1型糖尿病、セリアック病、およびCOVID-19のハイスループット多重化スクリーニング

研究プロトコルは、コロラド州複数の施設内審査委員会によって承認されました。 1. バッファー調製 標識バッファー(2x PBS、pH 7.9)を調製する:100 mLの10x PBSを400 mLの蒸留水に加え、NaOHを使用してpHを7.9に調整します。 3 mMのビオチンとRuスルホ-NHSを作る:1 mgのビオチンを588 μLの標識バッファーに溶解し、150 nmolのRu Sulfo-NHSを50 μLの標識バッファーに溶解します。 抗原バッファー(1%BSA)の調製:5 gのウシ血清アルブミン(BSA)を500 mLの1x PBSに溶解します。 コーティングバッファー(3%ブロッカーA)を調製します:15 gのブロッカーAを500 mLの1x PBSに溶解します。 最初の洗浄バッファー(0.05%トゥイーン20、PBST)を準備します:2.5 mLのトゥイーン20を5,000 mLの1x PBSに混合します。 2 つ目の洗浄バッファー (0.4 M NaCl) を準備します。 50 mL の 5 M NaCl を 575 mL の蒸留水に混合して、0.4 M NaCl 溶液を作ります。注:効率的なラベリングのために、常に新しく調製されたビオチンおよびRu Sulfo-NHS溶液を使用し、以前に作成したものは保存しないでください。 2.ビオチンとRuスルホ-NHSによる抗原タンパク質標識 注:より高い標識効率を得るには、抗原タンパク質≥0.5 mg/mLの濃度が高いことが推奨されます。 プロインスリン、GAD-65、IA-2、ZnT8、TG、およびSARS-CoV-2のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)を含む6つの標的抗原タンパク質溶液を調製します。分子量に応じて各抗原タンパク質のモル数を計算し、ビオチンまたはRu Sulfo-NHSの適切なモル比を作成します。ビオチンまたはRuスルホ-NHSの合計に対する抗原の比率は、プロインスリンタンパク質などの小分子抗原(分子量≤10 kd)では1:5になります。ZnT8などの中分子抗原(分子量10〜50 kd)の場合、比率は1:10に調整されます。GADなどの高分子量の抗原(分子量>50 kd)の場合、モル比は1:20になります。 抗原タンパク質を2等分し、ステップ2.1で計算したモル比を使用してビオチンおよびRu Sulfo-NHSと別々に混合します。混合物を室温(RT)で1.5時間インキュベートし、光を避けます。注:抗原タンパク質のバッファーに含まれるトリスやグリシンなどの還元性化学物質はすべて、2x PBS(pH 7.9)のバッファーでプライミングしたサイジングスピンカラムで除去する必要があります。 スピンカラムを2x PBSでプライミングします(スピンカラムのサイズ、2 mLまたは5 mL、標識抗原タンパク質の容量によって異なります):1 mlの2x PBSバッファーをスピンカラムに加え、1,000 x g で2分間遠心分離し、さらに2回ステップを繰り返します。 抗原タンパク質-ビオチンまたは-Ruスルホ-NHS混合物をプライミングスピンカラムに1回通して(カラムを1,000 x g で2分間遠心分離)、精製して標識反応を停止させます。 スピンカラムから溶出した標識抗原タンパク質の最終体積を測定し、ビオチンまたはルスルホ-NHS標識抗原タンパク質の濃度を計算する。標識抗原タンパク質のアリコート(50 μL/チューブ)を小さくし、-80°Cで保存して長期間使用します。注:各スピンカラム後のタンパク質のカバレッジは、約90%〜95%の保持率になります。 3. 6-Plex ECLアッセイ(チェッカーボードアッセイ)用のビオチンおよびRuスルホNHS標識抗原の最適な濃度と比率の定義 注:各抗原のチェッカーボードアッセイは、マルチプレックスアッセイに統合する前に必要です。 チェッカーボードアッセイを抗原ごとに個別に適用します。メモ: 手順 3.2.-3.7.簡単な例としてTGAを使用します。TGAチェッカーボードアッセイプロセスは、アッセイプロセスをシミュレートすることですが、1種類の抗原のみを使用します。 ビオチン化tTGおよびRuスルホ-NHS標識tTGの段階希釈を行います。最初の混合溶液の推奨使用濃度は、ビオチン化およびRuスルホ-NHS標識tTGの両方で240 ng / mLから始まります。元のビオチン化tTGとRuスルホNHS標識tTGの両方の濃度が1.0 μg/μLであると仮定します。 元のRuスルホ-NHS標識tTGの10倍希釈と、元のビオチン化tTGの5%BSA希釈を行います。 4 μLのビオチン化tTGタンパク質を156 μLの5%BSA(抗原バッファー)および240 μLのストレプトアビジン結合リンカーと1本のチューブで混合し、溶液をRTで30分間インキュベートします。その後、160 μLのストップ溶液を加え、RTでさらに30分間インキュベートします。400 μLの混合物を取り、2 mLの停止液と混合します。混合物中のビオチン化tTGの濃度は240 ng/mLです。 ビオチン標識ZnT8抗原の段階希釈を行うには、さらに5本の新しいチューブを準備し、ステップ3.3で混合物から1 mLのアリコートを取ります。新しいチューブで1 mLのストップ溶液と混合し、120 ng / mLの濃度の混合物を取得します。この手順を繰り返し、連続1:1希釈を行い、ビオチン標識tTGを60 ng/mL、30 ng/mL、15 ng/mL、および7.5 ng/mLで取得します。 4 μLのRuスルホNHS標識tTGと1.6 mLの停止液を加え、240 ng/mLの濃度でRuスルホ-NHS標識tTGの混合物を得る。3.4.と同じステップで、連続1:1希釈を行い、60 ng / mL、30 ng / mL、15 ng / mL、7.5 ng / mL、および3.75 ng / mLでRuスルホ-NHS標識ZnT8抗原を取得します。最終濃度は0 ng/mLで、停止液のみで、Ruスルホ-NHS標識抗原は含まれていません。 tTGポジティブコントロールおよびネガティブコントロール血清サンプル(単一のECL tTGアッセイによって事前認定および標準化済み)および96ウェルPCRプレートを調製します。陽性および陰性対照血清サンプルをプレートの左半分および右半分にそれぞれ分注し、各ウェルに7 μLを入れます。プレートに1x PBSを加え、ウェルあたり33 μLを使用します。 PCRプレートの左半分に、24 μLの段階希釈ビオチン標識tTGリンカー溶液を各ウェル、1カラム、1濃度の高いものから低いものの順に添加します。同様に、16 μLの段階希釈Ru Sulfo-NHS標識tTG抗原を各ウェルに1列ずつ1濃度で添加し、完全に混合します。PCRプレートの右半分で手順を繰り返します。 ステップ5.3.-9.1で説明されている残りのアッセイステップを続行します。生のカウントデータが得られるまで。 対応する負の制御信号に対する正の制御信号の比率を計算します。陰性対照サンプルのビオチン標識抗原とRu Sulfo-NHS標識抗原の比値が高く、バックグラウンドが低い最適な濃度を決定します。ビオチンおよびRuスルホ-NHS標識抗原タンパク質の最適な使用濃度を以下に示します:GAD65の場合は16.0 ng / mLおよび8.0 ng / mL、SARS-CoV-2 RBDの場合は18.8 ng / mLおよび9.4 ng / mL、IA-2の場合は42.0 ng / mLおよび42.0 ng / mL、tTGの場合は60.0 ng / mLおよび60.0 ng / mL、ZnT8の場合は4.2 ng / mLおよび4.2 ng / mL。 プロインスリンの場合は31.3 ng / mLおよび31.3 ng / mLです。 4. リンカー共役型抗原溶液の作成 ビオチンおよびRuスルホNHS標識抗原を5%BSAで希釈して、ステップ3.9に従って最適な使用濃度にします。 事前に選択されたリンカーを各ビオチン化抗原タンパク質に結合します。1回の96ウェルプレートアッセイでは、4 μLのビオチン化GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8、およびプロインスリン抗原タンパク質を156 μLの1% BSAを含む別のチューブに加え、240 μLの対応するストレプトアビジン結合リンカー1、2、3、8、9、および10と混合します(図1)。混合物をRTで30分間インキュベートします。 各チューブに160 μLのストップ溶液を分注し、混合物をRTで30分間インキュベートします。各チューブから400 μLの混合溶液を取り出し、それらを混ぜ合わせます。 上記の混合物に4 μLのRuスルホ-NHS標識GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8、およびプロインスリン抗原を加え、次に1.6 mLの停止液と3.2 mLの1x PBSを加えて混合します。これで、抗原溶液をアッセイに使用する準備が整いました。 5. 血清サンプルを標識抗原でインキュベートする 96ウェルPCRプレートにウェルあたり7 μLの血清を分注し、シーリングフィルムで覆います。血清をPCRマシンで56°Cで30分間予熱します。プレートを100 x g で1分間短時間遠心分離します。 ウェルあたり63 μLの抗原溶液(ステップ4.4で調製)を加え、血清と混合します。光を避けるために、PCRプレートをシーリングホイルで覆います。 プレートをシェーカーで450rpm、室温で2時間振とうし、次にプレートを4°Cで18〜24時間インキュベートします。 6.6プレックスプレートを準備します 4°Cの冷蔵庫から6プレックスプレートを取り出し、プレートをRTにします。 6-Plexプレートの各ウェルに150 μLの3%ブロッカーAを加えます。 プレートを4°Cの冷蔵庫に戻し、光を避けてホイルでプレートを覆い、一晩インキュベートします。注:1日目のアッセイステップには、セクション4.-6が含まれます。 7. 血清/抗原インキュベートを6-Plexプレートに移します。 翌日、インキュベーション中の6-Plexプレートを冷蔵庫から取り出し、プレートからすべてのバッファーを捨てます。プレートをペーパータオルに軽くたたいて乾かします。 6-Plexプレートをウェルあたり150 μLの洗浄バッファーで毎回3回洗浄します。プレートをペーパータオルで乾かし、一晩インキュベートするPCRプレートの各ウェルから血清/抗原インキュベートを6-Plexプレートの2つのウェルに分注します(複製の場合はウェルあたり30 μL)。 プレートをホイルで覆い、プレートシェーカーに置き、RTで450rpmの速度で1時間振とうします。 8. 6プレックスプレートを洗浄し、読み取りバッファーを追加します 溶液を6-Plexプレートにダンプし、毎回ウェルあたり150 μLの0.4 M NaCl洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。 3回目の洗浄が完了したら、プレートをペーパータオルで乾かし、150 μLの読み取りバッファーを各ウェルに加えます。注意: 井戸内の気泡はプレートリーダーマシンの精度に影響を与えるため、絶対に避ける必要があります。 9.プレートを読み、データを分析します 電気化学発光分析装置でプレートを数えます。読み取り結果は、カウント/秒(CPS)の値とともに表示されます。各特異的抗体の内部標準陽性および陰性対照のCPSに対するリーディングマシンから得られた生CPSを用いて各サンプルの相対抗体指数を算出する(指数値=[CPS(サンプル)-CPS(陰性標準)]/[CPS(陽性標準)-CPS(陰性標準)])。 ASK研究からの555陰性対照サンプルの99.5番目 から99.8パー センタイルで確立されたカットオフ値を使用して、陰性または陽性の抗体結果を決定します(糖尿病または他のタイプの自己免疫疾患の病歴または家族歴のないすべての抗体陰性サンプル)。注:2日目のアッセイステップには、セクション7〜9が含まれます。