Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy

Alejandro De la Cadena; Federico Vernuccio; Benedetta Talone; Arianna Bresci; Chiara Ceconello; Subir Das; Renzo Vanna; Giulio Cerullo; Dario Polli

doi:10.3791/63709

JoVE Journal > Engineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Ingénierie

Multiplex chemische beeldvorming op basis van breedband gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Published: July 25, 2022

doi:

10.3791/63709

Alejandro De la Cadena¹, Federico Vernuccio¹, Benedetta Talone¹, Arianna Bresci¹, Chiara Ceconello¹, Subir Das¹, Renzo Vanna², Giulio Cerullo^1,2, Dario Polli^1,2

¹Dipartimento di Fisica,Politecnico di Milano, ²Institute for Photonics and Nanotechnologies (IFN-CNR)

Summary

We presenteren een protocol om chemische beelden te verkrijgen met breedband gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie. Gebaseerd op een SRS-microscoop die werkt met differentiële meerkanaals-lock-in detectie, beschrijft het protocol de monstervoorbereiding, aanpassing van het SRS-apparaat en chemometrie om verschillende bestanddelen van chemisch heterogene monsters te ontwarren.

Abstract

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopie is een niet-lineaire optische techniek voor labelvrije chemische beeldvorming. Deze analytische tool levert chemische kaarten met hoge snelheid en hoge ruimtelijke resolutie van dunne monsters door hun moleculaire trillingen rechtstreeks te onderzoeken. In de standaardimplementatie is SRS-microscopie smalbandig en vormt het beelden met slechts één trillingsfrequentie tegelijk. Deze benadering belemmert echter niet alleen de chemische specificiteit van SRS, maar verwaarloost ook de schat aan informatie die is gecodeerd in trillingsspectra.

Deze beperkingen kunnen worden overwonnen door breedband SRS, een implementatie die in staat is om parallel een trillingsspectrum per pixel van het beeld te extraheren. Dit levert hyperspectrale gegevens op die, in combinatie met chemometrische analyse, de hoeveelheid informatie die uit het monster wordt opgehaald, maximaliseren. Breedband-SRS verbetert dus de chemische specificiteit van het systeem, waardoor de kwantitatieve bepaling van de concentratie van de verschillende bestanddelen van een monster mogelijk is. Hier rapporteren we een protocol voor chemische beeldvorming met breedband SRS-microscopie, gebaseerd op een zelfgebouwde SRS-microscoop die werkt met een aangepaste differentiële meerkanaals-lock-in versterkerdetectie. Het bespreekt de monstervoorbereiding, uitlijning van het SRS-apparaat en chemometrische analyse. Door vibrationele Raman-spectra te verkrijgen, illustreert het protocol hoe verschillende chemische soorten in een mengsel kunnen worden geïdentificeerd en hun relatieve concentraties kunnen worden bepaald.

Introduction

Raman-microscopie is een krachtige beeldvormingstechniek die rijke chemische kaarten levert door Raman-verstrooiing¹ te meten, een inelastisch stralingsproces dat afkomstig is van moleculen die trillen als reactie op invallend licht ^2,3. Elke pixel van een Raman-kaart bevat een spectrum dat directe informatie bevat over de chemische samenstelling en structuur van het monster, wat resulteert in beelden met intrinsiek trillingscontrast. Tot op heden is Raman-microscopie het referentiestandpunt voor microspectroscopiestudies van moleculaire trillingen, omdat geen enkele andere beeldvormingstechniek beelden kan produceren met zowel een hoge chemische specificiteit als een hoge ruimtelijke resolutie⁴. Ondanks de uitstekende chemische specificiteit is de opwekkingsefficiëntie van Raman-verstrooiing laag, wat vraagt om langere pixelverblijftijden of excitatie met een hoog vermogen, wat respectievelijk leidt tot lage acquisitiesnelheden en incompatibiliteit met gevoelige monsters.

Deze enkele tekortkoming van Raman-microscopie leidde ertoe dat onderzoekers coherente Raman-verstrooiing 5,6,7,8,9 toepasten als een bron van contrast voor microscopie. Dit is een niet-lineair optisch proces dat de trillingsrespons met verschillende (tot zeven) ordes van grootte verbetert, waardoor snelle chemische beeldvorming ^10,11,12,13 mogelijk is. In het bijzonder zijn de twee meest gebruikte coherente Raman-verstrooiingstechnieken coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS)¹⁴ en gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS)¹⁵. In tegenstelling tot CARS vertoont SRS een lineaire afhankelijkheid van de concentratie van resonante moleculen. Het is immuun voor de niet-resonante achtergrond, een niet-lineair effect dat geen verband houdt met enige trillingsovergang, maar vervormt voor de Lorentziaanse vormen die kenmerkend zijn voor de Raman-spectra van de moleculaire trillingen^16,17. SRS-microscopie levert dus authentieke Raman-informatie op die directe kwantitatieve beeldanalyse mogelijk maakt.

SRS is een derde-orde, niet-lineair, optisch proces dat directe informatie geeft over de chemische bindingen van een monster. Het is afkomstig van de spatiotemporale superpositie van twee optische velden in het algemeen in het nabij-infrarode spectrale gebied, namelijk de pomp en de Stokes bij frequentie ω_pu en ω_S, respectievelijk 10,11,18. Deze superpositie genereert een kloppend op de pomp-Stokes frequentie detuning Ω = ω_pu-ω _S. Wanneer Ω overeenkomt met een moleculaire trilling Ω_R, resoneert het molecuul, waardoor een coherente energieoverdracht ontstaat tussen de lichtvelden en het molecuul. Als gevolg hiervan bereikt het molecuul een trillingsaangeslagen toestand. Dit proces kan worden gevolgd door het meten van de vernietiging van pompfotonen (een signaal dat bekend staat als gestimuleerd Raman-verlies [SRL]) of de gelijktijdige versterking van Stokes-fotonen (een proces dat bekend staat als gestimuleerde Raman-versterking [SRG]). SRG en SRL zijn kleine signalen (ΔI) die bovenop een intense en fluctuerende achtergrond (I) zitten. Omdat typische waarden van het ^SRS-signaal (ΔI/I) zich in het bereik 10-6-10-4 bevinden, kan de laserruis het gemakkelijk verduisteren. Om de schadelijke effecten van de laserruis op de signaal-ruisverhouding (SNR) en bijgevolg op de beeldsnelheid te beperken, vertrouwt SRS-detectie op modulatieoverdrachtstechnieken (bijv. Lock-in-versterkers, resonantiecircuits of box-car averagers) bij hoge modulatiefrequenties (>1 MHz), waarbij de laserruis zijn minimumwaarden 15,19,20 bereikt.

Conventionele SRS-microscopie maakt gebruik van smalbandige (≈10 cm⁻¹) pomp- en Stokes-pulsen om chemische beelden te produceren met een enkele trillingsfrequentie, waardoor videosnelheidsbeelden mogelijk zijn met pixelverblijftijden zo laag als ≈100 ns^21,22. Omdat smalband SRS-microscopie echter chemische kaarten vormt door het monster sequentieel te scannen met slechts enkele trillingsfrequenties, is de informatie beperkt²³. SRS-beelden met een of twee trillingscontrasten zijn mogelijk niet voldoende om chemische soorten met overlappende Raman-banden te onderscheiden, vooral binnen heterogene systemen. Daarom benut de paradigmatische smalband SRS-microscoop niet het volledige potentieel van SRS, omdat het onderzoeken van een handvol trillingsfrequenties de chemische specificiteit ervan belemmert en de schat aan informatie verwaarloost die is gecodeerd in trillingsspectra. Bovendien resulteert sequentieel scannen van het monster op verschillende frequenties in verlengde pixelverblijftijden die fotoschade kunnen veroorzaken en rigoureuze ruimtelijke coregistratie tussen opeenvolgende afbeeldingen kunnen voorkomen, wat leidt tot bewegingsartefacten.

In tegenstelling tot zijn smalbandige tegenhanger haalt breedband SRS-microscopie bij elke monsterscan een trillingsspectrum per pixel op 10,12,24. Breedband SRS biedt dus hyperspectrale beeldvorming met strikte ruimtelijke coregistratie van verschillende trillingscontrasten, waardoor rigoureuze gegevensanalyse mogelijk is. Dit onthult niet alleen de chemische bestanddelen van het monster via Raman-spectra, maar helpt ook om hun relatieve concentraties te bepalen. Afhankelijk van hoe de spectra worden verkregen, wordt breedband SRS-microscopie geclassificeerd als hyperspectrale SRS of multiplex SRS. In hyperspectrale SRS wordt het SRS-spectrum per gescand punt van het monster sequentieel verkregen (d.w.z. het wordt opgehaald door de frequentie-detuning Ω te vegen), waardoor een SRS-spectrum wordt opgebouwd door de SRS-signalen bij opeenvolgende Raman-verschuivingen samen te stapelen. Het Raman-spectrum wordt gelijktijdig gemeten bij verschillende trillingsmodi in multiplex SRS. De multiplex SRS-benadering combineert dus een gemoduleerde smalbandpuls met een breedbandpuls om het SRS-signaal op verschillende frequenties aan te drijven, en gebruikt een meerkanaalsdetector met een gevoeligheid die vergelijkbaar is met die van smalband SRS om de SRS-spectra te detecteren.

Dit artikel presenteert een protocol om chemische kaarten van heterogene monsters te produceren met behulp van multiplex SRS-microscopie. Een schema van de in dit protocol gebruikte SRS-microscoop is weergegeven in figuur 1 en elders in detail beschreven 25,26,27. Kortom, een commerciële modus-vergrendelde Yb fiberlaser, die 140 fs pulsen produceert gecentreerd op 1040 nm, met 10 W gemiddeld vermogen en een herhalingsfrequentie van 80 MHz, drijft de breedband SRS-microscoop aan. Een polariserende bundelsplitser (PBS) scheidt de fundamentele bundel in twee takken. Om de smalband stokes pulsen te produceren, wordt een tak met 4 W van de fundamentele bundel naar een etalon gestuurd die een smalbandige (≈15 ^cm-1) bundel genereert, die vervolgens wordt gemoduleerd op 1,6 MHz met een akoestische optische modulator (AOM). De resterende fractie met 6 W van de fundamentele bundel wordt frequentieverdubbeld met een 2,8 mm dik lithiumtriboraat (LBO) kristal, gesneden voor type-I fase matching (θ = 90°, φ = 13,8°). De resulterende tweede harmonische generatie bij 520 nm reist naar een X-gevouwen holte om een optische parametrische oscillator (OPO) te pompen, een apparaat dat een 3,0 mm dik LBO-kristal (type I fase matching, θ = 90 °, φ = 9,8 °) als actief medium gebruikt om een breedband optische straling af te geven die niet instelbaar is binnen het spectrale gebied van 680-910 nm (figuur 2). Deze breedbandpulsen dienen als de pomp in de SRS-experimenten en verspreiden zich naar een prismacompressor om de dispersie-effecten veroorzaakt door het microscoopobjectief te precompenseren.

Na de compressiefase produceert een λ/2-golfplaat, gecombineerd met een YVO₄ birefringentplaat, twee orthogonaal gepolariseerde replica’s waarvan de elektronische aftrekking aan het detectievlak het geluid van de breedbandpomp annuleert. Een dichroïsche spiegel combineert de pomp en Stokes-stralen en stuurt ze naar een rechtopstaande microscoop. Een water-immersie objectief met een numeriek diafragma (NA) van 1,27 richt het licht op het monster, terwijl een olie-onderdompeling objectief met een NA van 1,4 het verzamelt. Vóór de detectiefase verwijdert een kortdoorlaatfilter (SPF) de gemoduleerde Stokes, terwijl een diffractierooster dat in Littrow-configuratie werkt, de verzonden breedbandpomp dispergeert. Een tweede PBS₂ scheidt de pompreplica’s en een lens richt ze op twee fotodiode-arrays. De signalen van deze fotodiode-arrays worden elektronisch afgetrokken en verzonden naar een zelfgebouwde meerkanaals-lock-in versterker (M-LIA). Het gedemoduleerde signaal wordt vervolgens genormaliseerd door de gelijkstroom (DC) metingen van een van de fotodiode-arrays, waardoor het SRL-spectrum wordt geproduceerd.

Als voorbeeldig experiment stellen we mengsels van verschillende bekende Raman-strooiers in beeld, elk met een uniek Raman-spectrum. Het protocol begint dus met het beschrijven van hoe de referentiemonsters moeten worden voorbereid. Terwijl we SRL detecteren, blijven we uitleggen hoe we smalband stokespulsen kunnen verkrijgen en de optische bron kunnen instellen die de breedband (≈250 ^cm-1) pomppulsen levert, namelijk de zelfgebouwde OPO. Het protocol toont de uitlijning en optimalisatie van de optische bundels en beschrijft kritische parameters zoals het vermogen en de spectra van de smalband Stokes en de breedbandpomp. Het protocol beschrijft in detail het optische pad van de breedbandpomp omdat het speciale optische elementen vereist. Het legt ook uit hoe de spatiotemporale overlap tussen pomp-Stokes-pulsen kan worden gevonden en toont een praktische manier om de relatieve intensiteitsruis (RIN) te bepalen, wat op zijn beurt helpt bij het definiëren van de beste modulatiefrequentie voor SRS-experimenten. Vervolgens leggen we het werkingsprincipe en de kalibratie van de detectieketen uit. Ten slotte toont het protocol het data-acquisitieproces, chemometrie en beeldverwerkingspijplijn.

Protocol

1. Monstervoorbereiding OPMERKING: Dit protocol beschrijft het ophalen van de concentratiekaarten en karakteristieke SRS-spectra van chemisch heterogene mengsels. Om het monster te bereiden, extraheert u 2 μL uit een waterige suspensie van polymethylmethacrylaat (PMMA) microbeads (zie de tabel met materialen) en giet u de 2 μL-fractie op een microscoopdeksel. Extraheer met een schone pipetpunt 2 μL uit een waterige suspensie van polystyreen (PS) microbeads en combineer dit met de PMMA-suspensie op de coverslip. Meng met behulp van een pipetpunt de suspensie voorzichtig en laat deze 24 uur drogen.OPMERKING: Het is belangrijk om de concentratie van de microbead-suspensies zorgvuldig af te stemmen om onevenredige hoeveelheden van de microbeads op het monsteroppervlak te voorkomen. De diameter van de PS- en PMMA-kralen is respectievelijk 10 en 6 μm. Deze afmetingen maken het mogelijk om de hoge ruimtelijke resolutie van de microscoop te demonstreren zonder afbreuk te doen aan de generatie-efficiëntie van SRS. Voeg bovenop de platte, witte laag kralen toe die zal verschijnen wanneer het water uitdroogt, voeg 20 μL dimethylsulfoxide (DMSO) en vervolgens 20 μL pure olijfolie toe. Breng nagellak aan op de randen van een tweede microscoopdeksel. Plaats de dekplaat op het mengsel, met de nagellak naar beneden gericht, waarbij u voldoende druk uitoefent om het af te dichten. Laat het drogen.OPMERKING: Figuur 3 toont voorbeeldige resultaten verkregen met deze stappen. Indien goed afgesloten, moet dit monster maximaal drie maanden meegaan. 2. Optimaliseren van pomp en Stokes balken Schakel de laser in en laat deze het thermisch evenwicht bereiken. Pas een negatieve groepsvertragingsdispersie (GDD) van GDD = -6.000 fs2 toe op de fundamentele bundel.OPMERKING: Deze GDD-waarde is van cruciaal belang voor het succesvol besturen van de OPO en is optimaal voor deze installatie, maar zal waarschijnlijk variëren in verschillende systemen. Negatieve GDD kan worden geïntroduceerd via roosterparen, prismacompressoren of pulsvormers op basis van ruimtelijke lichtmodulatoren28. Splits de fundamentele laser met een polariserende beamsplitter (PBS1) in twee takken. Om de smalband stokes pulsen te krijgen, leid je een tak met 4 W naar een etalon. Draai de etalon lichtjes totdat een smalle spectraallijn wordt verkregen en gecentreerd op de piek van het pulsspectrum (zie de rode curve in figuur 2).OPMERKING: Deze etalon heeft een effectieve finesse van 29 en een vrijspectraal bereik van 29,8 nm bij 1.040 nm. Om gemoduleerde Stokes-pulsen te verkrijgen, stuurt u de smalbandbundel naar een acousto-optische modulator.OPMERKING: Zoals weergegeven in figuur 4A, ervaart de eerste-orde diffracted beam 100% modulatie, terwijl de nul-orde slechts 50% ervaart. Daarom verdient het de voorkeur om de eerste orde te gebruiken om te voorkomen dat het monster wordt verlicht met een sterke ongemoduleerde bundel die fotoschade van het monster kan veroorzaken zonder enig SRS-signaal te genereren. Om de modulatie-efficiëntie te optimaliseren, wijzigt u de afstand tussen lenzen f1 en f2 (figuur 4B). Meet de gemoduleerde bundel met een fotodiode en noteer het profiel met een oscilloscoop. Wijzig de afstand tussen f1 en f2 totdat het maximale contrast is bereikt tussen de amplitude en de basislijn van de oscilloscoopmetingen.OPMERKING: Dit paar lenzen werkt niet als een collimator, maar creëert een effectieve brandpuntsplek bij het kristal van de AOM. Plaats een derde lens f3 om de taille van de Stokes-bundel te finetunen, waardoor het interactievolume op het brandpuntsvlak van de microscoop kan worden gewijzigd en bijgevolg het SRS-signaal kan worden geoptimaliseerd.OPMERKING: De Stokes-bundel werd in dit protocol gemoduleerd op 1,6 MHz. Richt de resterende 6 W van het optische vermogen van de fundamentele bundel op een lithiumtriboraat (LBO) kristal (LBO1, θ = 90°, φ = 13,8°) om de basisbundel te verdubbelen door middel van de tweede harmonische generatie (SHG) (Figuur 5A). Om de SHG-efficiëntie te maximaliseren, draait u het kristal lichtjes en varieert u de φ hoek (figuur 5B). Optimaliseer LBO1 om ten minste 2,5 W SHG te krijgen. Pas de φ hoek van LBO2 aan om de opwekkingsefficiëntie van de signaalbundel te maximaliseren.OPMERKING: De brandpuntsafstanden van lenzen f1, f2 en f3 zijn zorgvuldig gekozen om de SHG-bundel in de modus af te stemmen op de OPO-holte. De brandpuntsafstanden van deze lenzen zullen dus variëren in verschillende opstellingen. Vanwege de resterende dispersie in de OPO-holte veroorzaakt een lichte verandering in de holtelengte een verschuiving van het spectrum van de signaalbundel. Pas de holtelengte aan om een pompspectrum te krijgen dat, samen met de smalband Stokes op 1.040 nm, een frequentie-detuning kan produceren binnen 1.373-5.090 cm-1. Dit bereik omvat de trillingen in het CH-stretching spectrale gebied (2.800-3.050 cm-1). Zie de blauwe spectra in figuur 2. Om de dispersie-effecten veroorzaakt door het excitatiemicroscoopobjectief te compenseren, stuurt u de breedbandpomp naar een prismacompressor. Voer de pomp in prisma A door de top en leid de gedispergeerde pomp naar de top van prisma B. Definieer de hoeveelheid negatieve dispersie die nodig is en stel vervolgens de afstand tussen de apices L van de prisma’s dienovereenkomstig in.OPMERKING: Figuur 6 toont de rangschikking van de prisma’s29. In dit geval werd de compensatie voor GDD vastgesteld ≈ -12.800 fs2; vandaar L = 1,26 m. Gebruik Brewster-gesneden prisma’s. Zorg ervoor dat de polarisatie van de pompstraal binnen de driehoekige vlakken van de prisma’s ligt (ongepolijste boven/onderzijden). Zorg ervoor dat de invalhoek θin van de pompbundel overeenkomt met de Brewster-hoek. Zorg ervoor dat de uitgang van prisma A evenwijdig is aan de ingangszijde van prisma B. Om de GDD van de te compenseren breedbandpuls te schatten, meet u het SRS-signaal op een enkele golflengte λ1 en registreert u de tijdsvertraging τ1 tussen pomp-Stokes waarbij de maximale SRS(λ1) wordt verkregen. Herhaal deze procedure voor een tweede golflengte λ2 en registreer opnieuw de tijdsvertraging τ2 waarbij de SRS(λ2) maximaal was.OPMERKING: Omdat de GDD wordt gedefinieerd als de afgeleide van de groepsvertraging met betrekking tot de hoekfrequentie, maken de bovengenoemde metingen de schatting van de GDD van de breedbandbundel mogelijk (Eq [1]).(1) Stel met behulp van een λ/2 golfplaat de polarisatie van de pompbundel in op 45°. Leid de gepolariseerde pomp naar een YVO4-plaat met een lengte van 13,3 mm en stel de snelle as van dit birefringente kristal verticaal in.OPMERKING: Bij het reizen door de YVO4-plaat worden de pomppulsen gesplitst in twee orthogonaal gepolariseerde replica’s die zich collineair voortplanten, maar een vertraging Δt ≈ 10 ps ertussen houden. Deze vertraging is een functie van de dikte en de brekingsindexen van het birefringente kristal. Hierna zullen de pompreplica’s met dezelfde polarisatietoestand van de Stokes-pulsen “signaal” worden genoemd, terwijl die met een orthogonale toestand als “referentie” worden genoemd. De details van deze techniek, inline gebalanceerde detectie genoemd, zijn eerder beschreven30. Combineer de pomp- en Stokes-balken met een dichroïsche spiegel en lijn ze voorzichtig uit met behulp van een paar fluorescerende gaatjes, zodat beide zich collineair voortplanten. Demp de bundels en gebruik een lens om ze scherp te stellen op een snelle (minstens 100 MHz bandbreedte) fotodiode. Blokkeer de pomp en meet enkele Stokes-pulsen met een digitale oscilloscoop met hoge bandbreedte. Gebruik het triggersignaal van de laser als klokbron voor de metingen van de oscilloscoop. Bepaal de gemiddelde waarde waarbij de fotodiodespanning zijn maximum bereikt. Blokkeer de Stokes-bundel en herhaal deze procedure voor de pomppulsen. Verhoog of verlaag het optische pad van de pomp (Stokes) bundel totdat de pulsen ongeveer op hetzelfde moment aankomen als de Stokes (pomp) pulsen.OPMERKING: Dit moet een precisie van maximaal enkele millimeters garanderen bij het afstemmen van het optische padverschil tussen de twee armen. Verwijder de fotodiode en plaats een niet-lineair kristal met een geschikte snijhoek voor sum-frequency generation (SFG) tussen pump-Stokes fotonen.OPMERKING: Het hier gebruikte niet-lineaire kristal werd gesneden voor type I fase matching, θ = 90°, φ = 9,8°. De optische as van het niet-lineaire kristal moet evenwijdig zijn aan de polarisatie van de Stokes en signaalpulsen. Maak de pomp/Stokes-balken iets noncollineair en verplaats de vertragingslijn tot de SFG, een signaal dat zich door fasematching tussen de SHG’s van de pomp en Stokes-balken bevindt. Als het signaal niet wordt gevonden, controleer dan de ruimtelijke overlap van de twee balken op het kristal.OPMERKING: De SFG is blauw verschoven en moet gemakkelijk zichtbaar zijn voor het blote oog. Plaats in geval van onverwachte problemen een laagdoorlaatfilter om de pomp en Stokes en hun respectieve SHG’s te verwijderen en meet de SFG met een spectrometer (figuur 7A). Zoek de tijdvertraging waarbij de SFG zijn maximale intensiteit bereikt, een waarde die de ideale spatiotemporale overlap bepaalt die nodig is voor niet-lineaire signaalgeneratie, en fixeer de vertragingslijn daar (figuur 7B). Meet de bundelprofielen met een gekalibreerde camera. U kunt ook een infraroodkaart gebruiken en de diameters met het oog schatten. Gebruik twee telescopen, een voor de pomp en een andere voor de Stokes-bundel. Probeer met deze telescopen de straaldiameters af te stemmen op de achterste opening van het excitatieobjectief.OPMERKING: Deze procedure garandeert de maximale ruimtelijke resolutie van de opstelling. Zodra het SRS-signaal is verkregen, gebruikt u de telescoop op de pompstraal om de diameter aan te passen, waarbij het Rayleigh-bereik en bijgevolg het interactievolume op de focus van de microscoop worden gevarieerd. Stop wanneer de maximale SRS is bereikt. Gebruik een fotodiode om de intensiteit van de pompbundel (Stokes) te meten en bereken, met de responsiviteit van de fotodiode, het gemiddelde vermogen dat van invloed is op het actieve gebied van de detector. Als u een fotodiode met hoge bandbreedte gebruikt, sluit u een elektronisch laagdoorlaatfilter aan om alleen de constante of DC-component te krijgen. Om δP(f) te meten, sluit u de uitgang van een fotodiode met hoge bandbreedte (koppel het laagdoorlaatfilter los) aan op de ingang van een lock-in versterker. Sla de lock-in-uitgang op verschillende demodulatiefrequenties op en gebruik de responsiviteit van de fotodiode om van V naar W te converteren.OPMERKING: Commerciële lock-in versterkers hebben ingebouwde gereedschappen om δP (f) te meten (bijv. Zurich Instruments ingebouwd in LabOne a Frequency Sweeper31). Schakel na het meten van het RIN van de stralen de laser uit en meet de elektronische ruis (d.w.z. het RIN berekend zonder enig licht op detectoren).OPMERKING: Op voorwaarde dat het RIN wordt beperkt door de laserfluctuaties en niet door de schotruis, zal deze donkere meting helpen bij het diagnosticeren van de instrumentatie die voor de metingen wordt gebruikt; als de elektronische ruis even hoog is als het RIN van de laser, kan dit niet worden gebruikt om het RIN van de laser te meten; ultralow-noise-versterkers moeten mogelijk worden gebruikt om de elektronische ruis te verminderen. Als de RIN wordt beperkt door de schotruis en niet door de laserfluctuatie, schijn dan meer optisch vermogen op de detector. Zie figuur 8. 3. Het instellen van de spectrale detectie voor SRS-beeldvorming Leid de pomp en Stokes-stralen naar de microscoop. Plaats het monster dat in sectie 1 wordt besproken en zoek een gebied zonder kralen om de pompstraal uit te lijnen. Meet met behulp van een camera het gereflecteerde profiel van de Stokes (pomp) straal terwijl u de pomp blokkeert (Stokes). Pas de posities van de laservlekken aan met de spiegels vlak voor de microscoop.OPMERKING: Om de hoogste SRS-generatie te krijgen, moeten ze elkaar perfect overlappen. Figuur 9 toont (A) de pomp, (B) Stokes en (C) beide bundels perfect overlapt op het brandpuntsvlak van de microscoop. Maak de excitatie- en verzameldoelstellingen confocaal.OPMERKING: Het gebruik van oneindig gecorrigeerde objectieven betekent dat het scherpstellen van de pomp op het monstervlak resulteert in een gecollimeerde straal bij de achterste opening van het verzamelobjectief. Plaats een kortdoorlaatfilter om de gemoduleerde Stokes te verwijderen en leid de pompstraal naar het rooster. Plaats een lens achter het rooster om de gedispergeerde straal op de detectoren te richten.OPMERKING: De roostervergelijking zal helpen bij het bepalen van de lineaire dispersie (d.w.z. hoeveel nm per mm op het detectorvlak met een lens van een bepaalde brandpuntsafstand f32). De roostervergelijking relateert de groef periodiciteit d van het rooster, de invalshoek α, de diffractiehoek β, de diffracted golflengte λ en diffractievolgorde m (Eq [2]). (2) Meet voor een gebalanceerde detectie het spectrum van de referentie en de signaalreplica’s die zich langs de pompbundel voortplanten.OPMERKING: Het ruimtelijke profiel van de pompbundel na het rooster is een lijn die bestaat uit de verschillende spectrale componenten van de breedbandpomp over de lengte ervan. Elke spectrale component van de pompleiding wordt op afstand f scherpgesteld door een bolvormige lens (zie stappen 3.1-3.2). Om te voorkomen dat de gedispergeerde pomp wordt geknipt, plaatst u de bolvormige lens zo dicht mogelijk bij het rooster. Plaats een PBS direct na de bolvormige lens om de pompreplica’s te scheiden.OPMERKING: Hier werd een polariserende kubusbundelsplitser gebruikt omdat dit type polarisator de polarisatie van de pompstraal niet vervormt. Het scheidt ook effectief de verschillende pompreplica’s en kan groot genoeg zijn om te voorkomen dat de breedbandpomp wordt geknipt. De PBS reflecteert de signaalreplica (s-gepolariseerd) en verzendt de referentiereplica (p-gepolariseerd). Met een paar stuurspiegels, leid het signaal en verwijs naar hun respectieve detectoren (figuur 1).OPMERKING: In de ideale gebalanceerde configuratie moeten de signaal- en referentiereplica’s hetzelfde optische vermogen hebben. Om de ruis in de pompstraal te verwijderen, correleert u de kanalen van de fotodiode-array die het signaal meet met hun tegenhangers in de referentiedetector. Zorg er daarom voor dat de nulfotodiode van het signaal en referentiefotodiode arrays het optische vermogen van dezelfde spectrale component van het signaal en referentiereplica’s meten.OPMERKING: Figuur 8 toont voorbeeldige RIN-spectra. Om de spectrale matching tussen de twee fotodiode-arrays te garanderen, plaatst u een kleine spleet of een iris tussen het rooster en de PBS om de gedispergeerde pomp ruimtelijk te filteren. Clip alle spectrale componenten van de pompreplica’s op één na om de uitgezonden stralen te centreren op de nth detector van de referentie- en signaalfotodiode-arrays. Gebruik de genoemde stuurspiegels om de correlatie van de verschillende detectiekanalen aan te passen. Start op dit punt SRS-microscopie. Om dit te doen, moduleert u de Stokes, raster-scant u het monster en verkrijgt u de modulatieoverdracht op het pompspectrum (ΔI) met het bijbehorende DC-spectrum (I) om het genormaliseerde SRS-spectrum (ΔI / I) van elke pixel te krijgen. Maak driedimensionale matrices waarvan de rijen (x) en kolommen (y) de gescande posities van het monster bevatten. Sla op elke vector (z) orthogonaal aan het x-y-vlak een SRS-spectrum op.OPMERKING: Figuur 12 toont de structuur van SRS hyperspectrale gegevens. Stel het vermogen van de Stokes-bundel in op 65 mW en dat van de breedbandpompbundel op 20 mW. Stel een ideale integratietijd in voor de experimenten.OPMERKING: Hier was de integratietijd 44 μs; de pixeltijd was echter 1 ms vanwege de trage piëzoscanner. 4. Chemometrie van hyperspectrale SRS-gegevens Gebruik multivariate curveresolutieanalyse om de verschillende chemische bestanddelen van het monster te ontwarren. Download de GUI via de link in Tauler, de Juan en Jaumot33.OPMERKING: Hier werd het Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS) MATLAB-programma ontwikkeld door Tauler en collega’s gebruikt34,35. Voor toepassingen van MCR-ALS op SRS-gegevens, zie 36,37; voor gedetailleerde discussies over het algoritme, zie 38. Hervorm in MATLAB de SRS hyperspectrale datakubus in een matrix D met zijn rijen die de SRS-spectra bevatten. Stel dat de ongevouwen SRL-hyperkubus D een lineaire combinatie is van de concentratie C en de spectrale profielen S van de chemische bestanddelen van het monster (d.w.z. D = CS T + E, waarbij E een matrix is die de experimentele fout bevat en het superscript T matrixtransponeren aangeeft). Verkrijg de belangrijkste componenten van de gegevens om C en S te scheiden. Zoals a priori bekend is dat het in sectie 1 besproken monster vier soorten bevat, namelijk DMSO, Olijfolie, PMMA en PS, configureert u het programma om te zoeken naar vier soorten plus een andere om rekening te houden met het achtergrondgeluid. Als er een ander monster is met een hoger of lager aantal soorten, configureert u het programma dienovereenkomstig.OPMERKING: Het programma maakt een enkelvoudige waarde decompositie van de spectrale gegevens, met behulp van hen als de eerste gissingen van de zuivere spectra S. U kunt het programma ook voeden met een matrix met de bekende spectrale sporen (bijvoorbeeld de spontane Raman-spectra van de stoffen).OPMERKING: Met behulp van de eerste schattingen van de zuivere spectra berekent het programma C = DS (STS) −1 en ST = (CTC) −1CTD. De nieuwe waarden van C en S worden geoptimaliseerd met een wisselend kleinste-kwadratenalgoritme. Aangezien SRS een niet-negatief signaal is, beperkt u het wisselende algoritme voor kleinste kwadraten om alleen positieve waarden te leveren.OPMERKING: De geoptimaliseerde C en S maken het mogelijk om een nieuwe matrix D*= CST te construeren, een dataset die het programma vergelijkt met de oorspronkelijke gegevens D. Het programma itereert deze stappen automatisch totdat het verschil tussen D* en D kleiner is dan een willekeurige drempelwaarde die kan worden gedefinieerd. Plot C en S om chemische beelden en de karakteristieke spectra van de chemische bestanddelen van het monster te verkrijgen.

Representative Results

Figuur 3 toont voorbeeldige resultaten verkregen met behulp van dit protocol met PS, PMMA en olijfolie. Deze rotatie van LBO1 zal de brekingsindex veranderen die door het SHG-veld wordt ervaren, waardoor de fasesnelheid direct wordt gewijzigd. Wanneer de fasesnelheid van het SHG-veld overeenkomt met die van de niet-lineaire polarisatie geïnduceerd in LBO1, zullen het niet-lineair gegenereerde veld en de niet-lineaire polarisatie in fase zijn, wat leidt tot intense SHG-straling. Met andere woorden, het aanpassen van de φ hoek van LBO1 zal de gebruiker in staat stellen om de ideale fase-matchingconditie voor SHG te bereiken. Omdat hier een Type I fase matching kristal wordt gebruikt, zal de polarisatie van de SHG-bundel orthogonaal zijn ten opzichte van die van de fundamentele bundel (figuur 5B). Figuur 8 toont het RIN van de optische bronnen die in dit protocol worden gebruikt en de shot-noise limiet, die een gevolg is van de kwantumaard van elektronen en fotonen die een fundamentele limiet stelt aan de laserruis. De RIN met shotruisbeperkte wordt berekend met zoals aangegeven door Eq (3). (3) Waarbij h de constante van Planck is en ν de optische frequentie. De schotruis biedt dus nuttige richtlijnen voor het elektronica-ontwerp. Figuur 11A en figuur 11C tonen voorbeeldige gegevens van gebalanceerde en onevenwichtige spectra. Uiteraard hebben de effecten van gebalanceerde detectie invloed op de eindresultaten van de experimenten, namelijk de chemische kaarten. Figuur 11B en figuur 11D tonen samengestelde beelden in respectievelijk de onevenwichtige en evenwichtige omstandigheden. Het succesvol implementeren van het beschreven protocol zal helpen bij het identificeren en lokaliseren van de verschillende chemische bestanddelen van een heterogeen monster en het extraheren van hun karakteristieke SRS-spectra. Het onderwerpen van de hyperspectrale gegevens van figuur 12 aan chemometrische analyse geeft figuur 13. Figuur 13A toont een samenstelling van de concentratiekaarten van de verschillende chemische bestanddelen van het monster, terwijl figuur 13B hun karakteristieke SRS-spectra toont. Merk op dat de gegevens in figuur 13A de gebruiker niet alleen in staat stellen om de verschillende bestanddelen van het monster gemakkelijk te identificeren, maar ook om meer kwantitatieve analyses uit te voeren. Door bijvoorbeeld de concentratiekaarten te gebruiken, konden we het gemiddelde van de fractionele concentratie van elke chemische soort berekenen: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS en 22% olijfolie. Figuur 1: Schema van de breedband SRS-microscoop die in dit protocol wordt gebruikt. Afkortingen: PBSx = polariserende beamsplitter; SHG = tweede harmonische generatie module; OPO = optische parametrische oscillator; AOM = acousto optische modulator; SPF = kortdoorlaatfilter; M-LIA: Meerkanaals lock-in versterker; DM = dichroïsche spiegel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Spectra van de afstembare breedbandpomp (blauw) en de smalbandige (rode) Stokes-balken. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur. Figuur 3: Brightfield-afbeelding van het chemisch heterogene monster. Merk op dat conventionele microscopie het niet mogelijk maakt om de verschillende bestanddelen te onderscheiden. Schaalbalk = 100 μm. Afkortingen: PS = polystyreen; PMMA = polymethylmethacrylaat; DMSO = dimethylsulfoxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Modulatie van de smalband stokes pulsen. (A) Het transparante blauwe spoor toont de 0e diffracted bundel, terwijl de zwarte de overeenkomstige1e orde toont. (B) Optische opstelling voor het optimaliseren van de modulatie-efficiëntie van de1e orde diffracted beam en het finetunen van de spotgrootte van de Stokes-bundel voordat het excitatiedoel wordt bereikt. Afkortingen: AOM = acousto optic modulator; fx = brandpuntsafstand van lens X. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Niet-lineaire optische processen die nodig zijn om de OPO aan te sturen. (A) Geometrie van de SHG-interactie. Twee fundamentele fotonen bij ω1 brengen het materiële systeem naar een hoogenergetisch virtueel niveau, van waaruit het materiële systeem naar de grondtoestand springt en een foton uitzendt bij ωSHG. (B) Schema van het SHG-experiment. (C) Een schema van de SHG- en OPO-opstellingen. (D) Geometrie van de DFG-interactie. Een ωSHG-foton wordt gesplitst in de signaalfotonen (ωSignaal) en idler (ωIdler). Een versterking van de signaalbundel wordt bereikt door de signaalfotonen terug te voeren en ze in de holte te laten resoneren. (E) Schema van het DFG-experiment. Afkortingen: SMx = bolvormige spiegel (R = 75 mm); OPO = optische parametrische oscillator; SHG = tweede harmonische generatie module; DFG = verschilfrequentie generatie; LBO = lithiumtriboraat; OC = oliecondensor; DM = dichroïsche spiegel; fx = brandpuntsafstand van lens X. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Geometrie van de prismacompressor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Het genereren van somfrequenties om de spatiotemporale overlap te optimaliseren. (A) SFG tussen de pomp en Stokes en hun respectieve SHG die op een scherm ingrijpt. Hier richtte een lens de pomp en de Stokes-stralen op het kristal, terwijl een laagdoorlaatfilter ze verwijderde. (B) Intensiteit van de SFG tussen pomp en Stokes als functie van tijdsvertraging. Stel de tijd nul van de SRS-instelling in op de positie die de SFG maximaliseert. De asymmetrie van de kruiscorrelatie in B is te wijten aan het temporele profiel veroorzaakt door de etalon op de Stokes-bundel. Afkortingen: SFG = sum-frequency generation; SHG = tweede harmonische generatie module; SRS = stimuleerde Raman verstrooiingsspectroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: RIN-spectra. De in het groen gemarkeerde band toont het beste spectrale gebied voor de SRS-experimenten. Het moduleren van de Stokes-straal op elke frequentie binnen deze band garandeert dat de effecten van de laserruis op het SRS-signaal zo laag mogelijk zullen zijn. Afkortingen: RIN = relatieve intensiteit ruis; SRS = stimuleerde Raman verstrooiingsspectroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 9: Balkprofielen. (A) Pomp, (B) Stokes en (C) pomp en Stokes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 10: Veronderstelde geometrie voor een dispersierooster en een fotodiode array detector. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 11. De effecten van gebalanceerde detectie. Effecten op spectra (A, C) en chemische beelden (B, D). De composieten in panelen (B) en (D) zijn de eindresultaten van de experimenten (d.w.z. na chemometrische analyse van hyperspectrale gegevens. Zie protocolsectie 4 voor meer informatie). Schaalbalken = 10 μm. Afkorting: SRS = gestimuleerde Raman verstrooiing spectroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 12: Een representatieve SRS-hyperkubus verkregen met breedband SRS-microscopie. Het x-y-vlak slaat de coördinaten van de gescande posities op, terwijl elke vector langs z een SRS-spectrum registreert. Afkorting: SRS = gestimuleerde Raman verstrooiing spectroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 13: Chemometrische analyse van hyperspectrale SRS-gegevens. (A) Samenstelling van de concentratiekaarten van de verschillende bestanddelen van het monster. (B) Karakteristieke spectra van de chemische soort. In beide panelen geel: olijfolie, blauw: DMSO, cyaan: PS en oranje: PMMA. Schaalbalk = 20 μm (A). Afkortingen: SRS = gestimuleerde Raman verstrooiing spectroscopie; PS = polystyreen; PMMA = polymethylmethacrylaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Breedband SRS-microscopie is een krachtige beeldvormingstechniek die authentiek chemisch contrast biedt om de chemische bestanddelen van een heterogeen monster te identificeren en te ontwarren. Het potentieel van dit analytische instrument kan gunstig zijn voor verschillende onderzoeksgebieden, variërend van materiaalkunde tot histopathologie. Het nadeel van breedband SRS-microscopie is het feit dat het technisch veeleisend is; de experimentalist vereist niet alleen kennis van breedbandlaserbronnen, maar moet ook de laserpulsen manipuleren om efficiënt SRS te genereren, een signaal dat op zijn beurt moet worden gemeten met geavanceerde detectieschema’s. Dit artikel presenteert een protocol dat een workflow beschrijft om chemische kaarten van gemengde chemische verbindingen te produceren met behulp van een multiplex breedband SRS-microscoop. Hoewel het beschreven werk triviaal kan zijn voor sommige laserfysici en niet-lineaire microscopisten, is dit misschien niet het geval voor lezers die geïnteresseerd zijn in de voordelen van breedband SRS-microscopie waarvan de wetenschappelijke kennis zich buiten deze domeinen bevindt. Daarom wilden we elke stap gedetailleerd beschrijven om het brede publiek te begeleiden dat geïnteresseerd is in breedband SRS-microscopie.

Het protocol bij de hand begon met het laten zien hoe een eenvoudig maar spectroscopisch rijk monster te bereiden dat bestond uit verschillende sterke en bekende Raman-strooiers. We bespraken hoe we de breedbandpomp en smalband Stokes-balken konden verkrijgen die nodig zijn om een SRS-microscoop op te zetten. Figuur 5C toont een schema van de SHG- en OPO-opstellingen. Merk op dat lens f₁ de fundamentele straal op LBO₁ richt om de SHG te genereren, terwijl een dichroïsche spiegel de SHG-straling reflecteert en de resterende fundamentele straal doorgeeft. Een tweede lens f₂ collimeert de SHG-bundel. Als f₂> f₁ wordt de SHG-bundel uitgebreid met een factor gelijk aan f₂/f₁. Een derde lens f₃ richt de uitgebreide SHG-bundel op een tweede Type I LBO-kristal (LBO₂) gesneden op θ = 90° en φ = 29,0°. Door LBO₂ te pompen met de eerder genoemde SGH (520 nm), zal straling binnen het bereik van 680-910 nm uit LBO₂ komen door middel van verschilfrequentiegeneratie (DFG), waardoor twee bundels worden geproduceerd: het signaal en idler²⁷ (figuur 5D, E). De laatste wordt weggegooid, terwijl de eerste wordt versterkt in de OPO-holte om de pomppulsen af te leveren die in de SRS-experimenten worden gebruikt. De pomp van de OPO bij 520 nm, namelijk de SHG-bundel, moet niet worden verward met de pomp van de SRS-experimenten (d.w.z. de signaalbundel van de OPO).

Het contrast in SRS-microscopie komt voort uit een niet-lineair signaal dat wordt gegenereerd op de brandpuntsplek van de microscoop, een signaal dat vereist dat een groot aantal fotonen op een bepaald moment in het monstervlak wordt beperkt. Deze fotonenopsluiting wordt bereikt met een microscoopobjectief met hoog numeriek diafragma (NA), een reeks lenzen die ook de ruimtelijke resolutie van het systeem bepaalt: hoe hoger de NA, hoe hoger de ruimtelijke resolutie. Hoge NA-objectieven zijn echter dicht opeengepakt met glas, wat positieve GDD introduceert voor gepulseerde straling, een frequentie-tjirp die uiteindelijk het temporele profiel van de pulsen^{verbreedt 39}. De GDD die door het microscoopobjectief wordt geïntroduceerd, kan dus de duur van de breedbandpomppulsen verlengen, waardoor deze zelfs langer wordt dan de Stokes-temporele envelop en de effectieve, toegankelijke bandbreedte van het Raman-signaal wordt verminderd. Bovendien zou deze verbreding ook kunnen leiden tot een vervorming van het spectrale profiel van het gemeten SRS-spectrum.

In CARS ontstaat het spectroscopisch relevante signaal op golflengten die verschillen van die van de excitatievelden. Een eenvoudige fotomultiplicatorbuis of CCD-camera (charge-coupled device) kan worden gebruikt om het CARS-signaal op tijd te integreren, waarbij duizenden pulsen worden samengevat om de laserruis te berekenen. In plaats daarvan verschijnt het SRS-signaal als een zwakke modulatieoverdracht ingebed in een sterke en fluctuerende laserachtergrond. Omdat deze modulatie zwak is, kan de laserruis deze gemakkelijk overweldigen, waardoor zowel de beeldsnelheid als de gevoeligheid van de SRS-microscoop worden verminderd. Daarom is het vóór de beeldvorming noodzakelijk om de relatieve intensiteitsruis (RIN) te meten om te bepalen of de laser geschikt is voor snelle SRS-beeldvorming en om de modulatiefrequentie met de laagste ruis te selecteren. Het RIN wordt gedefinieerd als de spectrale dichtheid van het ruisvermogen [δP(f), met W²/Hz-eenheden] van de laser, genormaliseerd met het gemiddelde optische vermogen ()^40,41. Met andere woorden, het RIN beschrijft de genormaliseerde laserfluctuaties op verschillende frequenties (Eq [4]).

(4)

Het RIN is dus een parameter van het SRS-systeem die het ideale modulatiefrequentiebereik voor de experimenten bepaalt. De olijfbalk in figuur 8 toont bijvoorbeeld het ideale modulatiefrequentiebereik voor SRS-beeldvorming. In het geval van smalband SRS moet de gebruiker de RIN van zowel de pomp als de Stokes meten om te kiezen welke bundel moet worden gemoduleerd om optimale prestaties te bereiken. Merk bijvoorbeeld op uit figuur 8 dat de Stokes-bundel een iets hogere RIN heeft dan de pomp, wat impliceert dat de SRG-metingen luidruchtiger zouden uitpakken dan hun SRL-tegenhangers. In het geval van breedband-SRS is de bundel die moet worden gemoduleerd de smalbandbundel.

De hoekverdeling D van het rooster drukt de diffractiehoek uit als functie van de golflengte en wordt gedefinieerd als de afgeleide van de roostervergelijking. Voor de Littrow-configuratie wordt de hoekverdeling gegeven door Eq (5).

(5)

Om Eq (5) te krijgen, gingen we uit van α = β, losten Eq (2) op voor m/d en voegden het resultaat toe in dβ/ dλ. Merk op dat in de Littrow-configuratie β = ^sin-1(mλ/2d). Binnen de benadering van de kleine hoek is de verandering in positie langs het spectrum fdβ ≈ dl (figuur 10). Door dβ in Eq (5) in te voegen, kunnen we dus de lineaire dispersie berekenen, een grootheid met eenheden van nm ^mm-1 met behulp van Eq (6):

(6)

Voor een diffractierooster in de Littrow-configuratie met 1.851,85 groeven/mm, d = 540 nm. Als we de eerste-orde diffractie van licht gebruiken bij ~789 nm, dan is D = 0,0027 rad nm-1. Met een f = 750 mm lens krijgen we een lineaire dispersie van ≈ 0,5 nm ^mm-1, wat zich vertaalt in ≈ 7,8 ^cm-1 ^mm-1. De brandpuntsafstand van de lens bepaalt dus de “dichtheid” van nm per mm op het detectorvlak: hoe langer de brandpuntsafstand, hoe minder nm per mm wordt verkregen, waardoor de ruimte tussen de spectraallijnen van de breedbandpomp toeneemt. Omgekeerd zal er bij kortere brandpuntsafstanden meer nm per mm op het detectorvlak zijn, waardoor de ruimte die door de verspreide pomp wordt ingenomen, wordt verminderd.

Gebalanceerde detectie verbetert de beeldkwaliteit en gevoeligheid van luidruchtige opstellingen. Volgens de RIN-spectra in figuur 8 en rekening houdend met typische SRS met een amplitude van 1 x 10-5 is de ongebalanceerde signaal-ruisverhouding (SNR) bijvoorbeeld ≈60. Met behulp van gebalanceerde detectie (d.w.z. dicht bij de shot-ruis) is het mogelijk om een SNR van ≈145 te bereiken. Figuur 11 toont spectra en samengestelde beelden onder evenwichtige en onevenwichtige omstandigheden. Uiteraard hebben de effecten van gebalanceerde detectie invloed op de eindresultaten van de experimenten, namelijk de chemische kaarten. Ondersteund door deze resultaten benadrukken we dat gebalanceerde detectie een krachtige techniek is om de schadelijke effecten van laserfluctuaties op de beeldkwaliteit tegen te gaan. Het is vermeldenswaard dat gebalanceerde detectie het meest geschikt is voor luidruchtige lasers, zoals vezeloscillatoren. SRS-microscopen die werken met stille optische lichtbronnen (bijv. Solid-state lasers) vereisen mogelijk geen gebalanceerde detectie.

Het protocol verklaart ook een benadering op basis van niet-lineaire optica om de spatiotemporale overlap tussen de pulsen van deze bundels te vinden. We beschreven de voordelen van het gebruik van de 1^st in plaats van de 0^e diffractie-orde van een AOM als de gemoduleerde Stokes-bundel. Verder werden de schadelijke effecten van dispersie op de SRS-opwekkingsefficiëntie beschreven met suggesties voor manieren om ze te verminderen via een prismacompressor. Daarnaast legt het protocol uit hoe de prisma’s moeten worden uitgelijnd en worden drie kritieke aspecten belicht waarmee rekening moet worden gehouden voor optimale prestaties. We bespreken niet alleen de relevantie van het RIN voor SRS-microscopie, maar laten ook zien hoe het te meten met een lock-in versterker en, met het RIN-spectrum, de beste modulatiefrequentie te definiëren. Met een concreet voorbeeld legt dit artikel uit hoe de roostervergelijking helpt bij het ontwerpen van de detectieketen. Ten slotte illustreert het protocol, met echte SRS-gegevens, de structuur van de SRS-hyperkubus en hoe deze te analyseren met een conventioneel gebruikte wetenschappelijke programmeertaal.

Dit protocol heeft drie kleine beperkingen. Ten eerste bestaat het detectieschema dat in deze bijdrage wordt gebruikt uit een niet-conventionele, meerkanaals lock-in detector die in eigen huis is ontworpen en gebouwd door Sciortino et ^al.26 Zoals eerder^{aangetoond 25}, kan deze detector worden vervangen door een kant-en-klare gebalanceerde fotodiode. Hoewel deze wijziging alleen betrekking heeft op de detector en het protocol vrijwel ongewijzigd laat, moet men met een enkele fotodiode elke spectrale component op de detector scannen in plaats van ze allemaal tegelijk te meten. Ten tweede maakt dit protocol gebruik van inline gebalanceerde detectie, waarvoor verschillende optische elementen in het bundelpad moeten worden ingevoegd. Deze optische elementen verhogen de complexiteit van het systeem en leiden tot verlies van optisch vermogen en pulsverbreding.

Inline gebalanceerde detectie vereist ook dat de twee pompreplica’s door het monster gaan, een situatie die mogelijk niet ideaal is voor lichtgevoelige monsters, zoals levende cellen, of voor sterk birefringente monsters waarin de twee pompreplica’s verschillende optische eigenschappen kunnen ervaren, waardoor de gebalanceerde detectie wordt geannuleerd. Ten derde vertrouwt het protocol op een zelfgebouwde OPO, een apparaat dat mogelijk niet direct beschikbaar is. Alternatieven voor de breedbandspectra die door de OPO worden geleverd, zijn echter het supercontinua van niet-lineaire optische vezels of bulkkristallen. De laatste kon alleen worden gebruikt met lasers met een lage herhalingssnelheid (tot 5 MHz). Dus, zoals bij elk experimenteel ontwerp, heeft het betreffende protocol enkele beperkingen. Ze zijn echter minimaal en brengen het succes van deze aanpak niet in gevaar.

Hoewel hier een referentiemonster wordt beschreven, kan dit protocol met succes chemische soorten in cellen en dierlijke en plantaardige weefsels, zoals cellulose, lipidesoorten of eiwitten, ontwarren, praktische toepassingen vinden in verschillende biochemische zoektochten of als een diagnostisch hulpmiddel in histopathologie. Evenzo kan dit protocol een waardevol hulpmiddel zijn in de materiaalwetenschappen. Volgens dit protocol kan men bijvoorbeeld de moleculaire samenstelling en concentratie van polymere soorten^{42 ondervragen}. Bovendien is deze methodologie compatibel met andere niet-lineaire microscopietechnieken, zoals breedbandmicroscopie op basis van pompsonde⁴³ en heterodyne CARS⁴⁴, viergolfmengprocessen die, net als bij SRS, ook twee excitatielichtbundels en modulatie-overdrachtsmetingen vereisen. Ten slotte kan een deel van de informatie in dit artikel worden toegepast op niet-lineaire beeldvormingstechnieken die niet afhankelijk zijn van modulatieoverdrachtstechnieken, maar die twee of meer gepulseerde laserstralen vereisen, zoals conventionele CARS⁴⁵– en SFG-microscopieën⁴⁶.

Samenvattend beschrijft dit protocol een krachtige methodologie op basis van breedband SRS-microscopie om chemische kaarten en hun karakteristieke SRS-spectra uit chemisch heterogene mengsels te extraheren, waardoor datasets worden geleverd die eenvoudige kwantitatieve gegevensanalyse mogelijk maken. De veelzijdigheid en eenvoud van de methode geven de geïnteresseerde lezer ook de mogelijkheid om deze aan te passen aan verschillende niet-lineaire technieken.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D.P. erkent de financiering van het project CRIMSON van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 101016923 en het Regione Lombardia-project NEWMED onder subsidieovereenkomst nr. POR FESR 2014-2020. G. C. erkent de financiering van het PROJECT GRAPHENE Core3 van de Europese Unie onder nummer 881603. G. C. erkent ook financiering van de King Abdullah University of Science and Technology, Grant Award Number: OSR-2016-CRG5-3017-01.

Materials

Collection objective	Nikon	CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon	Oil immersion objective
Coverslips	Thermo Fisher	043211-KJ	Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Delay line	Physik Instrumente (PI)	M-406.6PD	Precision microtranslation stage, 150 mm travel range
DMSO	Merck	D8418-500ML	Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide
Etalon	SLS Optics Ltd	Custom made	Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring
Excitation objective	Nikon	CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon	Water immersion objective
Grating	LightSmyth	T-1850-800s Series	High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series
Laser	Coherent	Custom made	Fidelity, HP
λ/2	Thorlabs	SAHWP05M-1700	Mounted superachromatic half-wave plate
PBS	Thorlabs	CM5-PBS203/M	16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,
PMMA beads	Merck	MFCD00198073	Micro particles based on polymethacrylate
Prisms	Crisel	320-8218	LASER DISPERSING PRISMS in SF11
PS beads	Merck	72986-10ML-F	Micro particles based on polystyrene
YVO4 crystal	Dr. Sztatecsny GmbH	Custom made	thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 – 1,100 nm

References

Stewart, S., Priore, R. J., Nelson, M. P., Treado, P. J. Raman Imaging. Annual Review of Analytical Chemistry. 5 (1), 337-360 (2012).
Smekal, A. Zur quantentheorie der dispersion. Die Naturwissenschaften. 11 (43), 873-875 (1923).
Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
Vanna, R., et al. Vibrational imaging for label-free cancer diagnosis and classification. La Rivista del Nuovo Cimento. 45, 107-187 (2021).
Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
Hellwarth, R. W. Theory of stimulated Raman scattering. Physical Review. 130 (5), 1850-1852 (1963).
Maker, P. D., Terhune, R. W. Study of optical effects due to an induced polarization third order in the electric field strength. Physical Review. 137 (3), 801-818 (1965).
Bloembergen, N. The stimulated Raman effect. American Journal of Physics. 35 (11), 989-1023 (1967).
Levenson, M. D., Flytzanis, C., Bloembergen, N. Interference of resonant and nonresonant three-wave mixing in diamond. Physical Review B. 6 (10), 3962-3965 (1972).
Polli, D., Kumar, V., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G. Broadband coherent Raman scattering microscopy. Laser & Photonics Reviews. 12 (9), 1800020 (2018).
Rigneault, H., Berto, P. Tutorial: Coherent Raman light matter interaction processes. APL Photonics. 3 (9), 091101 (2018).
Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-stokes raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363 (2009).
Valensise, C. M., et al. Removing non-resonant background from CARS spectra via deep learning. APL Photonics. 5 (6), 061305 (2020).
Cheng, J. X., Xie, X. S. . Coherent Raman scattering microscopy. , (2012).
Slipchenko, M. N., Oglesbee, R. A., Zhang, D., Wu, W., Cheng, J. X. Heterodyne detected nonlinear optical imaging in a lock-in free manner. Journal of Biophotonics. 5 (10), 801-807 (2012).
Blume, R. J. Boxcar” integrator with long holding times. Review of Scientific Instruments. 32 (9), 1016-1018 (1961).
Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
Sarri, B., et al. Stimulated Raman histology: one to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5378 (2019).
Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
De la Cadena, A., et al. Broadband stimulated Raman imaging based on multi-channel lock-in detection for spectral histopathology. APL Photonics. 7 (7), (2022).
Dela Cadena, A., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G., Polli, D. Broadband stimulated Raman scattering microscopy with wavelength-scanning detection. Journal of Raman Spectroscopy. 51 (10), 1951-1959 (2020).
Sciortino, G., et al. Four-channel differential lock-in amplifiers with autobalancing network for stimulated Raman spectroscopy. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 56 (6), 1859-1870 (2021).
Coluccelli, N., et al. Tunable 30 fs light pulses at 1 W power level from a Yb-pumped optical parametric oscillator. Optics Letters. 42 (21), 4545 (2017).
Monmayrant, A., Weber, S., Chatel, B. A newcomer’s guide to ultrashort pulse shaping and characterization. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 43 (10), 103001 (2010).
Fork, R. L., Martinez, O. E., Gordon, J. P. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150 (1984).
Crisafi, F., et al. In-line balanced detection stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 10475 (2017).
Alem, M. Noise spectral density measured with lock-in amplifiers. Zurich Instruments Company Blog. , (2021).
Palmer, C., Loewen, E. G. . Diffraction grating handbook. , (2005).
. Multivariate curve resolution homepage Available from: https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/ (2021)
Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
de Juan, A., Jaumot, J., Tauler, R. Multivariate Curve Resolution (MCR). Solving the mixture analysis problem. Analytical Methods. 6 (14), 4964-4976 (2014).
Zhang, D., et al. Quantitative vibrational imaging by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy and multivariate curve resolution analysis. Analytical Chemistry. 85 (1), 98-106 (2013).
Chitra Ragupathy, I., Schweikhard, V., Zumbusch, A. Multivariate analysis of hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy images. Journal of Raman Spectroscopy. 52 (9), 1630-1642 (2021).
Brown, S. D., Tauler, R., Walczak, B. . Comprehensive Chemometrics: Chemical and Biochemical Data Analysis. , (2020).
Guild, J. B., Xu, C., Webb, W. W. Measurement of group delay dispersion of high numerical aperture objective lenses using two-photon excited fluorescence. Applied Optics. 36 (1), 397 (1997).
RP Photonics Encyclopedia. Article on "Relative Intensity Noise.&#34 Available from: https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html (2021)
Audier, X., Heuke, S., Volz, P., Rimke, I., Rigneault, H. Noise in stimulated Raman scattering measurement: From basics to practice. APL Photonics. 5 (1), 011101 (2020).
Xu, S., Camp, C. H., Lee, Y. J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for polymers. Journal of Polymer Science. , (2021).
Davydova, D., de al Cadena, A., Akimov, D., Dietzek, B. Transient absorption microscopy: advances in chemical imaging of photoinduced dynamics. Laser & Photonics Reviews. 10 (1), 62-81 (2016).
Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241 (2006).
Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Journal of the Optical Society of America B. 19 (6), 1363 (2002).
Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. H., Potma, E. O. Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy. Optics Letters. 36 (19), 3891 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

De la Cadena, A., Vernuccio, F., Talone, B., Bresci, A., Ceconello, C., Das, S., Vanna, R., Cerullo, G., Polli, D. Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63709, doi:10.3791/63709 (2022).