Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Bağırsak epiteli ve bağırsakta yerleşik bağışıklık sistemi arasındaki iletişim, bağırsak homeostazının korunmasında merkezidir¹. Bu etkileşimlerdeki bozulmalar, İnflamatuar Bağırsak Hastalığı (IBD) ve gastrointestinal kanserler dahil olmak üzere hem lokal hem de sistemik hastalıklarla ilişkilidir². Homeostazın yakın zamanda tanımlanan kritik bir düzenleyicisinin dikkate değer bir örneği, bağırsak bağışıklık manzarasında kilit oyuncular olarak ortaya çıkan doğuştan gelen lenfoid hücrelerin (ILC’ler) çalışmasından kaynaklanmaktadır³. ILC’ler, bağırsak homeostazını düzenleyen ve inflamasyonu büyük ölçüde sitokin aracılı sinyalizasyon yoluyla düzenleyen heterojen doğuştan gelen bir immün hücre grubudur⁴.

Murin ILC’ler genel olarak transkripsiyon faktörü, reseptör ve sitokin ekspresyon profillerine göre alt tiplere ayrılır⁵. Sitotoksik Doğal Öldürücü (NK) hücreleri ve yardımcı benzeri tip-1 ILC’leri (ILC1’ler) içeren Tip-1 ILC’ler, sırasıyla T hücrelerinde (T-bet)⁶ ekspresyonlu transkripsiyon faktörü (eomezodermin) Eomes ve T-box proteininin ekspresyonu ile tanımlanır ve T yardımcı tip-1 (T_H1) bağışıklığı ile ilişkili sitokinleri salgılar: interlökin (IL)-12’ye yanıt olarak interferon-γ (IFNγ) ve tümör nekroz faktörü (TNF), IL-15 ve IL-18⁷. Homeostaz sırasında, dokuda yerleşik ILC1’ler, epitel proliferasyonunu ve matris yeniden modellemesini sağlamak için Transforme Edici Büyüme Faktörü β (TGF-β) salgılar⁸. Tip-2 ILC’ler (ILC2’ler) öncelikle helmint enfeksiyonuna T yardımcı tip-2 (T_H2) ile ilişkili sitokinlerin salgılanması yoluyla yanıt verir: IL-4, IL-5 ve IL-13 ve retinoik asitle ilişkili yetim reseptör (ROR) α (ROR-α)⁹ ve GATA Bağlayıcı Protein 3 (GATA-3)^10,11,12 ekspresyonu ile karakterizedir. . Farelerde, bağırsak “enflamatuar” ILC2’ler, epitel tutam-hücresi kaynaklı IL-25 14,15’e yanıt verdikleri Öldürücü hücre lektin benzeri reseptörün (alt aile G üyesi 1^, KLRG)¹³ ekspresyonu ile karakterize edilir. Son olarak, lenfoid doku indükleyici hücreleri ve yardımcı benzeri tip-3 ILC’leri (ILC3’ler) içeren tip-3 ILC’ler, transkripsiyon faktörü ROR-γt^16’ya bağımlıdır ve lokal IL-1β ve IL-23 sinyallerine yanıt olarak Granülosit Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktörü (GM-CSF), IL-17 veya IL-22 salgılayan gruplara ayrılır¹⁷. Lenfoid doku indükleyici hücreler Peyer’in yamalarında kümelenir ve gelişim sırasında bu ikincil lenfoid organların gelişimi için çok önemlidir¹⁸, ILC3’ler ise erişkin murin ince bağırsak lamina propriasında en bol ILC alt tipidir. ILC3’lü en eski murin intestinal organoid ko-kültür sistemlerinden biri, sitokin IL-22’nin Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörü 3 (STAT-3) aracılı Lösin Bakımından Zengin Tekrar İçeren G Protein Eşleşmiş Reseptör 5 (Lgr5) ⁺ bağırsak kök hücre proliferasyonu¹⁹ üzerindeki etkisini ayırmak için kullanıldı. rejeneratif ILC-epitel etkileşiminin güçlü bir örneği. ILC’ler organlar arasında damga-heterojenlik sergiler ^20,21 ve polarize edici sitokinlere yanıt olarak alt kümeler arasında plastisite sergiler²². Bu dokuya özgü izleri ve plastisite farklılıklarını yönlendiren ve IBD²³ gibi kronik hastalıklarda hangi rolü oynadıkları, organoid ortak kültürleri kullanılarak ele alınabilecek heyecan verici konular olmaya devam etmektedir.

İntestinal organoidler, intestinal epitel^24,25’i incelemek için başarılı ve güvenilir bir model olarak ortaya çıkmıştır. Bunlar, bağırsak epitelyal Lgr5 ⁺ kök hücrelerinin veya Wnt Ailesi Üyesi 3A’nın (Wnt3a) endojen bir kaynağı olarak Paneth hücrelerini içeren tüm izole kriptoların kültürlenmesiyle üretilir. Bu 3D yapılar, sentetik hidrojeller^26’da veya bazal lamina propria’yı taklit eden biyomalzemelerde, örneğin Termal-çapraz bağlanan Bazal Hücre Dışı Matriks’te (TBEM) korunur ve ayrıca çevredeki nişi, özellikle Epitel Büyüme Faktörünü (EGF), Kemik Morfogenetik Protein (BMP) inhibitörü Noggin’i ve bir Lgr5-ligand ve Wnt-agonisti R-Spondin1^27’yi taklit eden büyüme faktörleri ile desteklenir. . Bu koşullar altında, organoidler epitelyal apiko-bazal polariteyi korur ve bağırsak epitelinin kript-villus yapısını, organoidin merkezindeki emici ve salgısal hücrelere terminal olarak farklılaşan tomurcuklanan kök hücre kriptleri ile özetler, daha sonra anoikis²⁸ tarafından iç psödölümenin içine dökülür. Her ne kadar bağırsak organoidleri tek başına epitel gelişiminin indirgemeci modelleri ve izolasyondaki dinamikler olarak büyük ölçüde avantajlı olsa da^29,30, bu davranışların bağışıklık bölmesi tarafından nasıl düzenlendiğini^, etkilendiğini ve hatta bozulduğunu anlamak için muazzam bir gelecek potansiyeline sahiptir.

Aşağıdaki protokolde, murin ince bağırsak organoidleri ve lamina propria türevi ILC1’ler arasında, bu popülasyonun inflamasyonun bağırsak imzalarını beklenmedik bir şekilde nasıl azalttığını ve bunun yerine bu sistemde TGF-β yoluyla epitel proliferasyonunun artmasına katkıda bulunduğunu tanımlamak için kullanılan bir ko-kültür yöntemi tanımlanmıştır⁸.