Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy

Alejandro De la Cadena; Federico Vernuccio; Benedetta Talone; Arianna Bresci; Chiara Ceconello; Subir Das; Renzo Vanna; Giulio Cerullo; Dario Polli

doi:10.3791/63709

JoVE Journal > Engineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Ingénierie

Мультиплексная химическая визуализация на основе широкополосной стимулированной рамановской рассеянной микроскопии

Published: July 25, 2022

doi:

10.3791/63709

Alejandro De la Cadena¹, Federico Vernuccio¹, Benedetta Talone¹, Arianna Bresci¹, Chiara Ceconello¹, Subir Das¹, Renzo Vanna², Giulio Cerullo^1,2, Dario Polli^1,2

¹Dipartimento di Fisica,Politecnico di Milano, ²Institute for Photonics and Nanotechnologies (IFN-CNR)

Summary

Представлен протокол получения химических изображений с помощью широкополосной стимулированной рамановской рассеяния (SRS) микроскопии. Основанный на микроскопе SRS, который работает с дифференциальным многоканальным обнаружением блокировки, протокол описывает подготовку образцов, настройку аппарата SRS и хемометрию для распутывания различных компонентов химически гетерогенных образцов.

Abstract

Микроскопия стимулированного рамановского рассеяния (SRS) является нелинейным оптическим методом для химической визуализации без маркировки. Этот аналитический инструмент предоставляет химические карты с высокой скоростью и высоким пространственным разрешением тонких образцов путем непосредственного опроса их молекулярных колебаний. В своей стандартной реализации микроскопия SRS является узкополосной и формирует изображения только с одной вибрационной частотой одновременно. Однако такой подход не только препятствует химической специфичности SRS, но и пренебрегает богатством информации, закодированной в вибрационных спектрах.

Эти ограничения могут быть преодолены широкополосной SRS, реализацией, способной извлекать вибрационный спектр на пиксель изображения параллельно. Это обеспечивает гиперспектральные данные, которые в сочетании с хемометрическим анализом максимизируют объем информации, полученной из образца. Таким образом, широкополосные СГД улучшают химическую специфичность системы, позволяя количественно определять концентрацию различных составляющих образца. Здесь мы сообщаем о протоколе химической визуализации с широкополосной микроскопией SRS, основанном на домашнем микроскопе SRS, работающем с пользовательским дифференциальным многоканальным усилителем с блокировкой. В нем обсуждается пробоподготовка, выравнивание аппарата SRS и хемометрический анализ. Приобретая вибрационные рамановские спектры, протокол иллюстрирует, как идентифицировать различные химические виды в смеси, определяя их относительные концентрации.

Introduction

Рамановская микроскопия является мощным методом визуализации, который предоставляет богатые химические карты путем измерения рамановского рассеяния¹, неупругого радиационного процесса, который происходит от молекул, вибрирующих в ответ на^{падающий} свет ^2,3. Каждый пиксель рамановской карты содержит спектр, который несет прямую информацию о химическом составе и структуре образца, что приводит к изображениям с присущим ему вибрационным контрастом. На сегодняшний день рамановская микроскопия является эталонной точкой зрения для микроспектроскопических исследований молекулярных колебаний, поскольку ни один другой метод визуализации не может производить изображения как с высокой химической специфичностью, так и с высоким пространственным разрешением⁴. Несмотря на выдающуюся химическую специфичность, эффективность генерации комбинационного рассеяния низкая, что требует либо увеличенного времени выдержки пикселей, либо мощного возбуждения, что приводит, соответственно, к низкой скорости сбора и несовместимости с чувствительными образцами.

Этот единственный недостаток рамановской микроскопии заставил исследователей применить когерентное рамановское рассеяние ^5,6,7,8,9 в качестве источника контраста для микроскопии. Это нелинейный оптический процесс, который усиливает вибрационный отклик на несколько (до семи) порядков величины, что позволяет высокоскоростную химическую визуализацию 10,11,12,13. В частности, двумя наиболее используемыми когерентными методами комбинационного рассеяния являются когерентное рамановское рассеяние против Стокса (CARS)¹⁴ и стимулированное комбинационное рассеяние (SRS)¹⁵. В отличие от CARS, SRS показывает линейную зависимость от концентрации резонансных молекул. Он невосприимчив к нерезонансному фону, нелинейному эффекту, не связанному с каким-либо вибрационным переходом, но искажающему лоренцевы формы, характерные для рамановских спектров молекулярных^{колебаний} ^16,17. Таким образом, микроскопия SRS дает достоверную рамановскую информацию, которая позволяет проводить прямой количественный анализ изображений.

SRS – это нелинейный оптический процесс третьего порядка, который предоставляет прямую информацию о химических связях образца. Он происходит от пространственно-временной суперпозиции двух оптических полей, как правило, в ближней инфракрасной области спектра, а именно насоса и Стокса на частоте ω_pu и ω_S соответственно 10,11,18. Эта суперпозиция порождает биение при расстройке частоты насоса-Стокса Ω = ω_pu-ω _S. Когда Ω соответствует молекулярной вибрации Ω_R, молекула резонирует, вызывая когерентный перенос энергии между световыми полями и молекулой. В результате молекула достигает вибрационно возбужденного состояния. Этот процесс можно контролировать путем измерения либо аннигиляции фотонов насоса (сигнал, известный как стимулированные рамановские потери [SRL]), либо сопутствующего усиления фотонов Стокса (процесс, известный как стимулированный комбинационный коэффициент усиления [SRG]). SRG и SRL представляют собой небольшие сигналы (ΔI), которые находятся поверх интенсивного и колеблющегося фона (I). Поскольку типичные значения сигнала SRS (ΔI/I) находятся в диапазоне 10-6-10-4, лазерный шум может легко скрыть его. Чтобы смягчить пагубное влияние лазерного шума на отношение сигнал/шум (SNR) и, следовательно, на скорость изображения, обнаружение SRS опирается на методы передачи модуляции (например, блокирующие усилители, резонансные схемы или усреднения коробчатых вагонов) на высоких частотах модуляции (>1 МГц), где лазерный шум достигает своих минимальных значений 15,19,20.

Обычная микроскопия SRS использует узкополосный (≈10 см⁻¹) насос и импульсы Стокса для получения химических изображений на одной вибрационной частоте, что позволяет получать видеоскорректную визуализацию со временем выдержки пикселей всего ≈^{100 нс 21,22}. Однако, поскольку узкополосная микроскопия SRS формирует химические карты путем последовательного сканирования образца только на нескольких вибрационных частотах, его информация ограничена²³. Изображений SRS с одним или двумя вибрационными контрастами может быть недостаточно для дифференциации химических веществ с перекрывающимися рамановскими полосами, особенно в гетерогенных системах. Поэтому парадигматический узкополосный микроскоп SRS не использует весь потенциал SRS, потому что исследование нескольких вибрационных частот препятствует его химической специфичности и пренебрегает богатством информации, закодированной в вибрационных спектрах. Кроме того, последовательное сканирование образца на разных частотах приводит к увеличению времени ожидания пикселей, что может вызвать фотоповреждение и предотвратить строгую пространственную сигастрацию между последовательными изображениями, что приводит к артефактам движения.

В отличие от своего узкополосного аналога, широкополосная микроскопия SRS извлекает вибрационный спектр на пиксель при каждом сканировании образца 10,12,24. Таким образом, широкополосная SRS обеспечивает гиперспектральную визуализацию со строгой пространственной соотнесением различных вибрационных контрастов, что позволяет проводить тщательный анализ данных. Это не только выявляет химические составляющие образца через рамановские спектры, но и помогает определить их относительные концентрации. В зависимости от того, как получены спектры, широкополосная микроскопия SRS классифицируется либо как гиперспектральная SRS, либо как мультиплексная SRS. В гиперспектральной SRS спектр SRS на сканируемую точку образца приобретается последовательно (т. е. он извлекается путем развертки Ω развертки частоты), создавая спектр SRS путем объединения сигналов SRS при последовательных рамановских сдвигах. Рамановский спектр измеряется одновременно в нескольких колебательных режимах в мультиплексных SRS. Таким образом, мультиплексный подход SRS сочетает в себе модулированный узкополосный импульс с широкополосным импульсом для управления сигналом SRS на разных частотах и использует многоканальный детектор с чувствительностью, сопоставимой с чувствительностью узкополосной SRS для обнаружения спектров SRS.

В данной работе представлен протокол для получения химических карт гетерогенных образцов с использованием мультиплексной SRS-микроскопии. Схема микроскопа SRS, используемого в этом протоколе, изображена на рисунке 1 и подробно описана в другом месте 25,26,27. Короче говоря, коммерческий волоконный лазер Yb с блокировкой в режиме, производящий импульсы 140 fs, центрированные на 1040 нм, со средней мощностью 10 Вт и частотой повторения 80 МГц, управляет широкополосным микроскопом SRS. Поляризационный делитель пучка (PBS) разделяет фундаментальный луч на две ветви. Для получения узкополосных импульсов Стокса одна ветвь с 4 Вт основного пучка посылается на эталон, который генерирует узкополосный (≈15 ^см-1) луч, который затем модулируется на частоте 1,6 МГц с помощью акустического оптического модулятора (AOM). Оставшаяся фракция с 6 Вт основного пучка удваивается по частоте кристаллом трибората лития (LBO) толщиной 2,8 мм, вырезанным для согласования фаз типа I (θ = 90°, φ = 13,8°). Полученная вторая генерация гармоник при 520 нм перемещается в X-сложенную полость для накачки оптического параметрического генератора (OPO), устройства, которое использует кристалл LBO толщиной 3,0 мм (фазовое соответствие типа I, θ = 90°, φ = 9,8°) в качестве активной среды для доставки широкополосного оптического излучения, перестраиваемого в спектральной области 680-910 нм (рисунок 2). Эти широкополосные импульсы служат насосом в экспериментах SRS и распространяются на призматический компрессор для предварительной компенсации дисперсионных эффектов, индуцированных объективом микроскопа.

После стадии сжатия волновая пластина λ/2 в сочетании с двулучепреломляющей пластиной YVO₄ производит две ортогонально поляризованные реплики, электронное вычитание которых на плоскости обнаружения компенсирует шум широкополосного насоса. Дихроичное зеркало объединяет лучи насоса и Стокса и отправляет их в вертикальный микроскоп. Объектив погружения в воду с числовой диафрагмой (NA) 1,27 фокусирует свет на образце, в то время как масляный объектив с NA 1,4 собирает его. Перед этапом обнаружения фильтр коротких частот (SPF) удаляет модулированный Стокс, в то время как дифракционная решетка, работающая в конфигурации Littrow, рассеивает передаваемый широкополосный насос. Второй PBS₂ разделяет реплики насоса, а объектив фокусирует их на двух массивах фотодиодов. Сигналы от этих фотодиодных массивов вычитаются электронным способом и отправляются на домашний многоканальный усилитель с блокировкой (M-LIA). Демодулированный сигнал затем нормализуется показаниями постоянного тока (DC) одного из фотодиодных массивов, создавая таким образом спектр SRL.

В качестве образцового эксперимента мы изображаем смеси нескольких известных рамановских рассеивателей, каждый из которых имеет уникальный рамановский спектр. Таким образом, протокол начинается с описания того, как подготовить эталонные образцы. По мере обнаружения SRL мы продолжаем объяснять, как получить узкополосные импульсы Стокса и настроить оптический источник, который подает импульсы широкополосного насоса (≈250 ^см-1), а именно самодельный OPO. Протокол показывает выравнивание и оптимизацию оптических лучей, описывая критические параметры, такие как мощность и спектры узкополосного Стокса и широкополосного насоса. Протокол подробно описывает оптический тракт широкополосного насоса, поскольку для этого требуются специальные оптические элементы. Он также объясняет, как найти пространственно-временное перекрытие между импульсами насоса-Стокса и показывает практический способ определения шума относительной интенсивности (RIN), что, в свою очередь, помогает определить лучшую частоту модуляции для экспериментов SRS. Затем мы объясняем принцип работы и калибровку цепи обнаружения. Наконец, протокол показывает процесс сбора данных, хемометрику и конвейер обработки изображений.

Protocol

1. Пробоподготовка ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий протокол описывает извлечение карт концентраций и характерных спектров SRS химически гетерогенных смесей. Чтобы подготовить образец, извлеките 2 мкл из водной суспензии микрогранул полиметилметакрилата (ПММА) (см. Таблицу материалов) и вылейте фракцию 2 мкл на крышку микроскопа. С помощью чистого наконечника пипетки извлеките 2 мкл из водной суспензии микрошариков из полистирола (PS) и соедините ее со суспензией ПММА на крышке. Используя наконечник пипетки, аккуратно перемешайте суспензию и дайте ей высохнуть в течение 24 часов.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно тщательно соответствовать концентрации суспензий микрогранул, чтобы избежать непропорционального количества микрогранул на поверхности образца. Диаметр шариков PS и PMMA составляет 10 и 6 мкм соответственно. Эти размеры позволяют продемонстрировать высокое пространственное разрешение микроскопа без ущерба для эффективности генерации SRS. Поверх плоского белого слоя бусин, который появится, когда вода высохнет, добавьте 20 мкл диметилсульфоксида (DMSO), а затем 20 мкл чистого оливкового масла. Нанесите лак для ногтей на края второй крышки микроскопа. Поместите обшивку на смесь лаком для ногтей вниз, оказывая достаточное давление, чтобы запечатать ее. Дайте высохнуть.ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3 показаны примерные результаты, полученные с помощью этих шагов. При правильном запечатывании этот образец должен прослужить до трех месяцев. 2. Оптимизация насоса и балок Стокса Включите лазер и дайте ему достичь теплового равновесия. Примените дисперсию задержки отрицательной группы (GDD) GDD = -6000 fs2 к основному пучку.ПРИМЕЧАНИЕ: Это значение GDD имеет решающее значение для успешного управления OPO и является оптимальным для этой установки, но, вероятно, будет варьироваться в разных системах. Отрицательный GDD может быть введен через пары решеток, призматические компрессоры или импульсные шейперы на основе пространственных модуляторовсвета 28. Разделите фундаментальный лазер поляризационным светоделителем (PBS1) на две ветви. Чтобы получить узкополосные импульсы Стокса, направьте одну ветвь с 4 Вт на эталон. Слегка поверните эталон до тех пор, пока не будет получена узкая спектральная линия и центрирована на пике спектра импульсов (см. красную кривую на рисунке 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эталон имеет эффективную утонченность 29 и свободный спектральный диапазон 29,8 нм при 1040 нм. Чтобы получить модулированные импульсы Стокса, отправьте узкополосный луч на акустооптический модулятор.ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано на рисунке 4A, дифрагированный луч первого порядка испытывает 100% модуляцию, в то время как нулевой порядок только 50%. Поэтому предпочтительно использовать первый порядок, чтобы избежать освещения образца сильным немодулированным пучком, который может вызвать фотоповреждение образца без генерации какого-либо сигнала SRS. Чтобы оптимизировать эффективность модуляции, измените расстояние между объективами f1 и f2 (рисунок 4B). Измерьте модулированный луч фотодиодом и запишите его профиль с помощью осциллографа. Изменяйте расстояние между f1 и f2 до тех пор, пока не будет достигнут максимальный контраст между амплитудой и базовой линией показаний осциллографа.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта пара линз не работает как коллиматор, а скорее создает эффективное фокальное пятно на кристалле AOM. Поместите третью линзу f3 для тонкой настройки талии луча Стокса, позволяя изменять громкость взаимодействия в фокальной плоскости микроскопа и, следовательно, оптимизировать сигнал SRS.ПРИМЕЧАНИЕ: Луч Стокса модулировался на частоте 1,6 МГц в этом протоколе. Сфокусируйте оставшиеся 6 Вт оптической мощности основного пучка на кристалл трибората лития (LBO) (LBO1, θ = 90°, φ = 13,8°) на удвоение частоты фундаментального пучка через генерацию второй гармоники (SHG) (рисунок 5A). Чтобы максимизировать эффективность SHG, слегка поверните кристалл, изменяя угол φ (рисунок 5B). Оптимизируйте LBO1 , чтобы получить не менее 2,5 Вт SHG. Отрегулируйте угол φ LBO2 , чтобы максимизировать эффективность генерации сигнального луча.ПРИМЕЧАНИЕ: Фокусные расстояния объективов f1, f2 и f3 были тщательно подобраны для согласования режима луча SHG с полостью OPO. Таким образом, фокусные расстояния этих объективов будут варьироваться в разных настройках. Из-за остаточной дисперсии в полости OPO незначительное изменение длины полости вызывает смещение спектра сигнального пучка. Отрегулируйте длину полости, чтобы получить спектр насоса, который вместе с узкополосным Стоксом на 1040 нм может производить расстройку частоты в пределах 1,373-5,090 см-1. Этот диапазон охватывает колебания в спектральной области растяжения CH (2 800-3 050 см-1). Смотрите синие спектры на рисунке 2. Чтобы компенсировать дисперсионные эффекты, индуцированные объективом микроскопа возбуждения, отправьте широкополосный насос в призменный компрессор. Введите насос в призму А через ее вершину и направьте дисперсный насос к вершине призмы В. Определите необходимое количество отрицательной дисперсии, а затем установите расстояние между вершинами призм L соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 6 показано расположение призм29. В этом случае компенсация была установлена для GDD ≈ -12 800 fs2; следовательно, L = 1,26 м. Используйте призмы Брюстера. Убедитесь, что поляризация пучка насоса лежит в треугольных плоскостях призм (верхние/нижние неотшлифованные грани). Убедитесь, что угол падения θв пучке насоса соответствует углу Брюстера. Убедитесь, что выходная грань призмы А параллельна входной грани призмы В. Чтобы оценить GDD широкополосного импульса, подлежащего компенсации, измерьте сигнал SRS на одной длине волны λ1, записав временную задержку τ1 между насосами-Стоксами, при которой получается максимальный SRS(λ1). Повторите эту процедуру для второй длины волны λ2, снова регистрируя временную задержку τ2 , при которой SRS(λ2) была максимальной.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку GDD определяется как производная от групповой задержки по отношению к угловой частоте, вышеупомянутые измерения позволяют оценить GDD широкополосного луча (Eq [1]).(1) Используя волновую пластину λ/2, установите поляризацию пучка насоса на 45°. Направьте поляризованный насос на пластину YVO4 длиной 13,3 мм, установив вертикальную быструю ось этого двулучепреломляющего кристалла.ПРИМЕЧАНИЕ: При прохождении через пластину YVO4 импульсы насоса будут разделены на две ортогонально поляризованные реплики, распространяющиеся коллинеарно, но сохраняющие задержку Δt ≈ 10 пс между ними. Эта задержка является функцией толщины и показателей преломления двулучепреломляющего кристалла. В дальнейшем реплики насоса с тем же поляризационным состоянием импульсов Стокса будут называться «сигнальными», а те, которые имеют ортогональное состояние, — «эталонными». Детали этого метода, называемого встроенным сбалансированным обнаружением, были описаны ранее30. Объедините насос и пучки Стокса с дихроичным зеркалом и тщательно выровняйте их, используя пару флуоресцентных точечных отверстий, гарантируя, что оба они распространяются коллинеарно. Ослабьте лучи и используйте объектив, чтобы сфокусировать их на быстром (полоса пропускания не менее 100 МГц) фотодиоде. Блокируйте насос и измеряйте одиночные импульсы Стокса с помощью цифрового осциллографа с высокой пропускной способностью. Используйте триггерный сигнал лазера в качестве тактового источника для измерений осциллографа. Определите среднее значение, при котором напряжение фотодиода достигает своего максимума. Заблокируйте пучок Стокса и повторите эту процедуру для импульсов насоса. Увеличивайте или уменьшайте оптический путь пучка насоса (Стокса) до тех пор, пока его импульсы не поступят примерно в то же время, что и импульсы Стокса (насоса).ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно гарантировать точность не более нескольких миллиметров при совпадении разницы оптических путей между двумя рычагами. Извлеките фотодиод и поместите нелинейный кристалл с подходящим углом среза для генерации суммарных частот (SFG) между фотонами Насоса-Стокса.ПРИМЕЧАНИЕ: Нелинейный кристалл, используемый здесь, был разрезан для согласования фаз типа I, θ = 90°, φ = 9,8°. Оптическая ось нелинейного кристалла должна быть параллельна поляризации Стокса и сигнальным импульсам. Сделайте пучки насоса/Стокса слегка неколлинеарными и переместите линию задержки до SFG, сигнала, который из-за соответствия фаз находится между SHG насоса и пучками Стокса. Если сигнал не найден, проверьте пространственное перекрытие двух лучей на кристалле.ПРИМЕЧАНИЕ: SFG смещен в синий цвет и должен быть хорошо виден невооруженным глазом. В случае непредвиденных трудностей установите фильтр нижних частот для удаления насоса и Stokes и их соответствующих SHG и измерьте SFG с помощью спектрометра (рисунок 7A). Найдите временную задержку, при которой SFG достигает своей максимальной интенсивности, значение, которое определяет идеальное пространственно-временное перекрытие, необходимое для генерации нелинейного сигнала, и зафиксируйте там линию задержки (рисунок 7B). Измерьте профили луча с помощью калиброванной камеры. В качестве альтернативы можно использовать инфракрасную карту и оценить диаметры на глаз. Используйте два телескопа, один для насоса, а другой для луча Стокса. С помощью этих телескопов старайтесь сопоставлять диаметры пучка с задней апертурой объекта возбуждения.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура гарантирует максимальное пространственное разрешение установки. Как только сигнал SRS получен, используйте телескоп на пучке насоса, чтобы настроить его диаметр, изменяя его рэлеевский диапазон и, следовательно, объем взаимодействия в фокусе микроскопа. Остановитесь, когда будет достигнут максимальный SRS. Используйте фотодиод для измерения интенсивности пучка насоса (Стокса) и, с учетом чувствительности фотодиода, рассчитайте среднюю мощность , воздействующую на активную область детектора. При использовании фотодиода с высокой пропускной способностью подключите электронный фильтр нижних частот, чтобы получить только константу или компонент постоянного тока. Для измерения δP(f) подключите выход фотодиода с высокой пропускной способностью (отключите фильтр нижних частот) к входу блокирующего усилителя. Храните блокирующий выход на разных частотах демодуляции и используйте ответственность фотодиода для преобразования из V в W.ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие блокирующие усилители имеют встроенные инструменты для измерения δP(f) (например, Zurich Instruments, встроенные в LabOne a Frequency Sweeper31). После измерения RIN лучей выключите лазер и измерьте электронный шум (т.е. RIN рассчитывается без какого-либо света на детекторах).ПРИМЕЧАНИЕ: При условии, что RIN ограничен лазерными колебаниями, а не шумом выстрела, это темное измерение поможет диагностировать приборы, используемые для измерений; если электронный шум равен RIN лазера, это не может быть использовано для измерения RIN лазера; Ультранизкие шумовые усилители, возможно, придется использовать для уменьшения электронного шума. Если RIN ограничен шумом выстрела, а не лазерным флуктуацией, излучайте больше оптической мощности на детектор. См. рисунок 8. 3. Настройка спектрального обнаружения для визуализации SRS Направьте насос и пучки Стокса к микроскопу. Поместите образец, описанный в разделе 1, и найдите область без шариков, чтобы помочь выровнять балку насоса. С помощью камеры измерьте отраженный профиль луча Стокса (насоса) при блокировке насоса (Стокс). Отрегулируйте положение лазерных пятен с помощью зеркал прямо перед микроскопом.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить самую высокую генерацию SRS, они должны идеально перекрываться. На рисунке 9 показаны (A) насос, (B) Stokes и (C) оба пучка идеально перекрываются в фокальной плоскости микроскопа. Сделайте цели возбуждения и сбора конфокальными.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование объективов с коррекцией бесконечности означает, что фокусировка насоса на плоскости образца приведет к коллимированному пучку на задней апертуре цели сбора. Поставьте фильтр коротких частот, чтобы удалить модулированный Stokes и направить балку насоса к решетке. Поместите линзу после решетки, чтобы сфокусировать рассеянный луч на детекторах.ПРИМЕЧАНИЕ: Уравнение решетки поможет определить линейную дисперсию (т.е. сколько нм на мм в плоскости детектора с линзой заданного фокусного расстояния f32). Уравнение решетки связывает периодичность канавок d решетки, угол падения α, угол дифракции β, дифрагированную длину волны λ и порядок дифракции m (Eq [2]). (2) Для сбалансированного обнаружения измерьте спектр опорного и сигнальных реплик, распространяющихся вдоль пучка насоса.ПРИМЕЧАНИЕ: Пространственный профиль пучка насоса после решетки представляет собой линию, содержащую различные спектральные компоненты широкополосного насоса по всей его длине. Каждый спектральный компонент насосной линии будет сфокусирован на расстоянии f сферической линзой (см. шаги 3.1-3.2). Чтобы избежать обрезания дисперсного насоса, поместите сферическую линзу как можно ближе к решетке. Поместите PBS сразу после сферической линзы, чтобы отделить реплики насоса.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовался поляризационный делитель пучка куба, потому что этот вид поляризатора не борется с поляризацией пучка насоса. Он также эффективно разделяет различные реплики насосов и может быть достаточно большим, чтобы избежать обрезания широкополосного насоса. PBS будет отражать реплику сигнала (s-поляризованный) и передавать эталонную реплику (p-поляризованную). С помощью пары рулевых зеркал направляйте сигнал и ссылайтесь на соответствующие детекторы (рисунок 1).ПРИМЕЧАНИЕ: В идеальной сбалансированной конфигурации сигнальная и опорная реплики должны иметь одинаковую оптическую мощность. Чтобы убрать шум в пучке насоса, соотнесите каналы фотодиодной решетки, измеряя сигнал, с их аналогами в опорном детекторе. Следовательно, убедитесь, чтоn-й фотодиод сигнала и эталонные фотодиодные массивы измеряют оптическую мощность одной и той же спектральной составляющей сигнала и эталонных реплик.ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 8 показаны примерные спектры RIN. Чтобы гарантировать спектральное соответствие между двумя матрицами фотодиодов, поместите небольшую щель или радужную оболочку между решеткой и PBS для пространственной фильтрации дисперсного насоса. Обрежьте все, кроме одного спектрального компонента реплик насоса, чтобы центрировать передаваемые лучи наn-м детекторе опорной и сигнальной фотодиодных матриц. Используйте упомянутые рулевые зеркала для регулировки корреляции различных каналов обнаружения. На этом этапе начните микроскопию SRS. Для этого модулируйте Стокса, растровое сканирование образца и получите передачу модуляции на спектре насоса (ΔI) с соответствующим спектром постоянного тока (I), чтобы получить нормализованный спектр SRS (ΔI / I) из каждого пикселя. Создание трехмерных матриц, строки (x) и столбцы (y) которых содержат отсканированные положения образца. На каждом векторе (z), ортогональном плоскости x-y, храните спектр SRS.ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 12 показана структура гиперспектральных данных SRS. Установите мощность луча Стокса на 65 мВт, а широкополосного пучка насоса на 20 мВт. Установите идеальное время интеграции для экспериментов.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь время интеграции составляло 44 мкс; однако время ожидания пикселя составило 1 мс из-за медленного пьезосканера. 4. Хемометрия гиперспектральных данных СГД Используйте многомерный анализ разрешения кривых, чтобы распутать различные химические компоненты образца. Загрузите графический интерфейс по ссылке в Tauler, de Juan и Jaumot33.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь была использована программа MATLAB с многомерным разрешением кривых и чередованием наименьших квадратов (MCR-ALS), разработанная Таулером и его коллегами, 34,35. Информацию о применении MCR-ALS к данным SRS см. в пункте 36,37; подробные обсуждения алгоритма см. в пункте 38. В MATLAB измените форму гиперспектрального куба данных SRS в матрицу D со строками, содержащими спектры SRS. Предположим, что развернутый гиперкуб SRL D представляет собой линейную комбинацию концентрации C и спектральных профилей S химических составляющих образца (т.е. D = CS T + E, где E — матрица, содержащая экспериментальную ошибку, а надстрочный индекс T указывает на транспонирование матрицы). Получение основных компонентов данных для разделения C и S. Поскольку априори известно, что образец, обсуждаемый в разделе 1, содержит четыре вида, а именно DMSO, оливковое масло, PMMA и PS, настройте программу на поиск четырех видов плюс еще один для учета фонового шума. Если есть другой образец с большим или меньшим количеством видов, настройте программу соответствующим образом.ПРИМЕЧАНИЕ: Программа производит сингулярно-значную декомпозицию спектральных данных, используя их в качестве начальных догадок чистых спектров S. Альтернативно, наполнить программу матрицей, содержащей известные спектральные следы (например, спонтанные рамановские спектры веществ).ПРИМЕЧАНИЕ: Используя первоначальные оценки чистых спектров, программа рассчитает C = DS(STS)−1 и ST = (CTC)−1CTD. Новые значения C и S оптимизированы с помощью алгоритма чередования наименьших квадратов. Поскольку SRS является неотрицательным сигналом, ограничьте алгоритм чередования наименьших квадратов для получения только положительных значений.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизированные C и S позволят построить новую матрицу D*= CST, набор данных, который программа будет сравнивать с исходными данными D. Программа автоматически повторяет эти шаги до тех пор, пока разница между D* и D не станет меньше произвольного порогового значения, которое может быть определено. График C и S для получения химических изображений и характерных спектров химических составляющих образца.

Representative Results

На рисунке 3 показаны примерные результаты, полученные с использованием этого протокола с PS, PMMA и оливковым маслом. Это вращение LBO1 изменит показатель преломления, испытываемый полем SHG, непосредственно изменяя его фазовую скорость. Когда фазовая скорость поля SHG совпадает с скоростью нелинейной поляризации, индуцированной в LBO1, нелинейно генерируемое поле и нелинейная поляризация будут в фазе, что приведет к интенсивному излучению SHG. Другими словами, настройка угла φ LBO1 позволит пользователю достичь идеального состояния соответствия фаз для SHG. Поскольку здесь используется кристалл согласования фаз типа I, поляризация пучка SHG будет ортогональна поляризации фундаментального пучка (рисунок 5B). На рисунке 8 показан RIN оптических источников, используемых в этом протоколе, и предел шума выстрела, который является следствием квантовой природы электронов и фотонов, которая устанавливает фундаментальный предел лазерного шума. RIN с ограничением шума выстрела вычисляется с помощью Eq (3). (3) Где h — постоянная Планка, а ν — оптическая частота. Таким образом, шум выстрела обеспечивает полезные рекомендации для проектирования электроники. На рисунках 11A и 11C показаны примерные данные сбалансированных и несбалансированных спектров. Естественно, эффекты сбалансированного обнаружения влияют на конечные результаты экспериментов, а именно на химические карты. На рисунках 11B и 11D показаны составные изображения в несбалансированных и сбалансированных условиях соответственно. Успешная реализация описанного протокола поможет идентифицировать и локализовать различные химические составляющие гетерогенного образца и извлечь их характерные спектры SRS. Подвергая хемометрическому анализу гиперспектральные данные рисунка 12 , получается рисунок 13. На рисунке 13A показан композит карт концентраций различных химических компонентов образца, в то время как на рисунке 13B показаны их характерные спектры SRS. Обратите внимание, что данные, показанные на рисунке 13A , не только позволяют пользователю легко идентифицировать различные составляющие образца, но и выполнять более количественный анализ. Например, используя карты концентраций, мы могли бы рассчитать среднее значение фракционной концентрации каждого химического вида: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS и 22% оливкового масла. Рисунок 1: Схема широкополосного SRS-микроскопа, используемого в этом протоколе. Сокращения: PBSx = поляризационный светоделитель; SHG = модуль генерации второй гармоники; OPO = оптический параметрический генератор; AOM = акустооптический модулятор; SPF = фильтр коротких частот; M-LIA: Многоканальный усилитель с блокировкой; DM = дихроичное зеркало. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Спектры перестраиваемого широкополосного насоса (синий) и узкополосных (красный) лучей Стокса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Изображение Брайтфилда химически гетерогенного образца. Обратите внимание, что обычная микроскопия не позволяет различать различные компоненты. Шкала шкалы = 100 мкм. Сокращения: PS = полистирол; ПММА = полиметилметакрилат; ДМСО = диметилсульфоксид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Модуляция узкополосных импульсов Стокса. (А) Прозрачный синий след показывает0-й дифракционный луч, в то время как черный показывает соответствующий1-й порядок. (B) Оптическая установка для оптимизации эффективности модуляции дифрагированного пучка1-го порядка и тонкой настройки размера пятна луча Стокса до достижения цели возбуждения. Сокращения: AOM = акустооптический модулятор; fx = фокусное расстояние объектива X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Нелинейные оптические процессы, необходимые для управления OPO. (A) Геометрия взаимодействия SHG. Два фундаментальных фотона при ω1 выводят материальную систему на высокоэнергетический виртуальный уровень, откуда материальная система прыгает вниз в основное состояние, испуская фотон при ωSHG. (B) Схема эксперимента SHG. с) схема установок ГСП и ОПО. (D) Геометрия взаимодействия DFG. Фотон ωSHG разбивается на сигнальные (ωSignal) и направляющие (ωIdler) фотоны. Усиление сигнального пучка достигается за счет обратной подачи сигнальных фотонов и заставления их резонировать в полости. (E) Схема эксперимента DFG. Сокращения: SMx = сферическое зеркало (R = 75 мм); OPO = оптический параметрический генератор; SHG = модуль генерации второй гармоники; DFG = разночастотная генерация; LBO = триборат лития; OC = масляный конденсатор; DM = дихроичное зеркало; fx = фокусное расстояние объектива X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Геометрия призматического компрессора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 7: Генерация суммы частот для оптимизации пространственно-временного перекрытия. (A) SFG между насосом и Stokes и их соответствующим воздействием SHG на экран. Здесь объектив сфокусировал насос и лучи Стокса на кристалле, в то время как фильтр нижних частот удалил их. (B) Интенсивность SFG между насосом и Stokes в зависимости от временной задержки. Установите нулевое время настройки SRS в положении, которое максимизирует SFG. Асимметрия перекрестной корреляции в B обусловлена временным профилем, вызванным эталоном на пучке Стокса. Сокращения: SFG = суммарно-частотная генерация; SHG = модуль генерации второй гармоники; SRS = стимулированная рамановская спектроскопия рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 8: Спектры RIN. Полоса, выделенная зеленым цветом, показывает лучшую спектральную область для экспериментов SRS. Модуляция луча Стокса на любой частоте в пределах этой полосы гарантирует, что воздействие лазерного шума на сигнал SRS будет минимально возможным. Сокращения: RIN = относительная интенсивность шума; SRS = стимулированная рамановская спектроскопия рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 9: Профили балок. (A) Насос, (B) Stokes и (C) насос и Stokes. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 10: Предполагаемая геометрия для дисперсионной решетки и детектора фотодиодной решетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 11. Эффекты сбалансированного обнаружения. Влияние на спектры (A, C) и химические изображения (B, D). Композиты, показанные на панелях (B) и (D), являются окончательными результатами экспериментов (т.е. после хемометрического анализа гиперспектральных данных. Подробности см. в разделе 4 протокола). Шкала стержней = 10 мкм. Аббревиатура: SRS = стимулированная рамановская спектроскопия рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 12: Репрезентативный гиперкуб SRS, полученный с помощью широкополосной микроскопии SRS. Плоскость x-y хранит координаты отсканированных позиций, в то время как каждый вектор вдоль z регистрирует спектр SRS. Аббревиатура: SRS = стимулированная рамановская спектроскопия рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 13: Хемометрический анализ гиперспектральных данных SRS. (A) Составление карт концентраций различных составляющих образца. (B) Характерные спектры химических веществ. На обеих панелях желтый: оливковое масло, синий: DMSO, голубой: PS и оранжевый: PMMA. Шкала бара = 20 мкм (A). Сокращения: SRS = стимулированная рамановская спектроскопия рассеяния; PS = полистирол; ПММА = полиметилметакрилат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Широкополосная микроскопия SRS является мощным методом визуализации, который предлагает подлинный химический контраст для идентификации и распутывания химических компонентов гетерогенного образца. Потенциал этого аналитического инструмента может быть полезен для нескольких областей исследований, начиная от материаловедения до гистопатологии. Недостатком широкополосной микроскопии SRS является тот факт, что она технически требовательна; экспериментатору не только требуется ноу-хау на широкополосных лазерных источниках, но и необходимо манипулировать лазерными импульсами для эффективной генерации SRS, сигнала, который, в свою очередь, должен быть измерен с помощью сложных схем обнаружения. В этой статье представлен протокол, описывающий рабочий процесс для получения химических карт смешанных химических соединений с использованием мультиплексного широкополосного SRS-микроскопа. Хотя описанная работа может быть тривиальной для некоторых лазерных физиков и нелинейных микроскопистов, это может быть не так для читателей, заинтересованных в преимуществах широкополосной микроскопии SRS, чьи научные знания находятся за пределами этих областей. Поэтому мы стремились детализировать каждый шаг, чтобы направлять широкую аудиторию, заинтересованную в широкополосной микроскопии SRS.

Протокол начался с того, что показал, как подготовить простой, но спектроскопически богатый образец, состоящий из нескольких сильных и известных рамановских рассеивателей. Мы обсудили, как получить широкополосный насос и узкополосные пучки Стокса, необходимые для установки микроскопа SRS. На рисунке 5С показана схема установок SHG и OPO. Обратите внимание, что объектив f₁ фокусирует фундаментальный луч на LBO₁ для генерации SHG, в то время как дихроичное зеркало отражает излучение SHG и передает остаточный фундаментальный луч. Второй объектив f₂ коллимирует луч SHG. При f₂> f₁ луч SHG расширяется в разы, равный f₂/f₁. Третья линза f₃ фокусирует расширенный луч SHG на втором кристалле LBO типа I (LBO₂), разрезанном при θ = 90° и φ = 29,0°. При накачке LBO₂ с вышеупомянутым SGH (520 нм) излучение в диапазоне 680-910 нм будет выходить из LBO₂ через разночастотную генерацию (DFG), производя два луча: сигнал и направляющее колесо²⁷ (рисунок 5D, E). Последний отбрасывается, в то время как первый усиливается в полости OPO для доставки импульсов насоса, используемых в экспериментах SRS. Насос OPO при 520 нм, а именно пучок SHG, не следует путать с насосом экспериментов SRS (т.е. сигнальным пучком OPO).

Контраст в микроскопии SRS возникает из-за нелинейного сигнала, генерируемого в фокальном месте микроскопа, сигнала, который требует ограничения большого количества фотонов в плоскости образца в данный момент времени. Это удержание фотонов достигается с помощью объектива микроскопа с высокой числовой апертурой (NA), массива линз, который также устанавливает пространственное разрешение системы: чем выше NA, тем выше пространственное разрешение. Тем не менее, цели с высоким NA плотно упакованы стеклом, которое вводит положительный GDD в импульсное излучение, частотное щебетание, которое в конечном итоге расширяет временной профиль импульсов³⁹. Таким образом, GDD, введенный объективом микроскопа, может увеличить продолжительность импульсов широкополосного насоса, сделав его даже длиннее, чем временная оболочка Стокса, и уменьшив эффективную, доступную полосу рамановского сигнала. Кроме того, это расширение может также привести к искажению спектрального профиля измеряемого спектра SRS.

В CARS спектроскопически релевантный сигнал возникает на длинах волн, которые отличаются от длин полей возбуждения. Простая фотоумножительная трубка или камера с зарядовой связью (ПЗС) может использоваться для своевременной интеграции сигнала CARS, суммируя тысячи импульсов для усреднения лазерного шума. Вместо этого сигнал SRS выглядит как слабая передача модуляции, встроенная в сильный и колеблющийся лазерный фон. Поскольку эта модуляция слабая, лазерный шум может легко подавить ее, снижая как скорость изображения, так и чувствительность микроскопа SRS. Поэтому перед визуализацией необходимо измерить относительную интенсивность шума (RIN), чтобы определить, подходит ли лазер для высокоскоростной визуализации SRS и выбрать частоту модуляции с наименьшим шумом. RIN определяется как спектральная плотность мощности шума [δP(f), с Вт²/Гц единицами] лазера, нормализованная средней оптической мощностью ()^40,41. Другими словами, RIN описывает нормализованные лазерные флуктуации на разных частотах (Eq [4]).

(4)

Таким образом, RIN является параметром системы SRS, определяющим идеальный диапазон частот модуляции для экспериментов. Например, оливковый стержень на рисунке 8 показывает идеальный диапазон частот модуляции для визуализации SRS. В случае узкополосной SRS пользователь должен измерить RIN как насоса, так и Stokes, чтобы выбрать, какой луч должен быть модулирован для достижения оптимальной производительности. Обратите внимание на рисунок 8, например, что балка Стокса имеет немного более высокий RIN, чем насос, подразумевая, что измерения SRG будут более шумными, чем их аналоги SRL. В случае широкополосного SRS луч, который должен быть модулирован, является узкополосным лучом.

Угловая дисперсия D решетки выражает угол дифракции как функцию длины волны и определяется как производная уравнения решетки. Для конфигурации Littrow угловая дисперсия задается Eq (5).

(5)

Чтобы получить Eq (5), мы предположили , α = β, решили Eq (2) для m/d и вставили результат в dβ/ dλ. Обратите внимание, что в конфигурации Littrow β = ^sin-1(mλ/2d). В рамках малоуглового приближения изменение положения вдоль спектра составляет fdβ ≈ dl (рисунок 10). Таким образом, вставив dβ в Eq (5), мы можем вычислить линейную дисперсию, величину с единицами нм ^мм-1 с помощью Eq (6):

(6)

Для дифракционной решетки, работающей в конфигурации Littrow с 1 851,85 канавками/мм, d = 540 нм. Если мы используем дифракцию света первого порядка при ~789 нм, D = 0,0027 рад ^нм-1. С объективом f = 750 мм мы получаем линейную дисперсию ≈ 0,5 нм ^мм-1, переводя в ≈ 7,8 ^см-1 ^мм-1. Таким образом, фокусное расстояние объектива определяет «плотность» нм на мм в плоскости детектора: чем больше фокусное расстояние, тем меньше нм на мм получено, увеличивая пространство между спектральными линиями широкополосного насоса. И наоборот, с более короткими фокусными расстояниями в плоскости детектора будет больше нм на мм, уменьшая пространство, занимаемое дисперсным насосом.

Сбалансированное обнаружение улучшает качество изображения и чувствительность шумных настроек. Например, согласно спектрам RIN, показанным на рисунке 8 , и учитывая типичные SRS с амплитудой 1 x ^10-5, несбалансированное отношение сигнал/шум (SNR) составляет ≈60. Используя сбалансированное обнаружение (т.е. близкое к шуму выстрела), можно достичь SNR ≈145. На рисунке 11 показаны спектры и составные изображения в сбалансированных и несбалансированных условиях. Естественно, эффекты сбалансированного обнаружения влияют на конечные результаты экспериментов, а именно на химические карты. Опираясь на эти результаты, мы подчеркиваем, что сбалансированное обнаружение является мощным методом противодействия пагубному влиянию лазерных флуктуаций на качество изображения. Стоит отметить, что сбалансированное обнаружение лучше всего подходит для шумных лазеров, таких как волоконные генераторы. Микроскопы SRS, работающие с бесшумными оптическими источниками света (например, твердотельными лазерами), могут не требовать сбалансированного обнаружения.

Протокол также объясняет подход, основанный на нелинейной оптике, чтобы найти пространственно-временное перекрытие между импульсами этих лучей. Мы описали преимущества использования^1-го вместо^0-го дифракционного порядка AOM в качестве модулированного пучка Стокса. Кроме того, были описаны пагубные последствия дисперсии на эффективность генерации СГД с предложениями о способах их смягчения с помощью призматического компрессора. Кроме того, протокол объясняет, как выровнять призмы и выделяет три критических аспекта, которые следует учитывать для оптимальной производительности. Мы не только обсуждаем актуальность RIN для микроскопии SRS, но и показываем, как измерить ее с помощью запирающего усилителя и, с помощью спектра RIN, определить лучшую частоту модуляции. На конкретном примере в этой статье объясняется, как уравнение решетки помогает в проектировании цепи обнаружения. Наконец, протокол иллюстрирует с реальными данными SRS структуру гиперкуба SRS и то, как его анализировать с помощью традиционно используемого научного языка программирования.

Этот протокол имеет три незначительных ограничения. Во-первых, схема обнаружения, используемая в этом вкладе, состоит из нетрадиционного многоканального детектора блокировки, разработанного и встроенного в компанию Sciortino et ^al.26 Как было показано ранее²⁵, этот детектор может быть заменен готовым сбалансированным фотодиодом. Хотя эта модификация касается только детектора и оставляет протокол практически неизменным, с одним фотодиодом нужно сканировать каждый спектральный компонент на детекторе, а не измерять их все сразу. Во-вторых, этот протокол использует встроенное сбалансированное обнаружение, которое требует вставки нескольких оптических элементов в траекторию луча. Эти оптические элементы увеличивают сложность системы и приводят к потерям оптической мощности и расширению импульсов.

Встроенное сбалансированное обнаружение также требует, чтобы две реплики насоса проходили через образец, ситуация, которая может быть не идеальной для светочувствительных образцов, таких как живые клетки, или для сильно двулучепреломляющих, в которых две реплики насоса могут испытывать различные оптические свойства, тем самым отменяя сбалансированное обнаружение. В-третьих, протокол опирается на самодельное OPO, устройство, которое может быть недоступно. Однако альтернативами широкополосным спектрам, предоставляемым OPO, являются суперконтинуа из нелинейных оптических волокон или объемных кристаллов. Последние могли быть использованы только с лазерами с низкой частотой повторения (до 5 МГц). Таким образом, как и в случае с любым экспериментальным дизайном, рассматриваемый протокол имеет некоторые ограничения. Однако они минимальны и не ставят под угрозу успех такого подхода.

Хотя здесь описан эталонный образец, этот протокол может успешно распутать химические виды в клетках и тканях животных и растений, таких как целлюлоза, липидные виды или белки, находя практическое применение в различных биохимических поисках или в качестве диагностического инструмента в гистопатологии. Точно так же этот протокол может быть ценным инструментом в материаловедении. Например, следуя этому протоколу, можно исследовать молекулярный состав и концентрацию полимерных видов⁴². Кроме того, эта методология совместима с другими методами нелинейной микроскопии, такими как широкополосная микроскопия на основе насоса-зонда⁴³ и гетеродина CARS⁴⁴, четырехволновые процессы смешивания, которые, как и в случае с SRS, также требуют двух световых лучей возбуждения и измерений модуляции-передачи. Наконец, некоторая информация, содержащаяся в этой статье, может быть применена к нелинейным методам визуализации, которые не полагаются на методы передачи модуляции, но требуют выравнивания двух или более импульсных лазерных лучей, таких как обычные микроскопии CARS⁴⁵ и SFG⁴⁶.

Таким образом, этот протокол описывает мощную методологию, основанную на широкополосной микроскопии SRS, для извлечения химических карт и их характерных спектров SRS из химически гетерогенных смесей, предоставляя наборы данных, которые позволяют проводить простой количественный анализ данных. Универсальность и простота метода также дают заинтересованному читателю возможность адаптировать его к различным нелинейным методикам.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D.P. признает финансирование со стороны проекта Европейского Союза CRIMSON в рамках Грантового соглашения No 101016923 и проекта Regione Lombardia NEWMED в рамках Грантового соглашения No. ПОР ФЕСР 2014-2020. G.C. признает финансирование из проекта Европейского Союза GRAPHENE Core3 в рамках грантового соглашения No 881603. G.C. также признает финансирование от Университета науки и технологии имени короля Абдаллы, номер гранта: OSR-2016-CRG5-3017-01.

Materials

Collection objective	Nikon	CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon	Oil immersion objective
Coverslips	Thermo Fisher	043211-KJ	Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Delay line	Physik Instrumente (PI)	M-406.6PD	Precision microtranslation stage, 150 mm travel range
DMSO	Merck	D8418-500ML	Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide
Etalon	SLS Optics Ltd	Custom made	Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring
Excitation objective	Nikon	CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon	Water immersion objective
Grating	LightSmyth	T-1850-800s Series	High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series
Laser	Coherent	Custom made	Fidelity, HP
λ/2	Thorlabs	SAHWP05M-1700	Mounted superachromatic half-wave plate
PBS	Thorlabs	CM5-PBS203/M	16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,
PMMA beads	Merck	MFCD00198073	Micro particles based on polymethacrylate
Prisms	Crisel	320-8218	LASER DISPERSING PRISMS in SF11
PS beads	Merck	72986-10ML-F	Micro particles based on polystyrene
YVO4 crystal	Dr. Sztatecsny GmbH	Custom made	thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 – 1,100 nm

References

Stewart, S., Priore, R. J., Nelson, M. P., Treado, P. J. Raman Imaging. Annual Review of Analytical Chemistry. 5 (1), 337-360 (2012).
Smekal, A. Zur quantentheorie der dispersion. Die Naturwissenschaften. 11 (43), 873-875 (1923).
Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
Vanna, R., et al. Vibrational imaging for label-free cancer diagnosis and classification. La Rivista del Nuovo Cimento. 45, 107-187 (2021).
Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
Hellwarth, R. W. Theory of stimulated Raman scattering. Physical Review. 130 (5), 1850-1852 (1963).
Maker, P. D., Terhune, R. W. Study of optical effects due to an induced polarization third order in the electric field strength. Physical Review. 137 (3), 801-818 (1965).
Bloembergen, N. The stimulated Raman effect. American Journal of Physics. 35 (11), 989-1023 (1967).
Levenson, M. D., Flytzanis, C., Bloembergen, N. Interference of resonant and nonresonant three-wave mixing in diamond. Physical Review B. 6 (10), 3962-3965 (1972).
Polli, D., Kumar, V., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G. Broadband coherent Raman scattering microscopy. Laser & Photonics Reviews. 12 (9), 1800020 (2018).
Rigneault, H., Berto, P. Tutorial: Coherent Raman light matter interaction processes. APL Photonics. 3 (9), 091101 (2018).
Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-stokes raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363 (2009).
Valensise, C. M., et al. Removing non-resonant background from CARS spectra via deep learning. APL Photonics. 5 (6), 061305 (2020).
Cheng, J. X., Xie, X. S. . Coherent Raman scattering microscopy. , (2012).
Slipchenko, M. N., Oglesbee, R. A., Zhang, D., Wu, W., Cheng, J. X. Heterodyne detected nonlinear optical imaging in a lock-in free manner. Journal of Biophotonics. 5 (10), 801-807 (2012).
Blume, R. J. Boxcar” integrator with long holding times. Review of Scientific Instruments. 32 (9), 1016-1018 (1961).
Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
Sarri, B., et al. Stimulated Raman histology: one to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5378 (2019).
Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
De la Cadena, A., et al. Broadband stimulated Raman imaging based on multi-channel lock-in detection for spectral histopathology. APL Photonics. 7 (7), (2022).
Dela Cadena, A., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G., Polli, D. Broadband stimulated Raman scattering microscopy with wavelength-scanning detection. Journal of Raman Spectroscopy. 51 (10), 1951-1959 (2020).
Sciortino, G., et al. Four-channel differential lock-in amplifiers with autobalancing network for stimulated Raman spectroscopy. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 56 (6), 1859-1870 (2021).
Coluccelli, N., et al. Tunable 30 fs light pulses at 1 W power level from a Yb-pumped optical parametric oscillator. Optics Letters. 42 (21), 4545 (2017).
Monmayrant, A., Weber, S., Chatel, B. A newcomer’s guide to ultrashort pulse shaping and characterization. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 43 (10), 103001 (2010).
Fork, R. L., Martinez, O. E., Gordon, J. P. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150 (1984).
Crisafi, F., et al. In-line balanced detection stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 10475 (2017).
Alem, M. Noise spectral density measured with lock-in amplifiers. Zurich Instruments Company Blog. , (2021).
Palmer, C., Loewen, E. G. . Diffraction grating handbook. , (2005).
. Multivariate curve resolution homepage Available from: https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/ (2021)
Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
de Juan, A., Jaumot, J., Tauler, R. Multivariate Curve Resolution (MCR). Solving the mixture analysis problem. Analytical Methods. 6 (14), 4964-4976 (2014).
Zhang, D., et al. Quantitative vibrational imaging by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy and multivariate curve resolution analysis. Analytical Chemistry. 85 (1), 98-106 (2013).
Chitra Ragupathy, I., Schweikhard, V., Zumbusch, A. Multivariate analysis of hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy images. Journal of Raman Spectroscopy. 52 (9), 1630-1642 (2021).
Brown, S. D., Tauler, R., Walczak, B. . Comprehensive Chemometrics: Chemical and Biochemical Data Analysis. , (2020).
Guild, J. B., Xu, C., Webb, W. W. Measurement of group delay dispersion of high numerical aperture objective lenses using two-photon excited fluorescence. Applied Optics. 36 (1), 397 (1997).
RP Photonics Encyclopedia. Article on "Relative Intensity Noise.&#34 Available from: https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html (2021)
Audier, X., Heuke, S., Volz, P., Rimke, I., Rigneault, H. Noise in stimulated Raman scattering measurement: From basics to practice. APL Photonics. 5 (1), 011101 (2020).
Xu, S., Camp, C. H., Lee, Y. J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for polymers. Journal of Polymer Science. , (2021).
Davydova, D., de al Cadena, A., Akimov, D., Dietzek, B. Transient absorption microscopy: advances in chemical imaging of photoinduced dynamics. Laser & Photonics Reviews. 10 (1), 62-81 (2016).
Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241 (2006).
Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Journal of the Optical Society of America B. 19 (6), 1363 (2002).
Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. H., Potma, E. O. Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy. Optics Letters. 36 (19), 3891 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

De la Cadena, A., Vernuccio, F., Talone, B., Bresci, A., Ceconello, C., Das, S., Vanna, R., Cerullo, G., Polli, D. Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63709, doi:10.3791/63709 (2022).