בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית
Summary
המחקר של ריפוי פצעים הקשורים לפגיעה בשרירים-שלד דורש לעתים קרובות הערכה של אינטראקציות במבחנה בין תאי שוואן (SCs), קרטינוציטים ופיברובלסטים. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, התרבות והאפיון של תאים ראשוניים אלה מהעורלה האנושית.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר שיטות בידוד, תנאי גידול ואפיון של תאים ראשוניים אנושיים בעלי תפוקה גבוהה וכדאיות באמצעות דיסוציאציה אנזימטית מהירה של העור. קרטינוציטים ראשוניים, פיברובלסטים ותאי שוואן נקטפים כולם מעורלת היילוד האנושית, הזמינה בהתאם להליכי הטיפול הסטנדרטיים. העור שהוסר מחוטא, והשומן והשרירים התת עוריים מוסרים באמצעות אזמל. השיטה מורכבת מהפרדה אנזימטית ומכנית של שכבות אפידרמיס ודרמליות, ואחריה עיכול אנזימטי נוסף לקבלת תרחיפים חד-תאיים מכל אחת משכבות העור הללו. לבסוף, תאים בודדים גדלים במדיה מתאימה של תרביות תאים בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים של תרביות תאים כדי לשמור על גדילה וכדאיות במשך שבועות. יחד, פרוטוקול פשוט זה מאפשר בידוד, התרבות ואפיון של כל שלושת סוגי התאים מפיסת עור אחת לצורך הערכה חוץ גופית של מודלים של עור-עצבים. בנוסף, ניתן להשתמש בתאים אלה יחד בתרביות משותפות כדי לאמוד את השפעתם זה על זה ואת תגובותיהם לטראומה במבחנה בצורה של שריטות המבוצעות באופן רובוטי בתרבית הקשורה לריפוי פצעים.
Introduction
תאים ראשוניים שמקורם ברקמות חיות ובתרבית בתנאי מבחנה דומים מאוד למצב הפיזיולוגי1, מה שהופך אותם למודל אידיאלי לחקר תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. העור מכיל סוגי תאים מרובים, כולל קרטינוציטים, פיברובלסטים, סבוציטים, מלנוציטים ותאי שוואן (SCs), אותם ניתן לבודד ולתרבת אותם לניסויים במבחנה . שיטות לבידוד ותרבית קרטינוציטים, פיברובלסטים ו-SCs, מפיסת עור אחת, לא תוארו. מטרתו של פרוטוקול זה היא כפולה: 1) לבסס שיטה אמינה וניתנת לשחזור לבידוד וגידול של מעגלים עוריים ו-2) להשתמש בשיטה יעילה וחזקה לבידוד של קרטינוציטים, פיברובלסטים ו-SCs מעורלה אנושית אחת.
כיום, ישנם פרוטוקולים מבוססים לבידוד קרטינוציטים בעור 2,3,4 ופיברובלסטים 5,6. מחקרים אלה מתארים את הבידוד של קרטינוציטים, פיברובלסטים או שניהם מהעור, אך אין פרוטוקול המתייחס לאופן שבו ניתן ליצור תרביות של SCs ראשוניים מעור האדם. מחקרים אחרונים מצביעים על כך ש-SCs עצביים מווסתים תהליכים תאיים של קרטינוציטים ופיברובלסטים ומווסתים תפקודים פיזיולוגיים תקינים בעור7. לפיכך, SCs הם קריטיים להומאוסטזיס של העור ותורמים באופן משמעותי לפיזיולוגיה של הוויסות המשפיעה על התנהגותם של סוגי תאי עור שכנים הנמצאים8. לכן, פרוטוקול המאפשר בידוד של כל אחד מסוגי התאים הללו הוא אידיאלי לניסויים במבחנה הכוללים תקשורת בין תאים לתאים או לשיחה צולבת בין סוגי תאים.
פרוטוקול זה מתאר את הקמתן של תרביות תאים בודדות של תאים ראשוניים מפיסת עור אחת. פרוטוקול זה שימושי במיוחד כאשר כמות הרקמה הזמינה מוגבלת. יתר על כן, בידוד של כל שלושת סוגי התאים מתורם יחיד מאפשר השוואות חזקות בין סוגי תאים או ניסויים בתרבית משותפת תוך הפחתת השפעת הגנטיקה במהלך הניסוי הרצוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד שלוש אוכלוסיות תאים נפרדות מחתיכה אחת של העורלה, כלומר קרטינוציטים, פיברובלסטים ותאי שוואן. ישנם מספר פרוטוקולי בידוד זמינים לבידוד קרטינוציטים ופיברובלסטים 2,3,5,6, אך אף אחד מהם אינו מתאר בידוד SC.<sup class="xr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר פאדיה כמאל ולד”ר ריאד אלברברי על שאפשרו לנו להשתמש במכשירי מעבדה ובתמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מה- NIH (K08 AR060164-01A) ו- DOD (W81XWH-16-1-0725) ל- J. C. E. בנוסף לתמיכה מוסדית מהמרכז הרפואי הרשי של אוניברסיטת פנסילבניה.
Materials
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
- Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
- Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
- Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
- Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
- Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
- Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
- Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
- Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
- Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
