ショウジョウバエの蛹の解剖学的、固定、視覚化

ショウジョウバエメラノガスター(ショウジョウバエ)を、標準的なコーンミール糖蜜培地上で25°Cに維持した。研究は、EGFPタグ付きヒストンH2A蛹(w[*];P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a).ハエは公共のストックセンターから入手しました(材料表を参照)。 1.蛹の固定化 2インチの両面テープを顕微鏡スライドに貼り付けます。 25°Cで隆起したバイアル中の白色の蛹を同定し、マーカーを使用してバイアルの外側の位置を示す。バイアルを25°Cに戻します。注:白い蛹は、その不動性、白い色、および絶え間なく渦巻くことによって特徴付けられます。これらは、蛹形成(APF)、またはステージP18の0〜1時間後に形成される。 12〜15時間後、解剖スコープを使用して、指示された蛹の3〜4匹を慎重に(それらをポップすることなく)取り除き、テープの横にある顕微鏡スライドに集める。注:蛹は現在ステージP5になり、蛹の前端8にエバーテッドヘッドサックが見えます。 蛹を少なくとも1つの蛹幅離してテープの上に置き、腹側を下にしておきます。 接着剤の滴をパラフィンフィルム( 材料表を参照)または遠沈管の蓋の上に置きます。0.1-10 μLのピペットチップ(ピペットなし)の端を接着剤の滴に浸します。角から1 cm x 1 cm離れた24 mm x 60 mm(厚さ1.5)のカバースリップでピペットチップを2回タップし、蛹の長さの1/2までの接着剤接着剤のラインを作成します。 0.2-2 μL (P2) ピペットを 2 μL に、200 μL (P200) ピペットを 200 μL にプリセットし、先端を合わせて 1x PBS + 0.1 mM Ca2+ で充填する準備ができるようにし、接触時に接着剤を急速に固化させます。 頭の側面近くに鉗子( 材料表を参照)を挿入し、ケースを前部から後部まで静かに取り外します9。ケースをできるだけ取り外します。一対の鈍い鉗子で蛹の発達中の脚をつかみ、慎重にそのケースから蛹を引き抜きます。注:蛹の腹側部分の小さな破裂は、この手順に有害ではありません。 カバースリップの隅に蛹を置きます。 鈍い鉗子で後腹部または発達中の翼の蛹をつかみ、持ち上げて、蛹の腹側を接着剤の線の下に置きます。 P2ピペットに2 μLの1x PBS + 0.1 mMのCa2+ を素早く充填し、空気中に保持して、先端に小さな泡(0.25-0.5 μL)を形成するのに十分な大きさで排出します。 胸郭の基部にある蛹の片側に溶液の小さな泡に触れ、反対側で繰り返す。注:これにより、蛹を所定の位置に保持するために少量の接着剤が固まります。通常、すべてのソリューションは使用されません。 P200ピペットに200 μLの1x PBS + 0.1 mMのCa2+を充填し、ピペットの先端を胸郭の上に置き、内容物を排出して蛹を完全に沈めます。接着剤の接着剤の残りの部分はすぐに固化します。 約100μLのPBS溶液を除去し、蛹をかろうじて沈めてからすぐに次のステップに進むようにする。メモ: 巻き取られていないサンプルの場合は、手順 1.1 から開始します。傷ついた部分的に解剖されたサンプルの場合は、ステップ1.5から開始します。レーザーアブレーション による 創傷は、以前に記載された14、21。固定化、解剖、および取り付けステップは、解剖顕微鏡を使用して行う必要があります。 2. ノータムの解剖 ハンドルの片側を利き手の人差し指と中指に当てて、一対の微小解剖ハサミをつかみ、利き手の親指が切削力を加えるようにします(図2A、B)。 非利き手の中指に対してハサミの首を安定させ、非利き手の薬指でカバースリップを固定します。 背腹部の中央を刈り取って、約0.2〜0.5mmの小さな穴を作ります。いくつかの血リンパは通常こぼれ落ち、違反の良い指標です。 外皮を後部から前部まで0.5〜0.75mm小さく切り込み、背部組織を囲んで隔離する。できるだけ平らな組織を作成するには, あまりにも腹側で切断しないでください;胸郭の背部「ドーム」のみを頭部および腹部の小さな部分とともに除去すべきである。 蛹の反対側で後部から前部への切り傷を繰り返します。 必要に応じて、解剖ステージを回転させて、ヘッドをきれいに切り取ることができます。注:この段階では、背側外皮、またはnotumは、蛹の残りの部分から分離されます。それが分離されているように見えるが、容易に動かない場合は、notumの下のいくつかのカットがそれを取り除くのを助けることができます。 カバースリップの中央に約200 μLの1x PBSを加え、ピペットチップをカバーガラスを横切って新しい液滴から元の液滴に静かにドラッグして、元の解剖液滴に接続するチャネルを作ります。 一対の鈍い鉗子を使用して、孤立したノータムをカバースリップの中心に静かに押したりドラッグしたりして回転させ、内部側が上を向くようにします。液滴から組織を取り除かないでください。注:後のイメージング中に接着剤接着剤の残骸がサンプルを塞ぐのを避けるために、ノータムを元の解剖部位から遠ざけることが不可欠です。 腹部または頭部の部分に押し込んで、鈍い鉗子でノータムを押し下げます。200 μL のピペットから 1 対の鋭い鉗子および/または 1x PBS の穏やかな排出を使用して、残りの脂肪体、筋肉バンド、または血リンパ液 (存在する場合) を除去して、単層上皮を完全に露出させ、最終的な染色をより均一にします。解剖されたノータムは 、図3Aのようになるはずです。 組織がきれいになったら、200 μLのピペットを使用してできるだけ多くのPBS溶液(破片および蛹の腹側部分とともに)を除去し、解剖スコープでモニタリングして小目が吸引されないようにします。 液体の大部分が取り除かれたら、吸収組織を使用して、残りの接着剤と蛹、およびカバースリップに残っている他の破片を慎重に拭き取ります。メモ:カバースリップに接着剤が残っている場合でも、背部組織自体よりも薄い限り、問題は発生しません。 150~200 μLの4%PFA(1x PBS中)を加え、室温で20分間固定する。解剖速度に応じて、最初の蛹の固定中に1つ以上の蛹を解剖することができる。 PFAを取り出し、1x PBSと交換して、ノータムを30秒間1回洗浄します。 抗体染色を進める場合は、1x PBSまたは1x PBST(補足ファイル1)で5分間洗浄(3回)を行い、抗原が細胞内であれば組織を透過処理します。 サンプルを1x PBS+0.02% NaN3 で加湿チャンバー内で一晩保存するか、または組織を染色する予定がある場合は、ブロッキング溶液(補足ファイル1)中で一晩インキュベートする。 3.ノータムを染色する 注:抗体または細胞染色を使用した染色については、以下の手順に従ってください。- これは組織がカールする可能性があるため、ノートムを溶液から除去してはなりません。したがって、染色プロトコルをカバースリップ上で完全に実施するように適合させ、5分を超えるステップの間、加湿チャンバーに保管してください。解剖顕微鏡下でサンプルを監視することは、洗浄中の組織の偶発的な吸引を防ぐのに役立ちます。 細胞境界を可視化するために、ブロッキングバッファー+0.02%NaN3で希釈した1:8濃度で抗FasIII初代マウスIgG2a抗体(材料表を参照)を4°Cで一晩インキュベートする。 過剰な一次抗体を200 μLの1x PBS + 0.02% NaN3 で室温で1時間洗い流します。 200 μL の 200 μL の 1:200 濃度抗マウス IgGa2 をブロッキングバッファー + 0.02% NaN3 で室温で 2 時間インキュベートします。 過剰な二次抗体(3回)を200 μLの1x PBS + 0.02% NaN3 で室温で1時間洗浄します。 核を可視化するには、サンプルを1 μg/mLのDAPIで45分間インキュベートし、染色が筋肉バンドを貫通するのに十分な時間を確保します。DAPI含有マウント培地中での固定は、この組織では有効ではない。 余分なDAPI(3回)を200 μLの1x PBS + 0.02% NaN 3で室温で5分間洗い流し、その後200 μLの1x PBS + 0.02% NaN3を4°Cで一晩放置するか、すぐにマウントします。 4. ノータムの取り付けと視覚化 染色に続いて、支持体付きの新しい24×60カバースリップ(トッパー)を用意する。注:ノータムはドーム型であるため、完全に平らにすると、しわの寄った組織が歪んでしまいます。2つのカバースリップの間に隙間を作ると、ノータムは通常の形状を維持することができます。 22 x 22カバースリップ(厚さ0番、厚さ約100 μm)で作られたスペーサーを使用して、トッパーの中央にマニキュアで約1 cm離して接着して、約200 μmのギャップを作成します。 接着するには、スペーサーをトッパーに置き、スペーサーの遠位端をマニキュアの薄い層でペイントします。乾かします。注:薄くて鼻水っぽいマニキュアのみを使用してください。厚いマニキュアは、カバースリップとトッパーの間に不要なスペースを追加します。 試料からできるだけ多くの水溶液を除去する。 直ちに2滴(約100μL)の退色防止マウント培地( 材料表を参照)をサンプルに塗布します。 必要に応じて、清潔で鋭い鉗子を使用して、色あせ防止マウント媒体液滴の中央にノータムを配置します。 目底付きのカバースリップを、薄いフォーム片(カバースリップボックス内の梱包材から切り取ったもの)などの約10 x 40 mmの支持体の上に置き、サンプルが作業面に付着しないように持ち上げます。 解剖スコープの下で、トッパーをサンプルの上にゆっくりと下げます。退色防止マウント媒体がトッパーに当たったら、ゆっくりと離し、毛細管現象がトッパーを下に引っ張るようにします。メモ: 最初の数秒以内に、ノータムを損傷することなく、カバースリップの位置を少し調整できます。 別のフォームをトッパーの上に置き、標準の顕微鏡スライドをウェイトとして使用して、サンプルカバースリップ、トッパー、スペーサーの間に退色防止マウント媒体を静かに同軸にします。 5〜10分後、吸収組織を使用して、カバースリップの端にそっと触れて、余分な退色防止マウント媒体を吸い取ります。 カバースリップの各角にマニキュアをそっと塗り、それらを一緒に接着します。乾いたら、カバースリップのすべての端をペイントして密封します。カバースリップをずらして背部組織を損傷することが多いため、最初にすべてのエッジをコーティングすることは避けてください。 蛍光顕微鏡( 材料表を参照)で、背側および/または腹側を通して小欠を視覚化します。