Drosophila Pupal Notum 해부, 고정 및 시각화

초파리 멜라노가스터 (초파리)는 표준 옥수수밀-당밀 배지 상에서 25°C로 유지되었다. 연구는 EGFP 태깅된 히스톤 H2A 번데기(w[*]; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a). 파리는 공공 재고 센터에서 구입했습니다 ( 자료 표 참조). 1. 번데기 고정화 2″ 스트립의 양면 테이프를 현미경 슬라이드에 바릅니다. 25°C에서 상승된 바이알에서 백색 prepupae를 확인하고, 마커를 사용하여 바이알 외부의 그들의 위치를 표시한다. 바이알을 25°C로 되돌립니다.참고 : 흰색 prepupae는 부동성, 흰색 색상 및 상한 나선형이 특징입니다. 이들은 번데기 형성 (APF) 또는 단계 P18 후에 0-1 h를 형성한다. 12-15 시간 후, 해부 범위를 사용하여 표시된 번데기 3-4 개를 조심스럽게 제거하고 테이프 옆의 현미경 슬라이드에 수집하십시오.참고 : 번데기는 이제 번데기의 앞쪽 끝8에서 볼 수있는 상한 머리 낭이있는 P5 단계가 될 것입니다. 번데기를 적어도 하나의 번데기 너비를 복부 측면을 아래로 내려 테이프 위에 놓습니다. 접착제 한 방울을 파라핀 필름 ( 재료 표 참조) 또는 원심 분리기 튜브 뚜껑에 놓습니다. 0.1-10 μL 피펫 팁(피펫 없음)의 끝을 접착제 방울에 담그십시오. 모서리에서 1cm x 1cm 떨어진 24mm x 60mm (1.5 두께) 커버 슬립에 피펫 팁을 두 번 탭하여 번데기 길이의 ~ 1/2 접착 접착제 라인을 만듭니다. 0.2-2 μL(P2) 피펫을 2 μL로 미리 설정하고, 200 μL(P200) 피펫을 200 μL로 미리 설정하고, 이들이 1x PBS + 0.1 mMCa2+로 충전될 준비가 되도록 팁으로 맞추고, 이는 접촉시 접착제를 신속하게 고형화시킬 것이다. 포셉( 재료 표 참조)을 머리 측면 근처에 삽입하고 케이스를 앞쪽에서 뒤쪽으로 부드럽게 분리합니다(9). 가능한 한 많은 케이스를 제거하십시오. 한 쌍의 무딘 포셉으로 번데기의 발달하는 다리를 잡고 조심스럽게 번데기를 케이스에서 당깁니다.참고 : 번데기의 복부 부분에 작은 파열이이 절차에 해롭지 않습니다. 번데기를 커버 슬립의 구석에 놓습니다. 후부 복부의 번데기 또는 무딘 포셉으로 발달하는 날개를 잡고 들어 올리고 번데기의 복부 쪽을 접착제 라인에 내려 놓습니다. P2 피펫을 2 μL의 1x PBS + 0.1 mM의Ca2+ 로 빠르게 채우고, 이를 공기 중에 유지하고, 팁(0.25-0.5 μL)에서 작은 기포를 형성하기에 충분히 충분히 배출한다. 흉부 바닥에있는 번데기의 한쪽면에 용액의 작은 거품을 만진 다음 다른쪽에서 반복하십시오.참고 : 이것은 번데기를 제자리에 고정시키기 위해 소량의 접착제를 굳히게됩니다. 일반적으로 모든 솔루션은 사용되지 않습니다. P200 피펫을 200 μL의 1x PBS + 0.1 mM의Ca2+로 채운 다음, 피펫의 끝을 흉부 위에 놓고 내용물을 배출하여 번데기를 완전히 잠수시킨다. 접착제의 나머지 부분은 즉시 응고됩니다. PBS 용액을 ~100 μL로 제거하여 번데기가 다음 단계로 즉시 진행하기 전에 간신히 잠기도록하십시오.참고: 상처 입지 않은 샘플의 경우 1.1단계부터 시작하십시오. 상처 입은 부분적으로 해부된 샘플의 경우, 단계 1.5에서 시작한다. 레이저 절제를 통한 상처는 이전에14,21 기술되었다. 고정, 해부 및 장착 단계는 해부 현미경을 사용하여 수행해야합니다. 2. 노텀 해부 핸들의 한쪽을 지배적인 손의 검지 손가락과 가운데 손가락에 대고 구부리는 한 쌍의 미세 해부 가위를 잡으면 지배적인 손의 엄지 손가락이 절삭력을 가합니다(그림 2A,B). 비 지배적 인 손의 가운데 손가락에 대해 가위의 목을 안정시키고 비 지배적 인 손의 반지 손가락으로 커버 슬립을 구부리십시오. 등쪽 복부의 중앙을 저격하여 ~ 0.2-0.5mm의 작은 구멍을 만듭니다. 일부 용혈림프는 일반적으로 쏟아져 나오며 위반의 좋은 지표입니다. 후방에서 전방으로 외피를 통해 0.5-0.75mm의 작은 컷을 만들고 등쪽 조직을 감싸서 분리하십시오. 가능한 한 평평한 조직을 만들려면 너무 심실로 절단하지 마십시오. 흉부의 등쪽 ‘돔’만 머리와 복부의 작은 부분과 함께 제거해야합니다. 번데기의 다른쪽에있는 앞쪽 상처에 후방을 반복하십시오. 필요한 경우 헤드를 깨끗하게 절단할 수 있도록 해부 단계를 회전시킵니다.참고 :이 단계에서 등쪽 외피 또는 notum은 번데기의 나머지 부분과 분리됩니다. 분리 된 것처럼 보이지만 쉽게 움직이지 않으면 notum 아래의 몇 컷이 그것을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 커버슬립의 중앙에 ~200μL의 1x PBS를 추가하고 피펫 팁을 커버 글래스를 가로질러 새 액적에서 원본으로 부드럽게 드래그하여 원래의 해부 액적에 연결하는 채널을 만듭니다. 한 쌍의 무딘 포셉을 사용하여 분리 된 노텀을 커버 슬립의 중심으로 부드럽게 밀거나 드래그하고 회전하여 내부 측면이 위쪽을 향하게합니다. 물방울에서 조직을 제거하지 마십시오.참고 : 나중에 이미징하는 동안 접착 접착제의 잔해가 샘플을 가리는 것을 피하기 위해 노툼을 원래 해부 부위에서 멀리 이동해야합니다. 무딘 포셉으로 노텀을 내려 복부 또는 머리 부분을 눌러 누릅니다. 한 쌍의 날카로운 포셉 및/또는 200μL 피펫에서 1x PBS의 부드러운 배출을 사용하여 남아있는 지방체, 근육 밴드 또는 용혈림프(존재하는 경우)를 제거하여 단층 상피를 완전히 노출시키고 최종 염색을 더욱 균일하게 만듭니다. 해부된 노툼은 도 3A와 같이 나타나야 한다. 조직이 깨끗해지면 200 μL 피펫을 사용하여 PBS 용액 (번데기의 파편 및 복부 부분과 함께)을 가능한 한 많이 제거하고 노툼을 흡입하지 않도록 해부 범위로 모니터링하십시오. 대부분의 액체가 제거되면 흡수 조직을 사용하여 접착제와 번데기의 나머지 부분뿐만 아니라 커버 슬립에 남아있는 다른 파편을 조심스럽게 닦아냅니다.참고 : 일부 접착 접착제가 커버 슬립에 남아 있으면 등쪽 조직 자체보다 얇은 한 문제가 발생하지 않습니다. 150-200 μL의 4 % PFA (1x PBS 중)를 넣고 실내 온도에서 20 분 동안 고정하십시오. 해부 속도에 따라 첫 번째 번데기가 고정되는 동안 1 개 이상의 번데기를 해부 할 수 있습니다. PFA를 제거하고 이를 1x PBS로 교체하여 30초 동안 노툼을 1회 세척한다. 항체 염색을 진행하는 경우, 항원이 세포내 있는 경우 조직에 투과하기 위해 1x PBS 또는 1x PBST(보충 파일 1)에서 5분 세척(3회)을 수행하십시오. 샘플을 가습된 챔버에서 하룻밤 동안 1x PBS + 0.02%NaN3 에 저장하거나, 조직을 염색할 계획인 경우, 블로킹 용액에서 밤새 인큐베이션한다(보충 파일 1). 3. 노텀 염색 참고: 항체 또는 세포 얼룩을 이용한 염색의 경우 아래 단계를 따르십시오. – 노툼은 용액에서 제거해서는 안되며, 이로 인해 조직이 말릴 가능성이 큽니다. 따라서, 염색 프로토콜이 커버슬립 상에서 전적으로 수행되도록 적응시키고, 5분 이상 임의의 단계 동안 가습된 챔버에 보관한다. 해부 현미경으로 샘플을 모니터링하면 세척 중 조직의 우발적 인 흡인을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 경계를 시각화하기 위해, 4°C에서 하룻밤 동안 블로킹 버퍼 + 0.02%NaN3에 희석된 1:8 농도에서 200 μL의 항-FasIII 일차 마우스 IgG2a 항체 (물질 표 참조)에서 인큐베이션한다. 과량의 일차 항체 (3회)를 실온에서 세척 당 1시간 동안 200 μL의 1x PBS + 0.02%NaN3 로 세척한다. 블로킹 완충액 + 0.02%NaN3 중의 1:200 농도의 항-마우스 IgGa2 200 μL와 함께 실온에서 2시간 동안 2차 항체 인큐베이션을 수행한다. 과량의 이차 항체 (3배)를 실온에서 세척 당 1 h 동안 200 μL의 1x PBS + 0.02%NaN3 로 세척한다. 핵을 시각화하기 위해, 얼룩이 근육 밴드를 통해 침투하기에 충분한 시간을 허용하기 위해 45분 동안 1 μg/mL의 DAPI에서 샘플을 인큐베이션한다; DAPI 함유 장착 매질에서의 고정은 이러한 조직에는 효과적이지 않다. 실온에서 세척 당 5분 동안 200 μL의 1x PBS + 0.02% NaN3로 과량의 DAPI (3 회)를 세척한 다음, 4°C에서 하룻밤 동안 1x PBS + 0.02%NaN3 의 200 μL에 두거나, 즉시 장착한다. 4. 노텀 장착 및 시각화 염색 후, 지지체로 새로운 24 × 60 커버슬립 (토퍼)을 준비하십시오.참고 : notum은 돔 모양이기 때문에 완전히 평평하게하면 주름진 조직이 왜곡됩니다. 두 커버슬립 사이에 간격을 만들면 노텀이 정상적인 모양을 유지할 수 있습니다. 토퍼 중앙에 매니큐어로 ~1cm 떨어진 곳에 부착한 22 x 22 커버슬립(0번 두께, ~100μm 두께)으로 만든 스페이서를 사용하여 ~200μm의 틈새를 만듭니다. 접착하려면 스페이서를 토퍼에 놓고 스페이서의 원위 가장자리를 얇은 매니큐어 층으로 칠하십시오. 말리십시오.참고 : 얇고 콧물이있는 매니큐어 만 사용하십시오. 두꺼운 매니큐어는 커버 슬립과 토퍼 사이에 불필요한 추가 공간을 추가합니다. 시료에서 가능한 한 많은 수용액을 제거하십시오. 즉시 두 방울 (~ 100 μL)의 페이드 방지 장착 배지 ( 재료 표 참조)를 샘플에 적용하십시오. 필요한 경우 깨끗하고 날카로운 포셉을 사용하여 페이드 방지 장착 매체 액적의 중앙에 노텀을 배치하십시오. 노툼이 있는 커버슬립을 얇은 폼 조각(커버슬립 박스 내부의 포장재에서 잘라내기)과 같은 ~10 x 40mm 지지대 위에 올려 놓고 시료가 작업 표면에 부착되지 않도록 상승시킵니다. 해부 범위 아래에서 토퍼를 샘플에 천천히 내립니다. 페이드 방지 장착 매체가 토퍼를 만나면 부드럽게 풀고 모세관 작용으로 토퍼를 아래로 당깁니다.참고: 처음 몇 초 이내에 노텀을 손상시키지 않고 커버슬립 위치를 약간 조정할 수 있습니다. 다른 거품 조각을 토퍼 위에 놓고 표준 현미경 슬라이드를 무게로 사용하여 샘플 커버슬립, 토퍼 및 스페이서 사이에 페이드 방지 장착 매체를 부드럽게 동축시킵니다. 5-10분 후, 흡수 조직을 사용하여 커버슬립의 가장자리를 부드럽게 만져서 과도한 페이드 방지 장착 매체를 윅 제거합니다. 커버 슬립의 각 모서리에 매니큐어를 부드럽게 발라서 함께 부착하십시오. 일단 건조되면 커버 슬립의 모든 가장자리를 밀봉하도록 페인트하십시오. 모든 가장자리를 먼저 코팅하지 마십시오.이 경우 종종 커버 슬립을 이동시키고 등쪽 조직을 손상시킬 수 있습니다. 등쪽 및 / 또는 복부 측을 통해 형광 현미경 검사 ( 재료 표 참조)에서 노툼을 시각화하십시오.