Summary

ヒト臍帯組織からの間葉系幹細胞の生成と骨格筋系統への分化

Published: August 31, 2022
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Summary

ヒト臍帯組織から間葉系幹細胞を単離し、骨格筋系統に分化させるためのプロトコルについて説明する。

Abstract

間葉系幹細胞の治療可能性を探ることは、単離の容易さ、分化に対する効力、および供給源の信頼性と堅牢性にかかっています。ここでは、ヒト臍帯組織(uMSC)から間葉系幹細胞を単離するための段階的なプロトコール、それらの免疫表現型決定、およびいくつかの継代にわたるそのような培養物の増殖について記述する。この手順では、酵素消化がないためuMSCsの生存率は高い。さらに、臍帯動脈および静脈を含む血管の除去は、内皮起源の細胞の汚染がないことを確実にする。フローサイトメトリーを用いて、単離時のuMSCはCD45CD34であり、造血系統からの細胞の不在を示す。重要なことに、それらは重要な表面マーカー、CD105、CD90、およびCD73を表現します。培養物の樹立に際し、本稿では、これらのuMSCを骨格筋系統に分化誘導する効率的な方法を記載する。分化したuMSCにおける筋原性進行の詳細な分析により、uMSCは分化の初期段階において筋原性前駆細胞のマーカーであるPax7を発現し、続いてMyoDおよびMyf5の発現、そして最後に終末分化マーカーであるミオシン重鎖(MyHC)を発現することが明らかになった。

Introduction

ヒト臍帯は、間葉系幹細胞の堅牢な貯蔵庫を有すると信じられており、それらは、その堅牢な増殖および分化速度、免疫調節特性、および3つの胚葉すべてから細胞を生成する能力のために、現在再生療法のために探求されている1。臍帯組織は、臍帯血、臍帯静脈下内皮、ウォートンゼリー(WJ)などの複数の区画からなり、それ自体が血管周囲ゾーン、血管間ゾーン、および羊膜下またはコードライニング(CL)2の3つの不明瞭な領域を包含する。uMSCはこれらすべての異なる領域から単離され、主要なMSCマーカーを広く発現することができるが、これらのコンパートメントが同じ集団のuMSCを含むのか、それともそれらの分化能に違いを示すのかについては明確ではない3。したがって、uMSCの単離のためのプロトコルは、その分離のモードおよび領域におけるより高い精度、分化電位の堅牢な特性評価、および最後に、コードの異なる区画からの比較分析を必要とする。

この文脈において、コードの異なる部分間のuMSC増殖性および分化電位の違いを実証した研究はほとんどない。これらのうち、CL領域およびWJ領域から単離されたuMSC間の比較分析は、CL由来uMSCs3,4においてより大きな増殖能を明らかにした。別の研究では、WJ由来のuMSCは、血管周囲細胞(HUCPV)と比較して増殖アッセイにおいてより優れた性能を発揮しました5。臍帯血由来uMSCと血管汚染を欠く臍帯組織由来uMSCの違いを調べる際に、2つのコンパートメント間で主要なMSCマーカーの差異発現が報告され、臍帯組織由来uMSCsの増殖速度が増加した6

骨形成、脂肪原性、軟骨形成性系統などの中胚葉系譜の組織へのuMSCの分化能を調べたいくつかの研究のうち、筋原性分化およびその後の特徴付けのための詳細なプロトコル、ならびに様々なコードコンパートメント間の比較分析を提供した研究はほとんどない。この文脈で、我々は堅牢な筋肉分化プロトコルを開発し、臍帯組織由来uMSCsが臍帯血と比較して優れた筋原性分化能力を示すことを観察した6。ここでは、血管系に関連する細胞を欠いている臍帯組織全体からのuMSCの単離、それらの特徴付け、および筋原性系統への分化について、段階的なプロトコールが詳述されている。

Protocol

この研究における臍帯組織の使用は、幹細胞研究のための機関委員会(IC-SCR)、機関倫理委員会、トランスレーショナルヘルス科学技術研究所(IEC-THSTI)、市民病院、グルグラム、ハリヤーナ州の機関倫理委員会、および施設バイオセーフティ委員会THSTIによって承認されました。ヒト臍帯組織サンプルは、出生時の期間分娩から採取した。インフォームド書面による同意が被験者から得られた。?…

Representative Results

臍帯組織からのuMSCの単離の成功は、全臍帯血からの成功率の低さとは異なり、>95%である。uMSCの単離に成功すると、FACS分析により、すべての細胞がCD34−CD45−CD105+CD90+であることが明らかになった。しかしながら、比較解析において、臍帯血から単離されたuMSCは不均一な集団を示し、ここで細胞の割合はCD34+CD45+CD105+(〜15%)を示す。さ?…

Discussion

重要なステップ
このプロトコルの重要なステップは、送達時から無菌培養物の維持まで、増殖の全期間にわたって、無菌条件下での組織の収集である。コード収集中は、コードが滅菌されていない表面に触れず、抗生物質を添加したPBSを含むチューブに収集する前に70%エタノールで外部から拭き取ることが不可欠です。uMSC単離のために、コード収集と組織の処理との間の時間…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

撮影とビデオ制作に協力してくれたOjas Tikoo氏に感謝します。我々はまた、GARBH-Ini(Advanced Research and Birth Outcome-DBT India)のスタッフ、看護師、上級研究官、及びPallavi Kshetrapal博士から物流に関する支援を受けたことを認識する。この研究は、インドのバイオテクノロジー省からSuchitra Gopinathに授与された助成金によって支援されました(BT/09/IYBA/2015;BT/PR29599/PFN/20/1393/2018)。

Materials

4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Amphotericin B Sigma Aldrich A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) HiMedia A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody Sigma Aldrich G8795
Anti-MyHC antibody (My32) Novus Biologicals NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A) Novus Biologicals NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) Novus Biologicals NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody DSHB DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 559869
Collagen Type 1 Merck C8919
D (+) Glucose Sigma Aldrich G7021
Dexamethasone SIGMA D4902
FACSCanto II or FACSAria III BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil GIBCO 10270106 not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 BD Biosciences 551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 BD Biosciences 557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 BD Biosciences 557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 BD Biosciences 555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 BD Biosciences 555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 BD Biosciences 560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 BD Biosciences 557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555786
FlowJo software BD Biosciences
Gentamicin Sigma Aldrich G1264
Horse serum HiMedia RM1239
Hydrocortisone Merck H4001
Laminin Merck L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides Hyclone SH30568.FS Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266 BD Biosciences 560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515 BD Biosciences 550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 BD Biosciences 555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 BD Biosciences 561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 HiMedia M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) HiMedia TCL049-100mL

References

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Citer Cet Article
Sevak, J. K., Gopinath, S. D. Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage. J. Vis. Exp. (186), e63725, doi:10.3791/63725 (2022).

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