Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy

Alejandro De la Cadena; Federico Vernuccio; Benedetta Talone; Arianna Bresci; Chiara Ceconello; Subir Das; Renzo Vanna; Giulio Cerullo; Dario Polli

doi:10.3791/63709

JoVE Journal > Engineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Ingénierie

Geniş Bant Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskobuna Dayalı Multipleks Kimyasal Görüntüleme

Published: July 25, 2022

doi:

10.3791/63709

Alejandro De la Cadena¹, Federico Vernuccio¹, Benedetta Talone¹, Arianna Bresci¹, Chiara Ceconello¹, Subir Das¹, Renzo Vanna², Giulio Cerullo^1,2, Dario Polli^1,2

¹Dipartimento di Fisica,Politecnico di Milano, ²Institute for Photonics and Nanotechnologies (IFN-CNR)

Summary

Geniş bant uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskobu ile kimyasal görüntüler elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Diferansiyel çok kanallı kilitleme tespiti ile çalışan bir SRS mikroskobuna dayanan protokol, numune hazırlamayı, SRS cihazının ayarlanmasını ve kimyasal olarak heterojen numunelerin farklı bileşenlerini çözmek için kemometriyi açıklar.

Abstract

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskobu, etiketsiz kimyasal görüntüleme için doğrusal olmayan bir optik tekniktir. Bu analitik araç, moleküler titreşimlerini doğrudan sorgulayarak ince numunelerin kimyasal haritalarını yüksek hızda ve yüksek uzamsal çözünürlüğünde sunar. Standart uygulamasında, SRS mikroskobu dar bantlıdır ve bir seferde yalnızca tek bir titreşim frekansına sahip görüntüler oluşturur. Bununla birlikte, bu yaklaşım sadece SRS’nin kimyasal özgüllüğünü engellemekle kalmaz, aynı zamanda titreşim spektrumlarında kodlanmış bilgi zenginliğini de ihmal eder.

Bu sınırlamalar, görüntünün pikseli başına paralel olarak titreşimsel bir spektrum çıkarabilen bir uygulama olan geniş bant SRS ile aşılabilir. Bu, kemometrik analizle birleştiğinde, numuneden alınan bilgi miktarını en üst düzeye çıkaran hiperspektral veriler sağlar. Böylece, geniş bant SRS, sistemin kimyasal özgüllüğünü geliştirir ve bir numunenin farklı bileşenlerinin konsantrasyonunun nicel olarak belirlenmesine izin verir. Burada, özel bir diferansiyel çok kanallı kilitli amplifikatör tespiti ile çalışan ev yapımı bir SRS mikroskobuna dayanan geniş bant SRS mikroskobu ile kimyasal görüntüleme için bir protokol sunuyoruz. Numune hazırlama, SRS cihazının hizalanması ve kemometrik analiz tartışılmaktadır. Titreşimsel Raman spektrumlarını elde ederek, protokol bir karışım içindeki farklı kimyasal türlerin nasıl tanımlanacağını ve göreceli konsantrasyonlarının nasıl belirleneceğini gösterir.

Introduction

Raman mikroskopisi, gelen ışığa yanıt olarak titreşen moleküllerden kaynaklanan elastik olmayan bir ışınım işlemi olan Raman saçılımı^1’i ölçerek zengin kimyasal haritalar sunan güçlü bir görüntüleme tekniğidir ^2,3. Bir Raman haritasının her pikseli, numunenin kimyasal bileşimi ve yapısı hakkında doğrudan bilgi taşıyan bir spektrum içerir ve bu da içsel titreşimsel kontrasta sahip görüntülerle sonuçlanır. Bugüne kadar, Raman mikroskobu, moleküler titreşimlerin mikrospektroskopi çalışmaları için referans bakış açısıdır, çünkü başka hiçbir görüntüleme tekniği hem yüksek kimyasal özgüllüğe hem de yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip görüntüler^üretemez4. Olağanüstü kimyasal özgüllüğüne rağmen, Raman saçılmasının üretim verimliliği düşüktür, bu da sırasıyla düşük alım oranlarına ve hassas numunelerle uyumsuzluğa yol açan uzun piksel bekleme süreleri veya yüksek güçlü uyarma gerektirir.

Raman mikroskobunun bu tek eksikliği, araştırmacıların mikroskopi için bir kontrast kaynağı olarak^tutarlı Raman saçılımı 5,6,7,8,9’u uygulamalarına yol açtı. Bu, titreşim tepkisini birkaç (yediye kadar) büyüklük sırasına göre artıran, böylece yüksek hızlı kimyasal görüntüleme^{10,11,12,13’e} izin veren doğrusal olmayan bir optik işlemdir. Özellikle, en çok kullanılan iki tutarlı Raman saçılma tekniği, tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (CARS)¹⁴ ve uyarılmış Raman saçılması (SRS)^15’tir. CARS’ın aksine, SRS rezonans moleküllerinin konsantrasyonuna doğrusal bir bağımlılık gösterir. Rezonans olmayan arka plana karşı bağışıktır, herhangi bir titreşimsel geçişle ilgisi olmayan, ancak moleküler titreşimlerin Raman spektrumlarının karakteristik Lorentzian şekillerine çarpıtıcı doğrusal olmayan bir etki^16,17. Böylece, SRS mikroskobu doğrudan nicel görüntü analizine izin veren otantik Raman bilgisi verir.

SRS, bir numunenin kimyasal bağları hakkında doğrudan bilgi sağlayan üçüncü dereceden, doğrusal olmayan, optik bir işlemdir. Genellikle yakın kızılötesi spektral bölgedeki iki optik alanın, yani sırasıyla^10,11,18 frekansında ω_pu ve ω S frekansındaki pompa ve ^Stokes’un mekansal zamansal süperpozisyonundan kaynaklanır. Bu süperpozisyon, pompa-Stokes frekansında bir vuruş üretir Ω = ω_pu-ω _S. Ω_R Ω moleküler titreşimle eşleştiğinde, molekül rezonansa girer ve ışık alanları ile molekül arasında tutarlı bir enerji transferine neden olur. Sonuç olarak, molekül titreşimsel olarak uyarılmış bir duruma ulaşır. Bu süreç, pompa fotonlarının yok oluşunu (uyarılmış Raman kaybı [SRL] olarak bilinen bir sinyal) veya Stokes fotonlarının eşzamanlı amplifikasyonunu (uyarılmış Raman kazancı [SRG] olarak bilinen bir süreç) ölçerek izlenebilir. SRG ve SRL, yoğun ve dalgalı bir arka planın (I) üzerine oturan küçük sinyallerdir (ΔI). SRS sinyalinin (ΔI / I) tipik değerleri 10-6-10-4 aralığında olduğundan, lazer gürültüsü onu kolayca gizleyebilir. SRS algılama, lazer gürültüsünün sinyal-gürültü oranı (SNR) ve dolayısıyla görüntüleme hızı üzerindeki zararlı etkilerini azaltmak için, lazer gürültüsünün minimum değerleri^{15,19,20’ye} ulaştığı yüksek modülasyon frekanslarında (>1 MHz) modülasyon aktarım tekniklerine (örneğin, kilitli amplifikatörler^, rezonans devreleri veya kutu arabası ortalamaları) dayanır.

Geleneksel SRS mikroskopisi, tek bir titreşim frekansında kimyasal görüntüler üretmek için dar bantlı (≈10 cm−1) pompa ve Stokes darbeleri kullanır ve piksel bekleme süreleri ile video hızında görüntülemeye izin verir ≈100 ns^21,22 kadar düşük. Bununla birlikte, dar bant SRS mikroskopisi, numuneyi yalnızca birkaç titreşim frekansında sırayla tarayarak kimyasal haritalar oluşturduğundan, bilgisi sınırlıdır²³. Bir veya iki titreşimsel kontrasta sahip SRS görüntüleri, özellikle heterojen sistemlerde, üst üste binen Raman bantlarına sahip kimyasal türleri ayırt etmek için yeterli olmayabilir. Bu nedenle, paradigmatik dar bant SRS mikroskobu, SRS’nin tüm potansiyelini kullanmaz, çünkü bir avuç titreşim frekansını araştırmak, kimyasal özgüllüğünü engeller ve titreşim spektrumlarında kodlanan bilgi zenginliğini ihmal eder. Ayrıca, numunenin farklı frekanslarda sıralı olarak taranması, fotohasarı tetikleyebilen ve ardışık görüntüler arasında titiz uzamsal birlikte kaydı önleyebilen ve hareket artefaktlarına yol açan uzun piksel bekleme süreleriyle sonuçlanır.

Dar bantlı muadilinin aksine, geniş bant SRS mikroskopisi, her örnek taramasında piksel başına bir titreşim spektrumu alır^10,12,24. Bu nedenle, geniş bant SRS, farklı titreşim kontrastlarının sıkı uzamsal birlikte kaydı ile hiperspektral görüntüleme sağlar ve titiz veri analizine olanak tanır. Bu sadece numunenin kimyasal bileşenlerini Raman spektrumları aracılığıyla ortaya çıkarmakla kalmaz, aynı zamanda göreceli konsantrasyonlarını belirlemeye de yardımcı olur. Spektrumların nasıl edinildiğine bağlı olarak, geniş bant SRS mikroskopisi hiperspektral SRS veya multipleks SRS olarak sınıflandırılır. Hiperspektral SRS’de, numunenin taranan noktası başına SRS spektrumu sırayla elde edilir (yani, frekans detuning Ω süpürülerek alınır), SRS sinyallerini ardışık Raman kaymalarında bir araya getirerek bir SRS spektrumu oluşturur. Raman spektrumu, multipleks SRS’de birkaç titreşim modunda aynı anda ölçülür. Bu nedenle, multipleks SRS yaklaşımı, SRS sinyalini farklı frekanslarda sürmek için modüle edilmiş bir dar bant darbesini geniş bant darbesiyle birleştirir ve SRS spektrumlarını algılamak için dar bant SRS’ninkiyle karşılaştırılabilir bir duyarlığa sahip çok kanallı bir dedektör kullanır.

Bu yazıda, multipleks SRS mikroskobu kullanılarak heterojen numunelerin kimyasal haritalarının üretilmesi için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokolde kullanılan SRS mikroskobunun bir şeması Şekil 1’de tasvir edilmiştir ve^25,26,27 başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Kısaca, 10 W ortalama güç ve 80 MHz tekrarlama hızı ile 1040 nm merkezli 140 fs darbe üreten ticari mod kilitli bir Yb fiber lazer, geniş bant SRS mikroskobunu yönlendirir. Bir polarize edici ışın ayırıcı (PBS), temel kirişi iki dala ayırır. Dar bant Stokes darbelerini üretmek için, 4 W temel ışına sahip bir dal, daha sonra bir akustik optik modülatör (AOM) ile 1.6 MHz’de modüle edilen bir dar bant (≈^{15 cm-1}) ışını üreten bir etalona gönderilir. Temel ışının 6 W’ı olan kalan fraksiyon, tip I faz eşleştirmesi için kesilen 2.8 mm kalınlığında bir lityum triborat (LBO) kristali ile frekans iki katına çıkarılır (θ = 90 °, φ = 13.8 °). 520 nm’de ortaya çıkan ikinci harmonik nesil, 680-910 nm spektral bölge içinde ayarlanabilir geniş bant optik radyasyon sağlamak için aktif ortam olarak 3.0 mm kalınlığında bir LBO kristali (tip I faz eşleştirme, θ = 90 °, φ = 9.8 °) kullanan bir cihaz olan optik parametrik osilatör (OPO) pompalamak için X katlanmış bir boşluğa gider (Şekil 2). Bu geniş bant darbeleri, SRS deneylerinde pompa görevi görür ve mikroskop hedefinin neden olduğu dağılım etkilerini önceden telafi etmek için bir prizma kompresörüne yayılır.

Sıkıştırma aşamasından sonra, bir λ/2 dalga plakası, bir YVO₄ çift kırıcı plaka ile birleştirildiğinde, algılama düzlemindeki elektronik çıkarma işlemi geniş bant pompasının gürültüsünü iptal eden iki ortogonal polarize kopya üretir. Dikroik ayna, pompayı ve Stokes ışınlarını birleştirir ve bunları dik bir mikroskopa gönderir. Sayısal açıklığı (NA) 1,27 olan bir suya daldırma hedefi, ışığı numuneye odaklarken, NA değeri 1,4 olan bir yağ daldırma hedefi onu toplar. Algılama aşamasından önce, kısa geçirgen bir filtre (SPF) modüle edilmiş Stokes’u çıkarırken, Littrow konfigürasyonunda çalışan bir kırınım ızgarası iletilen geniş bant pompasını dağıtır. İkinci bir PBS₂ , pompa kopyalarını ayırır ve bir lens bunları iki fotodiyot dizisine odaklar. Bu fotodiyot dizilerinden gelen sinyaller elektronik olarak çıkarılır ve ev yapımı çok kanallı kilitli bir amplifikatöre (M-LIA) gönderilir. Demodüle edilmiş sinyal daha sonra fotodiyot dizilerinden birinin doğru akım (DC) okumaları ile normalleştirilir ve böylece SRL spektrumu üretilir.

Örnek bir deney olarak, her biri benzersiz bir Raman spektrumuna sahip birkaç tanınmış Raman saçılımcısının karışımlarını görüntülüyoruz. Böylece, protokol referans örneklerinin nasıl hazırlanacağını açıklayarak başlar. SRL’yi tespit ettikçe, dar bant Stokes darbelerinin nasıl elde edileceğini ve geniş bant (≈250 ^cm-1) pompa darbelerini, yani ev yapımı OPO’yu sağlayan optik kaynağın nasıl kurulacağını açıklamaya devam ediyoruz. Protokol, dar bant Stokes ve geniş bant pompasının gücü ve spektrumları gibi kritik parametreleri tanımlayan optik ışınların hizalanmasını ve optimizasyonunu gösterir. Protokol, geniş bant pompasının optik yolunu ayrıntılı olarak açıklar, çünkü özel optik elemanlar gerektirir. Ayrıca, pompa-Stokes darbeleri arasındaki mekansal zamansal örtüşmenin nasıl bulunacağını açıklar ve SRS deneyleri için en iyi modülasyon frekansını tanımlamaya yardımcı olan göreceli yoğunluk gürültüsünü (RIN) belirlemenin pratik bir yolunu gösterir. Ardından, algılama zincirinin çalışma prensibini ve kalibrasyonunu açıklıyoruz. Son olarak, protokol veri toplama sürecini, kemometriyi ve görüntü işleme boru hattını gösterir.

Protocol

1. Numune hazırlama NOT: Bu protokol, kimyasal olarak heterojen karışımların konsantrasyon haritalarının ve karakteristik SRS spektrumlarının alınmasını açıklar. Numuneyi hazırlamak için, polimetil metakrilat (PMMA) mikroboncuklarının sulu bir süspansiyonundan 2 μL ekstraksiyonu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 2 μL fraksiyonunu bir mikroskop kapağına dökün. Temiz bir pipet ucu ile, polistiren (PS) mikroboncukların sulu süspansiyonundan 2 μL ayıklayın ve kapak kapağındaki PMMA süspansiyonu ile birleştirin. Bir pipet ucu kullanarak süspansiyonu nazikçe karıştırın ve 24 saat kurumasını bekleyin.NOT: Numune yüzeyindeki mikroboncukların orantısız miktarlarını önlemek için mikroboncuk süspansiyonlarının konsantrasyonunu dikkatlice eşleştirmek önemlidir. PS ve PMMA boncuklarının çapı sırasıyla 10 ve 6 μm’dir. Bu boyutlar, SRS’nin üretim verimliliğinden ödün vermeden mikroskobun yüksek uzamsal çözünürlüğünü göstermeye izin verir. Su kuruduğunda ortaya çıkacak düz, beyaz boncuk tabakasının üzerine, 20 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ve ardından 20 μL saf zeytinyağı ekleyin. İkinci bir mikroskop kapağının kenarlarına oje sürün. Kapak kaymasını karışım üzerine, oje aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve kapatmak için yeterli basınç uygulayın. Kurumasını bekleyin.NOT: Şekil 3’te bu adımlarla elde edilen örnek sonuçlar gösterilmektedir. Düzgün bir şekilde kapatılırsa, bu numune üç aya kadar sürmelidir. 2. Pompa ve Stokes kirişlerinin optimize edilmesi Lazeri açın ve termal dengeye ulaşmasına izin verin. Temel ışına GDD = -6.000 fs2’lik negatif bir grup gecikme dağılımı (GDD) uygulayın.NOT: Bu GDD değeri, OPO’yu başarılı bir şekilde sürmek için kritik öneme sahiptir ve bu kurulum için idealdir, ancak muhtemelen farklı sistemlerde değişecektir. Negatif GDD, ızgara çiftleri, prizma kompresörleri veya uzamsal ışık modülatörlerine dayanan darbe şekillendiriciler aracılığıyla tanıtılabilir28. Temel lazeri polarize edici bir ışın ayırıcı (PBS1) ile iki dala bölün. Dar bant Stokes darbelerini elde etmek için, 4 W’lık bir dalı bir etalona yönlendirin. Dar bir spektral çizgi elde edilene ve darbe spektrumunun zirvesinde ortalanana kadar etulonu hafifçe döndürün ( Şekil 2’deki kırmızı eğriye bakın).NOT: Bu etalon, 29’luk etkili bir inceliğe ve 1.040 nm’de 29.8 nm’lik bir serbest spektral aralığa sahiptir. Modülasyonlu Stokes darbeleri elde etmek için, dar bant ışını bir acousto -optik modülatöre gönderin.NOT: Şekil 4A’da gösterildiği gibi, birinci dereceden kırınımlı ışın 0 modülasyona maruz kalırken, sıfır dereceli ışın sadece modülasyona maruz kalır. Bu nedenle, numunenin herhangi bir SRS sinyali üretmeden numune fotohasarına neden olabilecek güçlü bir modüle edilmemiş ışınla aydınlatılmasını önlemek için birinci dereceden kullanılması tercih edilir. Modülasyon verimliliğini optimize etmek için, f1 ve f2 lensleri arasındaki mesafeyi değiştirin (Şekil 4B). Modüle edilmiş ışını bir fotodiyot ile ölçün ve profilini bir osiloskop ile kaydedin. Osiloskop okumalarının genliği ve taban çizgisi arasında maksimum kontrast elde edilene kadar f1 ile f2 arasındaki mesafeyi değiştirin.NOT: Bu lens çifti bir kolimatör olarak çalışmaz, bunun yerine AOM’nin kristalinde etkili bir odak noktası oluşturur. Stokes ışınının beline ince ayar yapmak için üçüncü bir lens f3 yerleştirin, mikroskopun odak düzlemindeki etkileşim hacminin değiştirilmesini ve sonuç olarak SRS sinyalini optimize etmesini sağlayın.NOT: Stokes ışını bu protokolde 1,6 MHz’de modüle edilmiştir. Temel ışının optik gücünün kalan 6 W’ını bir lityum triborat (LBO) kristaline (LBO1, θ = 90 °, φ = 13.8 °) odaklayın ve ikinci harmonik nesil (SHG) yoluyla temel ışını frekans olarak ikiye katlayın (Şekil 5A). SHG verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için, kristali hafifçe döndürerek φ açısını değiştirin (Şekil 5B). En az 2,5 W SHG elde etmek için LBO1’i optimize edin. Sinyal ışınının üretim verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için LBO2’nin φ açısını ayarlayın.NOT: f1, f2 ve f3 lenslerin odak uzaklıkları, SHG ışınını OPO boşluğuyla mod eşleştirmek için dikkatlice seçilmiştir. Bu nedenle, bu lenslerin odak uzaklıkları farklı kurulumlarda değişecektir. OPO boşluğundaki artık dağılım nedeniyle, boşluk uzunluğundaki hafif bir değişiklik, sinyal ışınının spektrumunda bir kaymaya neden olur. 1.040 nm’deki dar bant Stokes ile birlikte 1.373-5.090 cm-1 içinde bir frekans detuning üretebilen bir pompa spektrumu elde etmek için boşluk uzunluğunu ayarlayın. Bu aralık, CH germe spektral bölgesindeki titreşimleri kapsar (2.800-3.050 cm-1). Şekil 2’deki mavi spektrumlara bakın. Uyarma mikroskobu hedefinin neden olduğu dağılım etkilerini telafi etmek için, geniş bant pompasını bir prizma kompresörüne gönderin. Pompayı tepe noktasından A prizmasına girin ve dağılmış pompayı prizmanın tepesine doğru yönlendirin B. Gerekli negatif dağılım miktarını tanımlayın ve ardından prizmaların apisleri L arasındaki mesafeyi buna göre ayarlayın.NOT: Şekil 6 , prizmaların yerleşimini göstermektedir29. Bu durumda, tazminat GDD ≈ -12.800 fs2 için ayarlanmıştır; dolayısıyla L = 1.26 m. Brewster kesimli prizmalar kullanın. Pompa kirişinin polarizasyonunun prizmaların üçgen düzlemlerinde (üst/alt cilasız yüzler) bulunduğundan emin olun. Pompa kirişinin θ insidansaçısının Brewster açısıyla eşleştiğinden emin olun. Prizma A’nın çıkış yüzünün B prizmasının giriş yüzüne paralel olduğundan emin olun. Telafi edilecek geniş bant darbesinin GDD’sini tahmin etmek için, SRS sinyalini tek bir dalga boyunda λ 1 olarak ölçün ve maksimum SRS(λ 1)’in elde edildiği pompa-Stokes arasındaki zaman gecikmesi τ 1’i kaydedin. Bu prosedürü ikinci bir dalga boyu λ 2 için tekrarlayın, SRS(λ 2)’nin maksimum olduğu τ2 zaman gecikmesini tekrar kaydedin.NOT: GDD, açısal frekansa göre grup gecikmesinin türevi olarak tanımlandığından, yukarıda belirtilen ölçümler geniş bant ışınının GDD’sinin (Eq [1]) tahmin edilmesine izin verir.(1) Bir λ/2 dalga plakası kullanarak, pompa ışınının polarizasyonunu 45°’ye ayarlayın. Polarize pompayı 13,3 mm uzunluğunda bir YVO4 plakasına yönlendirerek bu çift kırılımlı kristal dikeyin hızlı eksenini ayarlayın.NOT: YVO4 plakasından geçtikten sonra, pompa darbeleri, kolinerken yayılan ancak aralarında 10 ps’≈ bir gecikme Δt tutarak, iki ortogonal polarize kopyaya bölünecektir. Bu gecikme, birefringent kristalin kalınlığının ve kırılma indekslerinin bir fonksiyonudur. Bundan sonra, Stokes darbelerinin aynı polarizasyon durumuna sahip pompa kopyaları “sinyal” olarak adlandırılırken, ortogonal bir duruma sahip olanlar “referans” olarak adlandırılacaktır. Satır içi dengeli algılama adı verilen bu tekniğin ayrıntıları daha önce30 olarak tanımlanmıştır. Pompayı ve Stokes ışınlarını dikroik bir ayna ile birleştirin ve bir çift floresan iğne deliği kullanarak dikkatlice hizalayın, böylece her ikisinin de kolemadan yayılmasını sağlayın. Işınları zayıflatın ve hızlı (en az 100 MHz bant genişliğinde) bir fotodiyota odaklamak için bir lens kullanın. Pompayı bloke edin ve yüksek bant genişliğine sahip dijital osiloskop ile tek Stokes darbelerini ölçün. Osiloskobun ölçümleri için lazerin tetikleme sinyalini saat kaynağı olarak kullanın. Fotodiyot voltajının maksimuma ulaştığı ortalama değeri belirleyin. Stokes kirişini bloke edin ve pompa darbeleri için bu prosedürü tekrarlayın. Pompa (Stokes) ışınının optik yolunu, darbeleri kabaca Stokes (pompa) darbeleriyle aynı anda gelene kadar artırın veya azaltın.NOT: Bu, iki kol arasındaki optik yol farkının eşleşmesinde maksimum birkaç milimetrelik bir hassasiyeti garanti etmelidir. Fotodiyotu çıkarın ve pompa-Stokes fotonları arasında toplam frekans üretimi (SFG) için uygun bir kesme açısına sahip doğrusal olmayan bir kristal yerleştirin.NOT: Burada kullanılan doğrusal olmayan kristal, θ = 90 °, φ = 9.8 ° tip I faz eşleşmesi için kesilmiştir. Doğrusal olmayan kristalin optik ekseni, Stokların polarizasyonuna ve sinyal darbelerine paralel olmalıdır. Pompa / Stokes ışınlarını hafifçe doğrusal olmayan hale getirin ve gecikme hattını, faz eşleşmesi nedeniyle pompanın SHG’leri ile Stokes kirişleri arasında olan bir sinyal olan SFG’ye kadar hareket ettirin. Sinyal bulunamazsa, kristal üzerindeki iki ışının uzamsal örtüşmesini doğrulayın.NOT: SFG mavi renktedir ve çıplak gözle kolayca görülebilmelidir. Beklenmeyen zorluklar durumunda, pompayı, Stokes’u ve ilgili SHG’lerini çıkarmak ve SFG’yi bir spektrometre ile ölçmek için bir alçak geçiş filtresi yerleştirin (Şekil 7A). SFG’nin maksimum yoğunluğuna ulaştığı zaman gecikmesini, doğrusal olmayan sinyal üretimi için gereken ideal mekansal zamansal örtüşmeyi belirleyen bir değeri bulun ve gecikme hattını orada sabitleyin (Şekil 7B). Işın profillerini kalibre edilmiş bir kamera ile ölçün. Alternatif olarak, bir kızılötesi kart kullanın ve çapları gözle tahmin edin. Biri pompa için, diğeri Stokes ışını için olmak üzere iki teleskop kullanın. Bu teleskoplarla, ışın çaplarını uyarma hedefinin arka açıklığına eşleştirmeye çalışın.NOT: Bu yordam, kurulumun maksimum uzamsal çözünürlüğünü garanti eder. SRS sinyali elde edildikten sonra, çapını, Rayleigh aralığını ve dolayısıyla mikroskopun odağındaki etkileşim hacmini değiştirerek pompa ışını üzerindeki teleskopu kullanın. Maksimum SRS elde edildiğinde durdurun. Pompa (Stokes) ışınının yoğunluğunu ölçmek için bir fotodiyot kullanın ve fotodiyotun sorumluluğuyla, dedektörün aktif alanına çarpan ortalama gücü hesaplayın. Yüksek bant genişliğine sahip bir fotodiyot kullanıyorsanız, yalnızca sabit veya DC bileşenini almak için elektronik bir alçak geçirgen filtre bağlayın. δP(f)’yi ölçmek için, yüksek bant genişlikli bir fotodiyotun çıkışını (düşük geçirgen filtrenin bağlantısını kesin) kilitli bir amplifikatörün girişine bağlayın. Kilitleme çıkışını farklı demodülasyon frekanslarında saklayın ve V’den W’ye dönüştürmek için fotodiyotun sorumluluğunu kullanın.NOT: Ticari kilitli amplifikatörler, δP(f) ölçümü için yerleşik araçlara sahiptir (örneğin, Zurich Instruments LabOne a Frequency Sweeper31’e dahil edilmiştir). Kirişlerin RIN’ini ölçtükten sonra, lazeri kapatın ve elektronik gürültüyü ölçün (yani, dedektörlerde herhangi bir ışık olmadan hesaplanan RIN).NOT: RIN’in atış gürültüsüyle değil, lazer dalgalanmalarıyla sınırlı olması koşuluyla, bu karanlık ölçüm ölçümler için kullanılan enstrümantasyonun teşhisine yardımcı olacaktır; Elektronik gürültü lazerin RIN’i kadar yüksekse, bu lazerin RIN’ini ölçmek için kullanılamaz; Elektronik gürültüyü azaltmak için ultra düşük gürültülü amplifikatörlerin kullanılması gerekebilir. RIN, lazer dalgalanmasıyla değil, atış gürültüsüyle sınırlıysa, dedektöre daha fazla optik güç verin. Bkz. Şekil 8. 3. SRS görüntüleme için spektral algılamanın ayarlanması Pompayı ve Stokes ışınlarını mikroskopa yönlendirin. Bölüm 1’de tartışılan örneği yerleştirin ve pompa kirişini hizalamaya yardımcı olması için boncuksuz bir bölge bulun. Bir kamera kullanarak, pompayı (Stokes) bloke ederken Stokes (pompa) ışınının yansıyan profilini ölçün. Mikroskoptan hemen önce aynalarla lazer noktalarının konumlarını ayarlayın.NOT: En yüksek SRS üretimini elde etmek için, mükemmel bir şekilde örtüşmeleri gerekir. Şekil 9, (A) pompayı, (B) Stokes’u ve (C) her iki ışının da mikroskopun odak düzleminde mükemmel bir şekilde örtüştüğünü göstermektedir. Uyarma ve toplama hedeflerini konfokal hale getirin.NOT: Sonsuzluk düzeltilmiş hedeflerin kullanılması, pompanın numune düzlemine odaklanmasının, toplama hedefinin arka açıklığında kolimasyonlu bir ışınla sonuçlanacağı anlamına gelir. Modülasyonlu Stokes’u çıkarmak için kısa geçirgen bir filtre takın ve pompa kirişini ızgaraya yönlendirin. Dağınık ışını dedektörlere odaklamak için ızgaradan sonra bir lens yerleştirin.NOT: Izgara denklemi, doğrusal dağılımın belirlenmesine yardımcı olacaktır (yani, belirli bir odak uzaklığı f32 olan bir lensle dedektör düzleminde mm başına kaç nm). Izgara denklemi, ızgaranın oluk periyodikliği d’sini , α insidans açısını, β kırınım açısını, kırınımlı dalga boyu λ’yu ve kırınım sırası m (Eq [2]) ile ilişkilendirir. (2) Dengeli algılama için, referansın spektrumunu ve pompa ışını boyunca yayılan sinyal kopyalarını ölçün.NOT: Pompa kirişinin ızgaradan sonraki uzamsal profili, geniş bant pompanın uzunluğu boyunca farklı spektral bileşenlerini içeren bir çizgidir. Pompa hattının her spektral bileşeni, küresel bir lens tarafından f mesafesinde odaklanacaktır (bkz. adım 3.1-3.2). Dağınık pompanın kesilmesini önlemek için, küresel lensi ızgaraya mümkün olduğunca yakın bir yere yerleştirin. Pompa replikalarını ayırmak için küresel lensin hemen arkasına bir PBS yerleştirin.NOT: Burada, polarize edici bir küp kiriş ayırıcı kullanılmıştır, çünkü bu tür polarizörler pompa kirişinin polarizasyonunu karıştırmaz. Ayrıca farklı pompa replikalarını etkili bir şekilde ayırır ve geniş bant pompasının kesilmesini önlemek için yeterince büyük olabilir. PBS, sinyal replikasını (s-polarize) yansıtacak ve referans replikasını (p-polarize) iletecektir. Bir çift direksiyon aynasıyla, sinyali yönlendirin ve ilgili dedektörlerine referans verin (Şekil 1).NOT: İdeal dengeli konfigürasyonda, sinyal ve referans replikaları aynı optik güce sahip olmalıdır. Pompa ışınındaki gürültüyü gidermek için, sinyali ölçen fotodiyot dizisinin kanallarını referans dedektöründeki muadilleriyle ilişkilendirin. Bu nedenle, sinyalin n. fotodiyotunun ve referans fotodiyot dizilerinin, sinyalin ve referans kopyalarının aynı spektral bileşeninin optik gücünü ölçtüğünden emin olun.NOT: Şekil 8’de örnek RIN spektrumları gösterilmektedir. İki fotodiyot dizisi arasındaki spektral eşleşmeyi garanti etmek için, dağınık pompayı uzamsal olarak filtrelemek için ızgara ve PBS arasına küçük bir yarık veya iris yerleştirin. İletilen ışınları referans ve sinyal fotodiyot dizilerinin n. dedektöründe ortalamak için pompa kopyalarının bir spektral bileşeni hariç hepsini klipsleyin. Farklı algılama kanallarının korelasyonunu ayarlamak için belirtilen direksiyon aynalarını kullanın. Bu noktada, SRS mikroskopisini başlatın. Bunu yapmak için, Stokes’u modüle edin, numuneyi raster-tarayın ve her pikselden normalleştirilmiş SRS (ΔI / I) spektrumunu elde etmek için karşılık gelen DC spektrumu (I) ile pompa spektrumu (ΔI) üzerindeki modülasyon transferini elde edin. Satırları (x) ve sütunları (y) numunenin taranmış konumlarını içeren üç boyutlu matrisler üretin. X-y düzlemine ortogonal olan her vektörde (z), bir SRS spektrumu depolayın.NOT: Şekil 12 , SRS hiperspektral verilerinin yapısını göstermektedir. Stokes ışınının gücünü 65 mW’a ve geniş bant pompa kirişinin gücünü 20 mW’a ayarlayın. Denemeler için ideal bir entegrasyon zamanı belirleyin.NOT: Burada, entegrasyon süresi 44 μs idi; ancak, yavaş piezo tarayıcı nedeniyle piksel bekleme süresi 1 ms idi. 4. Hiperspektral SRS verilerinin kemometrisi Numunenin farklı kimyasal bileşenlerini çözmek için çok değişkenli eğri çözünürlüğü analizini kullanın. GUI’yi Tauler, de Juan ve Jaumot33’teki bağlantıdan indirin.NOT: Burada Tauler ve çalışma arkadaşları tarafından geliştirilen Çok Değişkenli Eğri Çözünürlüğü-Alternatif En Küçük Kareler (MCR-ALS) MATLAB programı34,35 kullanılmıştır. MCR-ALS’nin SRS verilerine uygulamaları için 36,37; algoritma hakkında ayrıntılı tartışmalar için 38’e bakın. MATLAB’da, SRS hiperspektral veri küpünü, SRS spektrumlarını içeren satırlarıyla bir D matrisine dönüştürün. Katlanmamış SRL hiperküp D’nin, C konsantrasyonunun ve numunenin kimyasal bileşenlerinin spektral profilleri S’nin doğrusal bir kombinasyonu olduğunu varsayalım (yani, D = CS T + E, burada E, deneysel hatayı içeren bir matristir ve üst simge T, matris transpozunu gösterir). C ve S’yi ayırmak için verilerin ana bileşenlerini edinin. Bölüm 1’de tartışılan örneğin DMSO, Zeytinyağı, PMMA ve PS olmak üzere dört tür içerdiği a priori olarak bilindiği gibi, programı arka plan gürültüsünü hesaba katmak için dört tür ve bir tane daha arayacak şekilde yapılandırın. Daha fazla veya daha az sayıda türe sahip farklı bir örnek varsa, programı buna göre yapılandırın.NOT: Program, spektral verilerin tekil değer ayrışmasını yapar ve bunları saf spektrum S’nin ilk tahminleri olarak kullanır. Alternatif olarak, programı bilinen spektral izleri içeren bir matrisle besleyin (örneğin, maddelerin kendiliğinden Raman spektrumları).NOT: Saf spektrumun ilk tahminlerini kullanarak, program C = DS (S T S) − 1 ve S T = (C T C) − 1 C T D hesaplayacaktır. C ve S’nin yeni değerleri, alternatif bir en küçük kareler algoritması ile optimize edilmiştir. SRS negatif olmayan bir sinyal olduğundan, alternatif en küçük kareler algoritmasını yalnızca pozitif değerler verecek şekilde kısıtlayın.NOT: Optimize edilmiş C ve S, programın orijinal D verileriyle karşılaştıracağı bir veri kümesi olan yeni bir D * = CST matrisi oluşturmaya izin verecektir. Program, D* ve D arasındaki fark, tanımlanabilen rasgele bir eşik değerinden küçük olana kadar bu adımları otomatik olarak yineler. Kimyasal görüntüleri ve numunenin kimyasal bileşenlerinin karakteristik spektrumlarını elde etmek için C ve S’yi çizin.

Representative Results

Şekil 3 , PS, PMMA ve zeytinyağı ile bu protokol kullanılarak elde edilen örnek sonuçları göstermektedir. LBO1’in bu dönüşü, SHG alanının yaşadığı kırılma indisini değiştirecek ve faz hızını doğrudan değiştirecektir. SHG alanının faz hızı, LBO1’de indüklenen doğrusal olmayan polarizasyonunkiyle eşleştiğinde, doğrusal olmayan olarak üretilen alan ve doğrusal olmayan polarizasyon fazda olacak ve yoğun SHG radyasyonuna yol açacaktır. Başka bir deyişle, LBO1’in φ açısını değiştirmek, kullanıcının SHG için ideal faz eşleştirme koşulunu elde etmesini sağlayacaktır. Burada Tip I faz eşleştirme kristali kullanıldığından, SHG ışınının polarizasyonu temel ışınınkine ortogonal olacaktır (Şekil 5B). Şekil 8, bu protokolde kullanılan optik kaynakların RIN’ini ve lazer gürültüsüne temel bir sınır koyan elektronların ve fotonların kuantum doğasının bir sonucu olan atış gürültüsü sınırını göstermektedir. Çekim gürültüsü sınırlı RIN, Eq (3) tarafından gösterildiği gibi hesaplanır. (3) Burada h , Planck’ın sabitidir ve ν optik frekanstır. Böylece, atış gürültüsü elektronik tasarım için yararlı yönergeler sağlar. Şekil 11A ve Şekil 11C, dengeli ve dengesiz spektrumların örnek verilerini göstermektedir. Doğal olarak, dengeli algılamanın etkileri, deneylerin nihai sonuçlarını, yani kimyasal haritaları etkiler. Şekil 11B ve Şekil 11D, sırasıyla dengesiz ve dengeli koşullarda bileşik görüntüleri göstermektedir. Açıklanan protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, heterojen bir numunenin farklı kimyasal bileşenlerini tanımlamaya ve lokalize etmeye ve karakteristik SRS spektrumlarını çıkarmaya yardımcı olacaktır. Şekil 12’deki hiperspektral verilerin kemometrik analize tabi tutulması Şekil 13’ü vermektedir. Şekil 13A, numunenin farklı kimyasal bileşenlerinin konsantrasyon haritalarının bir bileşimini gösterirken, Şekil 13B, karakteristik SRS spektrumlarını göstermektedir. Şekil 13A’da gösterilen verilerin, kullanıcının yalnızca numunenin farklı bileşenlerini kolayca tanımlamasına değil, aynı zamanda daha nicel analizler yapmasına da izin verdiğini unutmayın. Örneğin, konsantrasyon haritalarını kullanarak, her kimyasal türün fraksiyonel konsantrasyonunun ortalamasını hesaplayabiliriz:% 38 DMSO,% 25 PMMA,% 14 PS ve% 22 Zeytinyağı. Şekil 1: Bu protokolde kullanılan geniş bant SRS mikroskobunun şeması. Kısaltmalar: PBSx = polarize edici ışın ayırıcı; SHG = ikinci harmonik nesil modülü; OPO = optik parametrik osilatör; AOM = akousto optik modülatör; SPF = kısa geçirgen filtre; M-LIA: Çok kanallı kilitli amplifikatör; DM = dikroik ayna. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Resim 2: Ayarlanabilir geniş bant pompasının (mavi) ve dar bant (kırmızı) Stokes ışınlarının spektrumları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Kimyasal olarak heterojen numunenin parlak alan görüntüsü. Geleneksel mikroskopinin farklı bileşenlerin ayırt edilmesine izin vermediğini unutmayın. Ölçek çubuğu = 100 μm. Kısaltmalar: PS = polistiren; PMMA = polimetil metakrilat; DMSO = dimetil sülfoksit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Dar bant Stokes darbelerinin modülasyonu. (A) Şeffaf mavi iz 0. kırınımlı kirişi gösterirken, siyah olan karşılık gelen1. sırayı gösterir. (B) 1. dereceden kırınımlı ışının modülasyon verimliliğini optimize etmek için optik kurulum ve uyarma hedefine ulaşmadan önce Stokes ışınının spot boyutunun ince ayarlanması. Kısaltmalar: AOM = acousto optik modülatör; fx = lens X’in odak uzaklığı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: OPO’yu sürmek için gerekli doğrusal olmayan optik işlemler . (A) SHG etkileşiminin geometrisi. ω1’deki iki temel foton, malzeme sistemini yüksek enerjili bir sanal seviyeye getirir, buradan malzeme sistemi zemin durumuna atlar ve ωSHG’de bir foton yayar. (B) SHG deneyinin şeması. (C) SHG ve OPO kurulumlarının şeması. (D) DFG etkileşiminin geometrisi. Bir ωSHG fotonu, sinyal (ωSinyal) ve avara (ωAvara) fotonlarına bölünür. Sinyal ışınının kazanımı, sinyal fotonlarını geri besleyerek ve boşlukta rezonansa sokarak elde edilir. (E) DFG deneyinin şeması. Kısaltmalar: SMx = küresel ayna (R = 75 mm); OPO = optik parametrik osilatör; SHG = ikinci harmonik nesil modülü; DFG = fark-frekans üretimi; LBO = lityum triborat; OC = yağ kondenseri; DM = dikroik ayna; fx = lens X’in odak uzaklığı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Prizma kompresörün geometrisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Uzaysal zamansal örtüşmeyi optimize etmek için toplam frekans üretimi. (A) pompa ve Stokes arasındaki SFG ve bunların bir ekrana çarpan ilgili SHG’si. Burada, bir lens pompayı odakladı ve Stokes kristalin üzerine ışınlanırken, alçak geçirgen bir filtre onları çıkardı. (B) Zaman gecikmesinin bir fonksiyonu olarak pompa ve Stokes arasındaki SFG’nin yoğunluğu. SRS kurulumunun zaman sıfırını SFG’yi en üst düzeye çıkaracak konuma ayarlayın. B’deki çapraz korelasyonun asimetrisi, Stokes kirişi üzerindeki etalonun neden olduğu zamansal profilden kaynaklanmaktadır. Kısaltmalar: SFG = toplam frekans üretimi; SHG = ikinci harmonik nesil modülü; SRS = uyarılmış Raman saçılma spektroskopisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Resim 8: RIN spektrumları. Yeşil renkle vurgulanan bant, SRS deneyleri için en iyi spektral bölgeyi gösterir. Stokes ışınını bu bant içindeki herhangi bir frekansta modüle etmek, lazer gürültüsünün SRS sinyali üzerindeki etkilerinin mümkün olan en düşük seviyede olacağını garanti eder. Kısaltmalar: RIN = bağıl yoğunluklu gürültü; SRS = uyarılmış Raman saçılma spektroskopisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Resim 9: Kiriş profilleri . (A) Pompa, (B) Stoklar ve (C) pompa ve Stoklar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 10: Bir dağılım ızgarası ve bir fotodiyot dizi dedektörü için varsayılan geometri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 11. Dengeli algılamanın etkileri. Spektrumlar (A, C) ve kimyasal görüntüler (B, D) üzerindeki etkileri. (B) ve (D) panellerinde gösterilen kompozitler, deneylerin nihai sonuçlarıdır (yani, hiperspektral verilerin kemometrik analizinden sonra). Ayrıntılar için protokol bölüm 4’e bakın). Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltma: SRS = uyarılmış Raman saçılma spektroskopisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 12: Geniş bant SRS mikroskobu ile elde edilen temsili bir SRS hiperküpü. X-y düzlemi, taranan konumların koordinatlarını saklarken, z boyunca her vektör bir SRS spektrumu kaydeder. Kısaltma: SRS = uyarılmış Raman saçılma spektroskopisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 13: Hiperspektral SRS verilerinin kemometrik analizi . (A) Numunenin farklı bileşenlerinin konsantrasyon haritalarının bileşimi. (B) Kimyasal türlerin karakteristik spektrumları. Her iki panelde de sarı: zeytinyağı, mavi: DMSO, camgöbeği: PS ve turuncu: PMMA. Ölçek çubuğu = 20 μm (A). Kısaltmalar: SRS = uyarılmış Raman saçılma spektroskopisi; PS = polistiren; PMMA = polimetil metakrilat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Geniş bant SRS mikroskopisi, heterojen bir numunenin kimyasal bileşenlerini tanımlamak ve çözmek için otantik kimyasal kontrast sunan güçlü bir görüntüleme tekniğidir. Bu analitik aracın potansiyeli, malzeme biliminden histopatolojiye kadar çeşitli araştırma alanlarına faydalı olabilir. Geniş bant SRS mikroskobunun dezavantajı, teknik olarak zorlu olmasıdır; deneyci sadece geniş bant lazer kaynakları hakkında bilgi birikimine ihtiyaç duymakla kalmaz, aynı zamanda SRS’yi verimli bir şekilde üretmek için lazer darbelerini manipüle etmelidir, bu da sofistike algılama şemalarıyla ölçülmesi gereken bir sinyaldir. Bu yazıda, çok katlı geniş bant SRS mikroskobu kullanılarak karışık kimyasal bileşiklerin kimyasal haritalarını üretmek için bir iş akışını tanımlayan bir protokol sunulmaktadır. Açıklanan çalışma bazı lazer fizikçileri ve doğrusal olmayan mikroskopistler için önemsiz olsa da, bilimsel bilgisi bu alanların dışında bulunan geniş bant SRS mikroskobunun faydalarıyla ilgilenen okuyucular için durum böyle olmayabilir. Bu nedenle, geniş bant SRS mikroskobu ile ilgilenen geniş kitleye rehberlik etmek için her adımı detaylandırmayı amaçladık.

Eldeki protokol, birkaç güçlü ve iyi bilinen Raman saçılımcısından oluşan basit ama spektroskopik olarak zengin bir numunenin nasıl hazırlanacağını göstererek başladı. SRS mikroskobu kurmak için gerekli olan geniş bant pompa ve dar bant Stokes ışınlarının nasıl elde edileceğini tartıştık. Şekil 5C, SHG ve OPO kurulumlarının bir şemasını göstermektedir. F 1 numaralı lensin SHG’yi üretmek için temel ışını LBO_1’e odakladığını, dikroik bir aynanın SHG radyasyonunu yansıttığını ve artık temel ışını ilettiğini unutmayın. İkinci bir lens f_2, SHG ışınını harmanlar. F 2> f 1 olarak, SHG ışını f₂ / f_1’e eşit bir faktörle genişletilir. Üçüncü bir lens f_3, genişletilmiş SHG ışınını θ = 90 ° ve φ = 29.0 ° ‘de kesilmiş ikinci bir Tip I LBO kristaline (LBO 2) odaklar. LBO 2’yi yukarıda belirtilen SGH (₅₂₀ nm) ile pompalayarak, 680-910 nm aralığındaki radyasyon, LBO_2’den fark frekansı üretimi (DFG) yoluyla ortaya çıkacak ve iki ışın üretecektir: sinyal ve avara²⁷ (Şekil 5D, E). İkincisi, SRS deneylerinde kullanılan pompa darbelerini iletmek için OPO boşluğunda yükseltilirken atılır. OPO’nun 520 nm’deki pompası, yani SHG ışını, SRS deneylerinin pompasıyla (yani, OPO’nun sinyal ışını) karıştırılmamalıdır.

SRS mikroskobundaki kontrast, mikroskopun odak noktasında üretilen doğrusal olmayan bir sinyalden, belirli bir zamanda örnek düzlemde çok sayıda fotonun sınırlandırılmasını gerektiren bir sinyalden kaynaklanır. Bu foton hapsi, sistemin uzamsal çözünürlüğünü de ayarlayan bir dizi lens olan yüksek sayısal açıklıklı (NA) mikroskop hedefi ile elde edilir: NA ne kadar yüksek olursa, uzamsal çözünürlük o kadar yüksek olur. Bununla birlikte, yüksek NA hedefleri, darbeli radyasyona pozitif GDD’yi tanıtan, sonuçta darbelerin zamansal profilini genişleten bir frekans cıvıltısı olan camla yoğun bir şekilde paketlenmiştir³⁹. Bu nedenle, mikroskop hedefi tarafından tanıtılan GDD, geniş bant pompa darbelerinin süresini artırabilir, bu da onu Stokes zamansal zarfından daha uzun hale getirebilir ve Raman sinyalinin etkili, erişilebilir bant genişliğini azaltabilir. Ayrıca, bu genişleme, ölçülen SRS spektrumunun spektral profilinin bozulmasına da neden olabilir.

CARS’da, spektroskopik olarak ilgili sinyal, uyarma alanlarınınkinden farklı dalga boylarında ortaya çıkar. Basit bir fotoçarpan tüpü veya şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera, CARS sinyalini zamanında entegre etmek için kullanılabilir ve lazer gürültüsünün ortalamasını almak için binlerce darbeyi toplar. Bunun yerine, SRS sinyali güçlü ve dalgalı bir lazer arka planına gömülü soluk bir modülasyon transferi olarak görünür. Bu modülasyon zayıf olduğu için, lazer gürültüsü onu kolayca bastırabilir ve SRS mikroskobunun hem görüntüleme hızını hem de hassasiyetini azaltabilir. Bu nedenle, görüntülemeden önce, lazerin yüksek hızlı SRS görüntüleme için uygun olup olmadığını belirlemek ve en düşük gürültüye sahip modülasyon frekansını seçmek için göreceli yoğunluk gürültüsünü (RIN) ölçmek zorunludur. RIN, ortalama optik güç ()^40,41 ile normalleştirilen lazerin gürültü gücü spektral yoğunluğu [δP (f), W² / Hz birimleri ile] olarak tanımlanır. Başka bir deyişle, RIN farklı frekanslardaki normalleştirilmiş lazer dalgalanmalarını tanımlar (Eq [4]).

(4)

Bu nedenle, RIN, deneyler için ideal modülasyon frekans aralığını belirleyen SRS sisteminin bir parametresidir. Örneğin, Şekil 8’deki zeytin çubuğu, SRS görüntüleme için ideal modülasyon frekans aralığını göstermektedir. Dar bant SRS durumunda, kullanıcı optimum performans elde etmek için hangi kirişin modüle edilmesi gerektiğini seçmek için hem pompanın hem de Stokes’un RIN’ini ölçmelidir. Örneğin, Şekil 8’den, Stokes ışınının pompadan biraz daha yüksek bir RIN’e sahip olduğunu ve SRG ölçümlerinin SRL muadillerinden daha gürültülü olacağını ima ettiğini unutmayın. Geniş bant SRS durumunda, modüle edilmesi gereken ışın dar bant kirişidir.

Izgaranın açısal dağılımı D , kırınım açısını dalga boyunun bir fonksiyonu olarak ifade eder ve ızgara denkleminin türevi olarak tanımlanır. Littrow konfigürasyonu için, açısal dağılım Eq (5) tarafından verilir.

(5)

Eq (5)’i elde etmek için α = β varsaydık , m/d için Eq (2)’yi çözdük ve sonucu d’ye β/d λ. Littrow konfigürasyonunda β = ^sin-1(m λ/2 d) olarakekledik. Küçük açılı yaklaşım içinde, spektrum boyunca pozisyondaki değişim fdβ ≈ dl’dir (Şekil 10). Böylece, Eq (5) içine d β ekleyerek, Eq(6) kullanarak nm ^mm-1 birimlerine sahip bir miktar olan doğrusal dağılımı hesaplayabiliriz:

(6)

Littrow konfigürasyonunda 1.851,85 oluk/mm ile çalışan bir kırınım ızgarası için, d = 540 nm. Işığın birinci dereceden kırınımını ~789 nm’de kullanırsak, D = 0.0027 rad nm-1. Bir f = 750 mm lens ile, 0.5 nm mm-1’≈ doğrusal bir dağılım elde ediyoruz ve 7.8 ^cm-1 ^mm-1‘≈ çevriliyoruz. Böylece, lensin odak uzaklığı, dedektör düzleminde mm başına nm’nin “yoğunluğunu” belirler: Odak uzaklığı ne kadar uzun olursa, elde edilen mm başına o kadar az nm, geniş bant pompasının spektral çizgileri arasındaki boşluğu arttırır. Tersine, daha kısa odak uzaklıklarıyla, dedektör düzleminde mm başına daha fazla nm olacak ve dağınık pompanın kapladığı alanı azaltacaktır.

Dengeli algılama, gürültülü kurulumların görüntü kalitesini ve hassasiyetini artırır. Örneğin, Şekil 8’de gösterilen RIN spektrumlarına göre ve 1 x 10-5 genliğe sahip tipik SRS göz önüne alındığında, dengesiz ^{sinyal-gürültü} oranı (SNR) ≈60’tır. Dengeli algılama kullanarak (yani atış gürültüsüne yakın), ≈145’lik bir SNR elde etmek mümkündür. Şekil 11, dengeli ve dengesiz koşullar altında spektrumları ve kompozit görüntüleri göstermektedir. Doğal olarak, dengeli algılamanın etkileri, deneylerin nihai sonuçlarını, yani kimyasal haritaları etkiler. Bu sonuçlarla desteklenerek, dengeli algılamanın, lazer dalgalanmalarının görüntü kalitesi üzerindeki zararlı etkilerine karşı koymak için güçlü bir teknik olduğunu vurguluyoruz. Dengeli algılamanın, fiber osilatörler gibi gürültülü lazerler için en uygun olduğunu belirtmekte fayda var. Sessiz optik ışık kaynaklarıyla (örneğin, katı hal lazerleri) çalışan SRS mikroskopları dengeli algılama gerektirmeyebilir.

Protokol ayrıca, bu ışınların darbeleri arasındaki uzaysal zamansal örtüşmeyi bulmak için doğrusal olmayan optiklere dayanan bir yaklaşımı da açıklamaktadır. Modüle edilmiş Stokes ışını olarak bir AOM’nin 0. kırınım sırası yerine 1^st’yi kullanmanın avantajlarını açıkladık. Ayrıca, dispersiyonun SRS üretim verimliliği üzerindeki zararlı etkileri, bir prizma kompresörü aracılığıyla bunları azaltmanın yolları ile açıklanmıştır. Ek olarak, protokol prizmaların nasıl hizalanacağını açıklar ve optimum performans için dikkate alınması gereken üç kritik hususu vurgular. Sadece SRS mikroskobu için RIN’in alaka düzeyini tartışmakla kalmıyoruz, aynı zamanda kilitli bir amplifikatörle nasıl ölçüleceğini ve RIN spektrumu ile en iyi modülasyon frekansını nasıl tanımlayacağımızı da gösteriyoruz. Somut bir örnekle, bu makale ızgara denkleminin algılama zincirinin tasarlanmasında nasıl yardımcı olduğunu açıklamaktadır. Son olarak, protokol, gerçek SRS verileriyle, SRS hiperküpünün yapısını ve geleneksel olarak kullanılan bir bilimsel programlama dili ile nasıl analiz edileceğini göstermektedir.

Bu protokolün üç küçük sınırlaması vardır. İlk olarak, bu katkıda kullanılan algılama şeması, Sciortino ve ark. tarafından şirket içinde tasarlanan ve inşa edilen geleneksel olmayan, çok kanallı bir kilitleme dedektöründen oluşur.26 Daha önce gösterildiği gibi ²⁵, bu dedektör kullanıma hazır dengeli bir fotodiyot ile değiştirilebilir. Her ne kadar bu modifikasyon sadece dedektörü ilgilendirse ve protokolü neredeyse hiç değiştirmeden bıraksa da, tek bir fotodiyot ile, hepsini bir kerede ölçmek yerine dedektör üzerindeki her spektral bileşenin taranması gerekir. İkincisi, bu protokol, ışın yoluna birkaç optik eleman eklemeyi gerektiren satır içi dengeli algılama kullanır. Bu optik elemanlar sistem karmaşıklığını arttırır ve optik güç kayıplarına ve darbe genişlemesine yol açar.

Hat içi dengeli algılama aynı zamanda iki pompa replikasının numuneden geçmesini gerektirir; bu, canlı hücreler gibi ışığa duyarlı numuneler veya iki pompa replikasının farklı optik özelliklere sahip olabileceği güçlü iki parçalı numuneler için ideal olmayabilecek bir durumdur ve böylece dengeli algılamayı iptal eder. Üçüncüsü, protokol, kolayca bulunamayan bir cihaz olan ev yapımı bir OPO’ya dayanıyor. Bununla birlikte, OPO tarafından sunulan geniş bant spektrumlarına alternatifler, doğrusal olmayan optik fiberlerden veya dökme kristallerden gelen süper sürekliliktir. İkincisi sadece düşük tekrarlama oranlı lazerlerle (5 MHz’e kadar) kullanılabilir. Bu nedenle, her deneysel tasarımda olduğu gibi, eldeki protokolün de bazı sınırlamaları vardır. Ancak, bunlar minimaldir ve bu yaklaşımın başarısından ödün vermezler.

Burada bir referans örnek tarif edilmesine rağmen, bu protokol hücreler ve selüloz, lipidik türler veya proteinler gibi hayvan ve bitki dokuları içindeki kimyasal türleri başarılı bir şekilde çözebilir, farklı biyokimyasal arayışlarda pratik uygulamalar bulabilir veya histopatolojide bir teşhis aracı olarak kullanılabilir. Benzer şekilde, bu protokol malzeme bilimlerinde değerli bir araç olabilir. Örneğin, bu protokolü takiben, polimerik türlerin moleküler bileşimi ve konsantrasyonu sorgulanabilir⁴². Ayrıca, bu metodoloji, pompa-prob 43 ve heterodin^CARS ^44’e dayanan geniş bant mikroskopi, SRS’de olduğu gibi iki uyarma ışık demeti ve modülasyon-transfer ölçümleri gerektiren dört dalgalı karıştırma işlemleri gibi diğer doğrusal olmayan mikroskopi teknikleriyle de uyumludur. Son olarak, bu makalede yer alan bilgilerin bir kısmı, modülasyon transfer tekniklerine dayanmayan, ancak geleneksel CARS⁴⁵ ve SFG mikroskopileri⁴⁶ gibi iki veya daha fazla darbeli lazer ışınının hizalanmasını gerektiren doğrusal olmayan görüntüleme tekniklerine uygulanabilir.

Özetle, bu protokol, kimyasal haritaları ve karakteristik SRS spektrumlarını kimyasal olarak heterojen karışımlardan çıkarmak için geniş bant SRS mikroskobuna dayanan güçlü bir metodolojiyi açıklar ve basit nicel veri analizine izin veren veri kümeleri sunar. Yöntemin çok yönlülüğü ve basitliği, ilgilenen okuyucuya onu farklı doğrusal olmayan tekniklere uyarlama imkanı da verir.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D. P., 101016923 No’lu Hibe Anlaşması kapsamında Avrupa Birliği projesi CRIMSON’dan ve Hibe Anlaşması No. kapsamında Regione Lombardia projesi NEWMED’den gelen finansmanı kabul eder. POR FESR 2014-2020. G. C., 881603 numaralı hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği projesi GRAPHENE Core3’ün finansmanını kabul eder. G. C. ayrıca Kral Abdullah Bilim ve Teknoloji Üniversitesi, Hibe Ödül Numarası: OSR-2016-CRG5-3017-01’den gelen fonları da kabul ediyor.

Materials

Collection objective	Nikon	CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon	Oil immersion objective
Coverslips	Thermo Fisher	043211-KJ	Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Delay line	Physik Instrumente (PI)	M-406.6PD	Precision microtranslation stage, 150 mm travel range
DMSO	Merck	D8418-500ML	Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide
Etalon	SLS Optics Ltd	Custom made	Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring
Excitation objective	Nikon	CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon	Water immersion objective
Grating	LightSmyth	T-1850-800s Series	High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series
Laser	Coherent	Custom made	Fidelity, HP
λ/2	Thorlabs	SAHWP05M-1700	Mounted superachromatic half-wave plate
PBS	Thorlabs	CM5-PBS203/M	16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,
PMMA beads	Merck	MFCD00198073	Micro particles based on polymethacrylate
Prisms	Crisel	320-8218	LASER DISPERSING PRISMS in SF11
PS beads	Merck	72986-10ML-F	Micro particles based on polystyrene
YVO4 crystal	Dr. Sztatecsny GmbH	Custom made	thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 – 1,100 nm

References

Stewart, S., Priore, R. J., Nelson, M. P., Treado, P. J. Raman Imaging. Annual Review of Analytical Chemistry. 5 (1), 337-360 (2012).
Smekal, A. Zur quantentheorie der dispersion. Die Naturwissenschaften. 11 (43), 873-875 (1923).
Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
Vanna, R., et al. Vibrational imaging for label-free cancer diagnosis and classification. La Rivista del Nuovo Cimento. 45, 107-187 (2021).
Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
Hellwarth, R. W. Theory of stimulated Raman scattering. Physical Review. 130 (5), 1850-1852 (1963).
Maker, P. D., Terhune, R. W. Study of optical effects due to an induced polarization third order in the electric field strength. Physical Review. 137 (3), 801-818 (1965).
Bloembergen, N. The stimulated Raman effect. American Journal of Physics. 35 (11), 989-1023 (1967).
Levenson, M. D., Flytzanis, C., Bloembergen, N. Interference of resonant and nonresonant three-wave mixing in diamond. Physical Review B. 6 (10), 3962-3965 (1972).
Polli, D., Kumar, V., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G. Broadband coherent Raman scattering microscopy. Laser & Photonics Reviews. 12 (9), 1800020 (2018).
Rigneault, H., Berto, P. Tutorial: Coherent Raman light matter interaction processes. APL Photonics. 3 (9), 091101 (2018).
Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-stokes raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363 (2009).
Valensise, C. M., et al. Removing non-resonant background from CARS spectra via deep learning. APL Photonics. 5 (6), 061305 (2020).
Cheng, J. X., Xie, X. S. . Coherent Raman scattering microscopy. , (2012).
Slipchenko, M. N., Oglesbee, R. A., Zhang, D., Wu, W., Cheng, J. X. Heterodyne detected nonlinear optical imaging in a lock-in free manner. Journal of Biophotonics. 5 (10), 801-807 (2012).
Blume, R. J. Boxcar” integrator with long holding times. Review of Scientific Instruments. 32 (9), 1016-1018 (1961).
Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
Sarri, B., et al. Stimulated Raman histology: one to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5378 (2019).
Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
De la Cadena, A., et al. Broadband stimulated Raman imaging based on multi-channel lock-in detection for spectral histopathology. APL Photonics. 7 (7), (2022).
Dela Cadena, A., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G., Polli, D. Broadband stimulated Raman scattering microscopy with wavelength-scanning detection. Journal of Raman Spectroscopy. 51 (10), 1951-1959 (2020).
Sciortino, G., et al. Four-channel differential lock-in amplifiers with autobalancing network for stimulated Raman spectroscopy. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 56 (6), 1859-1870 (2021).
Coluccelli, N., et al. Tunable 30 fs light pulses at 1 W power level from a Yb-pumped optical parametric oscillator. Optics Letters. 42 (21), 4545 (2017).
Monmayrant, A., Weber, S., Chatel, B. A newcomer’s guide to ultrashort pulse shaping and characterization. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 43 (10), 103001 (2010).
Fork, R. L., Martinez, O. E., Gordon, J. P. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150 (1984).
Crisafi, F., et al. In-line balanced detection stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 10475 (2017).
Alem, M. Noise spectral density measured with lock-in amplifiers. Zurich Instruments Company Blog. , (2021).
Palmer, C., Loewen, E. G. . Diffraction grating handbook. , (2005).
. Multivariate curve resolution homepage Available from: https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/ (2021)
Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
de Juan, A., Jaumot, J., Tauler, R. Multivariate Curve Resolution (MCR). Solving the mixture analysis problem. Analytical Methods. 6 (14), 4964-4976 (2014).
Zhang, D., et al. Quantitative vibrational imaging by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy and multivariate curve resolution analysis. Analytical Chemistry. 85 (1), 98-106 (2013).
Chitra Ragupathy, I., Schweikhard, V., Zumbusch, A. Multivariate analysis of hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy images. Journal of Raman Spectroscopy. 52 (9), 1630-1642 (2021).
Brown, S. D., Tauler, R., Walczak, B. . Comprehensive Chemometrics: Chemical and Biochemical Data Analysis. , (2020).
Guild, J. B., Xu, C., Webb, W. W. Measurement of group delay dispersion of high numerical aperture objective lenses using two-photon excited fluorescence. Applied Optics. 36 (1), 397 (1997).
RP Photonics Encyclopedia. Article on "Relative Intensity Noise.&#34 Available from: https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html (2021)
Audier, X., Heuke, S., Volz, P., Rimke, I., Rigneault, H. Noise in stimulated Raman scattering measurement: From basics to practice. APL Photonics. 5 (1), 011101 (2020).
Xu, S., Camp, C. H., Lee, Y. J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for polymers. Journal of Polymer Science. , (2021).
Davydova, D., de al Cadena, A., Akimov, D., Dietzek, B. Transient absorption microscopy: advances in chemical imaging of photoinduced dynamics. Laser & Photonics Reviews. 10 (1), 62-81 (2016).
Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241 (2006).
Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Journal of the Optical Society of America B. 19 (6), 1363 (2002).
Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. H., Potma, E. O. Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy. Optics Letters. 36 (19), 3891 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

De la Cadena, A., Vernuccio, F., Talone, B., Bresci, A., Ceconello, C., Das, S., Vanna, R., Cerullo, G., Polli, D. Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63709, doi:10.3791/63709 (2022).