沙 门氏菌 斑疹伤寒诱导的小鼠脓毒性腹膜炎的特征
Summary
该协议描述了小鼠模型系统中革兰氏阴性单细菌性脓毒症的诱导。该模型有助于研究脓毒症期间的炎症和致死宿主反应。
Abstract
脓毒症是对微生物侵袭或组织损伤的宿主免疫反应失调，导致器官损伤在远离感染或损伤的部位。目前，广泛使用的脓毒症小鼠模型包括脂多糖（LPS）诱导的内毒素血症，盲肠结扎和穿刺（CLP）以及单细菌感染模型系统。该协议描述了一种研究鼠伤寒 沙门氏菌 感染诱导的小鼠脓毒性腹膜炎期间宿主反应的方法。 S. 鼠伤寒是一种革兰氏阴性细胞内病原体，在小鼠中引起伤寒样疾病。
该方案详细说明了培养制备，通过腹腔注射诱导小鼠脓毒性腹膜炎，以及研究全身宿主反应的方法。此外，还介绍了不同器官中细菌负荷的评估以及腹膜灌洗中中性粒细胞数量增加的流式细胞术分析。 沙门氏菌 鼠伤寒诱导的小鼠败血症导致促炎细胞因子增加和腹膜腔中嗜中性粒细胞的快速浸润，导致存活率降低。
该方案中的每个步骤都经过优化，导致脓毒性腹膜炎发病机制的高再现性。该模型可用于研究细菌脓毒症期间的免疫反应，不同基因在疾病进展中的作用以及药物对减轻脓毒症的作用。
Introduction
脓毒症被定义为对微生物侵袭或组织损伤的全身炎症和免疫反应失调，导致远离感染或损伤部位的器官损伤。脓毒性休克是脓毒症的一个亚群，其特征为容量复苏期间持续低血压，死亡风险显著增加1。在COVID-19大流行期间，公众对这种疾病的认识越来越高。尽管相关死亡率很高，但由于脓毒症诊断的复杂性，缺乏关于脓毒症全球负担的全面流行病学数据。2017年，全世界有4890万例脓毒症发病率和1100万例死亡，占全球所有死亡人数的19.7%2。此外，一项关于重症监护病房患者感染和相关脓毒症患病率延长的研究发现，62% 的患者阳性分离株是革兰氏阴性菌3。
最初，脓毒症的研究集中在描述微生物发病机制上。然而，理解“危险假说”，即宿主如何区分自我和非自我，导致脓毒症研究的平衡向理解宿主对入侵病原体的反应倾斜。广泛使用的脓毒症小鼠模型包括脂多糖（LPS）诱导的内毒素血症模型，多种微生物脓毒症模型，盲肠结扎和穿刺（CLP）和结肠上行支架腹膜炎（CASP），以及单细菌感染模型4。
我们已经通过使用鼠伤寒 沙门氏菌 诱导腹膜败血症来标准化小鼠模型系统。该模型优于其他模型，因为鼠伤寒 沙门氏菌 是一种细胞内病原体，模仿革兰氏阴性脓毒症的临床相关病症。在该模型中，腹膜炎脓毒症的结果是全身性的，感染后96小时内死亡率为100%。因此，该模型有助于研究炎症和致命的宿主反应。在该模型中，脓毒症是通过腹腔注射50万个菌落形成单位（CFU）的鼠伤寒 沙门氏菌 到8-10周龄的C57BL / 6小鼠中诱导的。全身感染可以通过在感染后约16小时评估器官细菌负荷来确认。本文展示了鼠伤寒 沙门氏菌 诱导的小鼠腹膜炎败血症，表征了腹膜细胞组成的改变，并量化了不同器官中的细菌负担。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文介绍了一种通过腹腔注射鼠伤寒 沙门氏菌 诱导严重细菌性脓毒症的方法。该模型优于其他模型，因为鼠伤寒 沙门氏菌 是一种细胞内病原体，因此具有高致病性，模仿革兰氏阴性脓毒症的临床相关病症。在该模型中，腹膜炎脓毒症的结果是全身性的，感染后96小时内死亡率为100%。因此，该模型有助于研究炎症和致死宿主反应8 以及治疗干预在减轻脓毒症方面的?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢中央动物设施IISc为我们提供用于研究的小鼠。这项研究由印度政府生物技术和科学与工程研究委员会向DpN提供的赠款资助。DBT-IISc计划和DST-FIST赠款的基础设施支持得到了极大的认可。我们感谢DpN实验室所有前任和现任成员的支持。
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
References
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
