spermatozoi sia al banco che a letto.
Introduction
L’infertilità è diventata un problema di salute pubblica, con l’infertilità maschile che contribuisce al 40%-50% di tutti i casi 1,2. Sebbene l’analisi convenzionale della qualità dello sperma svolga un ruolo importante nel determinare il potenziale di fertilità maschile, circa il 15% dei pazienti con infertilità ha parametri spermatici normali come il numero di spermatozoi, la motilità e la morfologia3. Inoltre, gli esami di routine dello sperma hanno una scarsa ripetibilità, forniscono informazioni limitate sulla funzione degli spermatozoi e non possono fornire una valutazione accurata della fertilità maschile o riflettere i sottili difetti degli spermatozoi. Sono state sviluppate diverse tecniche per testare la funzione degli spermatozoi, come il test dell’emizona (HZA), il test di penetrazione degli spermatozoi, il test del gonfiore ipoosmotico, il test degli anticorpi antispermatozoi, ma questi metodi richiedono molto tempo e sono vulnerabili alle influenze soggettive degli operatori. Pertanto, è necessario sviluppare metodi rapidi e accurati per l’analisi della funzione spermatica.
FCM è una tecnologia di analisi rapida di singole cellule sviluppata negli anni ’70, che è stata ampiamente utilizzata in vari campi della biologia cellulare e della medicina. FCM è un robusto strumento per la valutazione della funzione degli spermatozoi che analizza gli spermatozoi marcati con una specifica sonda di fluorescenza4. Gli spermatozoi passano attraverso laser monocanale o multicanale e la luce diffusa e la fluorescenza emessa sono prodotte da un raggio laser. La luce diffusa include la luce diffusa diretta (FSC) e la luce diffusa laterale (SSC), che riflette le dimensioni della cella testata e la granularità della cella o la struttura interna. Questi segnali vengono raccolti, visualizzati e analizzati dal sistema informatico e, di conseguenza, una serie di caratteristiche degli spermatozoi vengono misurate in modo rapido e accurato. Pertanto, la FCM è una tecnica rapida, obiettiva, multidimensionale e ad alto rendimento che ha guadagnato una crescente attenzione nel campo dell’analisi dello sperma. L’applicazione del MOCA può colmare le lacune dei metodi tradizionali e fornisce un nuovo approccio per il rilevamento della struttura interna e della funzione degli spermatozoi.
L’apoptosi degli spermatozoi è strettamente correlata alla fertilità maschile5. Il rilevamento dell’apoptosi spermatica è un indice importante per valutare la funzione degli spermatozoi a livello molecolare. La FCM è ampiamente riconosciuta come un metodo affidabile e sensibile per rilevare l’apoptosi degli spermatozoi utilizzando la colorazione con annessina V-FITC/PI. Il principio di base è che la fosfatidilserina (PS) viene trasferita dallo strato interno della membrana cellulare al suo strato esterno nella fase iniziale dell’apoptosi. L’annessina V è una proteina fosfolipidica Ca2+-dipendente (di solito marcata da FITC) che ha un’elevata affinità per il PS, quindi rileva il PS esposto alla superficie esterna della membrana cellulare6. La necrosi e l’apoptosi possono essere distinte in combinazione con la colorazione Pl. Pertanto, il metodo della doppia colorazione Annexin V-FITC/PI è ampiamente utilizzato, in quanto è rapido, semplice e facile rilevare diversi spermatozoi apoptotici.
Uno spermatozoo maturo di mammifero contiene circa 72-80 mitocondri7, suggerendo una ragione biologica per la ritenzione dei mitocondri degli spermatozoi8. È stato scoperto che i mitocondri degli spermatozoi svolgono un ruolo importante nel sostenere la motilità e la fertilità degli spermatozoi9. La colorazione JC-1, che può essere utilizzata come indicatore di MMP in una varietà di tipi di cellule, è uno dei fluorocromi più popolari per la valutazione dell’attività mitocondriale degli spermatozoi10. JC-1 è un colorante cationico che si accumula in modo dipendente dal potenziale nei mitocondri. JC-1 ha una massima emissione di fluorescenza a 525 nm (verde) e forma aggregati J 11 quando si lega a membrane con un alto potenziale (ΔΨm, 80-100 mV), con conseguente spostamento dell’emissione di fluorescenza a ~590 nm (rosso-arancio). Di conseguenza, la depolarizzazione mitocondriale degli spermatozoi è indicata da una diminuzione del rapporto di intensità della fluorescenza rosso/verde e la FCM può essere utilizzata per rilevare i livelli di MMP nei campioni di sperma umano.
La metodologia SCSA è stata inventata da Evenson et al.12 ed è considerata un test preciso e ripetibile con dati unici a doppio parametro (fluorescenza rossa vs verde) su una scala di canali 1.024 × 1.024 13. Negli spermatozoi danneggiati, il DNA e le proteine alterate nei nuclei degli spermatozoi sono marcati da AO e le rotture del filamento di DNA sono misurate mediante fluorescenza rossa, mentre i doppi filamenti intatti emettono fluorescenza verde in FCM14. Al giorno d’oggi, sono stati sviluppati molti metodi per stimare l’integrità del DNA degli spermatozoi. Tuttavia, a differenza della SCSA, questi test sono spesso laboriosi e non sono in grado di diagnosticare l’infertilità maschile. I risultati del test SCSA sono significativamente correlati con la gravidanza e l’aborto spontaneo del DNA umano, forniscono prove convincenti che l’SCSA può essere utile nell’analisi dello sperma umano e può servire come strumento prezioso per i medici dell’infertilità15.
L’integrità della cromatina, la MMP e l’apoptosi riflettono diversi aspetti della funzione degli spermatozoi e, quindi, la combinazione di questi biomarcatori può fornire una visione più completa dello stato degli spermatozoi. L’FCM può essere utilizzato per misurazioni separate dell’integrità della cromatina, della MMP o dell’apoptosi in campioni di sperma umano. Sebbene il costo del MOCA e il costo dei coloranti abbiano limitato l’ampia applicazione di queste tecniche nei laboratori clinici per la salute riproduttiva, il loro valore per la stima della fecondità viene accettato.
Tuttavia, poiché ciascuno degli esperimenti richiede il pretrattamento dei campioni di sperma e tutti i campioni pretrattati devono essere testati il prima possibile, la misurazione simultanea di tutti e tre i biomarcatori per un campione con un singolo FCM può portare a lunghi tempi di attesa per alcuni degli esperimenti e ostacolare l’affidabilità dei risultati. Questo perché gli spermatozoi ricevono ulteriori danni durante il processo di attesa, se il protocollo non è organizzato correttamente tenendo conto di tutti e tre gli esperimenti. Questo articolo presenta un protocollo che realizza la misurazione fluente di tutti e tre i biomarcatori in un’unica citometria senza compromettere sostanzialmente la qualità dell’esperimento indotta da tempi di attesa prolungati.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’integrità della cromatina, la MMP e l’apoptosi degli spermatozoi umani sono risultati essere preziosi predittori di esiti riproduttivi. L’ultimo manuale di laboratorio dell’OMS per l’esame e il trattamento dello sperma umano (sesta edizione) ha anche evidenziato alcuni di questi indicatori (integrità della cromatina e apoptosi) come esami estesi oltre l’esame di base di parametri di routine come il numero di spermatozoi18. Pubblicazioni recenti suggeriscono anche che questi indicatori possono essere marcatori più sensibili di risposta a esposizioni pericolose esterne, indicando il loro potenziale per l’identificazione del danno riproduttivo in una fase precoce19,20. La combinazione di questi indicatori con esami di routine può anche fornire una comprensione più completa del profilo della disfunzione spermatica e della complessità del danno riproduttivo maschile nella popolazione.
Ci sono diversi aspetti chiave che determinano sostanzialmente il successo dell’analisi dello sperma con FCM. In primo luogo, la misurazione della MMP e dell’apoptosi degli spermatozoi richiede un esame immediato dopo che lo sperma è stato liquefatto. Per ridurre al minimo i costi in termini di tempo, due tecnici possono occuparsi separatamente del pretrattamento della MMP e dell’analisi dell’apoptosi di un campione. Poiché il pretrattamento dell’apoptosi è più semplice, si trasferirebbe alla fase citofluorimetrica più velocemente rispetto all’analisi MMP. Per l’analisi SCSA, i campioni di sperma fresco devono essere crioconservati immediatamente dopo la disponibilità dopo la liquefazione. I campioni di sperma possono quindi essere conservati in azoto liquido per un periodo relativamente lungo e non necessitano di un esame immediato.
Di conseguenza, il costo in termini di tempo in loco dell’esperimento può essere compresso a 40 minuti, che è la durata dell’analisi MMP più la fase citofluorimetrica dell’analisi dello sperma. In secondo luogo, l’installazione del gating nella piattaforma citofluorimetrica deve essere decisa separatamente per ciascun lotto di campioni. I campioni di sperma con sottogruppi di cellule chiare nel grafico a dispersione possono essere selezionati come riferimento per disegnare l’area di gating. In terzo luogo, poiché non esistono valori clinici di riferimento ampiamente accettati per gli indicatori di questo esperimento, i risultati storici possono essere utilizzati come importante strumento per il controllo della qualità. Si consiglia inoltre di impostare controlli positivi e negativi in ogni lotto di misurazioni, in particolare per SCSA e MMP.
I risultati rappresentativi dell’analisi dello sperma qui forniti sono derivati utilizzando un Accuri C6. Tuttavia, la tecnica potrebbe essere applicata ad altre piattaforme commerciali con piccole modifiche. Di solito, un totale di 5 × 106 spermatozoi sarebbero necessari per soddisfare il requisito per la misurazione di tutti gli indicatori. Se la concentrazione di spermatozoi di un campione è molto inferiore al livello medio, il fabbisogno di volume di sperma aumenterebbe.
Analogamente ai parametri di routine degli spermatozoi, vi è anche una notevole variazione intraindividuale nell’integrità della cromatina, nella MMP e nell’apoptosi degli spermatozoi umani21. Di conseguenza, test multipli di campioni raccolti in momenti diversi possono fornire una stima più accurata del livello di danno alla funzione spermatica. Sebbene non esista un periodo di astinenza raccomandato prima del prelievo di spermatozoi per l’analisi citofluorimetrica, possono essere adottati 2-7 giorni di astinenza eiaculatoria, suggerita per l’analisi di routine degli spermatozoi dall’OMS. Può contribuire a migliorare la comparabilità dei risultati tra i laboratori e tra i diversi campioni prelevati dagli stessi uomini.
Una delle principali limitazioni di questo metodo è che due dei tre biomarcatori testati – l’apoptosi e il potenziale di membrana mitocondriale – richiedono campioni di sperma freschi. Ciò può limitare la loro applicazione agli uomini che possono fornire campioni di sperma al laboratorio. Per il test del danno al DNA (SCSA), i campioni di riferimento devono essere preparati prima dell’esperimento per calibrare il citometro a flusso. Da notare che l’applicazione del presente protocollo richiede uno strumento FCM in laboratorio, che è ancora una sfida considerevole per molti laboratori clinici, sebbene la cooperazione con un servizio di terze parti possa essere una scelta alternativa in alcune regioni.
Inoltre, il costo dei coloranti e di altri reagenti è anche un fattore finanziario per i maschi che potrebbero aver bisogno dell’esame. Infine, potrebbe essere necessario modificare il protocollo se vengono utilizzate marche o versioni diverse di FCM per esaminare i biomarcatori. In sintesi, questo articolo presenta un approccio pratico per stimare tre biomarcatori di danno agli spermatozoi umani mediante una singola macchina per citometria a flusso. Ciò può fornire informazioni preziose sulla salute riproduttiva maschile e integrare l’esame di routine dello sperma.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo tutti gli operatori sul campo per il loro aiuto e gli intervistati per la loro collaborazione.
Materials
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
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