在盲肠结扎和穿刺诱导的脓毒症小鼠模型中评估可靠的生物标志物
Summary
该协议介绍了脓毒症小鼠模型中盲肠结扎和穿刺（CLP）的操作细节。CLP是创建脓毒症动物模型的最广泛使用的技术之一。因此，需要标准化的CLP协议才能获得可靠的研究结果。
Abstract
脓毒症是一种严重危及生命且发展迅速的疾病，每年在全世界造成数百万人死亡。研究人员付出了巨大的努力，使用各种动物模型阐明脓毒症的病理生理学;盲肠结扎和穿刺（CLP）诱导的脓毒症小鼠模型在实验室中被广泛使用。影响CLP模型的严重程度和可复制性的三个技术方面是盲肠结扎的百分比，用于盲肠穿刺的针头的大小以及挤入腹腔的粪便量。脓毒症的快速和特异性诊断是影响结局的关键因素。脓毒症诊断的金标准是微生物培养;但是，此过程非常耗时，有时甚至不准确。脓毒症特异性生物标志物的检测速度快，但由于半衰期短、非特异性和敏感性不足，现有的生物标志物不能令人满意。因此，迫切需要在早期阶段获得可靠的脓毒症生物标志物。以前的出版物表明，脓毒症中发生过多的中性粒细胞细胞外陷阱（NET）。瓜氨酸组蛋白 H3 （CitH3） 作为 NET 成分，在脓毒症动物和患者中均升高，CitH3 的存在是脓毒症的可靠诊断生物标志物。本研究旨在描述CLP诱导的脓毒症的标准化小鼠模型，并建立可靠的脓毒症血液生物标志物。我们的工作可能有助于将来脓毒症的早期和准确诊断。
Introduction
脓毒症被定义为宿主对感染1 的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍，脓毒性休克是严重脓毒症2 病例死亡的主要原因。脓毒症和脓毒性休克每年在全世界造成数百万人死亡3。改善脓毒症患者预后的关键是及时开始抗生素等治疗4。诊断脓毒症的金标准方法是微生物培养;然而，微生物培养耗时长，可导致假阳性和假阴性结果，极大地限制了临床意义5。因此，非常希望鉴定脓毒症的血液生物标志物。降钙素原被认为是理想的脓毒症生物标志物，但由于无法区分脓毒症和无菌性疾病，因此诊断效果有限6。
小鼠盲肠结扎和穿刺（CLP）通常用于在科学研究中创建脓毒症模型。CLP 是使用最广泛的脓毒症模型之一，因为它模仿多种微生物腹膜炎，激活促炎和抗炎免疫反应7。众所周知，CLP 创建的脓毒症模型比替代技术（如注射细菌内毒素）更具临床相关性。因此，CLP 被认为是用于研究的经典脓毒症模型8.然而，CLP 的一个主要缺点是其可重复性，因为模型的严重程度受多种因素的影响，例如盲肠结扎的百分比、针头尺寸、穿刺次数和剖腹手术技术。因此，有必要对CLP诱导的脓毒症模型进行标准化。本研究描述了CLP诱导的脓毒症模型的方案细节，以显示标准化程序并提高其可重复性。
炎症反应发生在败血症的早期阶段，中性粒细胞释放过量的氧化剂和蛋白酶，导致器官损伤8。脓毒症病理生理学的一个关键因素是中性粒细胞细胞外陷阱 （NET） 的形成，其释放核和胞质成分，例如 DNA、瓜氨酸组蛋白和抗菌蛋白酶9。最近的研究表明，NETs的过度生成介导了脓毒症的病理学;同时，通过YW3-56或Cl-脒等化学物质对肽基精氨酸脱亚胺酶（PAD）的酶促抑制，NETs的减少在脓毒症10，11小鼠模型中发挥促生存作用。瓜氨酸组蛋白H3（CitH3）在2011年被鉴定为脓毒症特异性蛋白12，随后的出版物已经证明循环CitH3浓度是脓毒症的可靠诊断生物标志物13，14。CitH3 被认为是比降钙素原更敏感、更持久的生物标志物，在区分脓毒症方面比炎性细胞因子更具特异性13。
在这项研究中，我们在CLP诱导的败血症小鼠模型中评估了脓毒症的可靠诊断生物标志物。
Protocol
Representative Results
Discussion
CLP 将病原体引入腹部以创建脓毒症的临床前模型。在进行CLP时，重要的是使用无菌条件来消除外源性细菌的干扰并使用准确剂量的麻醉剂16。影响脓毒症模型严重程度和可复制性的CLP的三个技术方面是盲肠结扎的百分比，用于盲肠穿刺的针头的大小以及挤入腹腔的粪便量。结扎约 75% 的盲肠会导致重度脓毒症，50% 结扎会导致中度脓毒症，25% 或更少的结扎会导致轻度脓毒症<sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢王伟教授和刘帅博士对实验的帮助。本研究由中南大学湘雅医院青年科研基金（编号：2019Q10）、湖南省国家自然科学基金（编号：2020JJ4902）和国家自然科学基金（编号：82202394）资助。
Materials
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
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