Кокультура эпителиальных органоидов тонкой кишки мышей с врожденными лимфоидными клетками

Связь между кишечным эпителием и кишечно-резидентной иммунной системой занимает центральное место в поддержании кишечного гомеостаза¹. Нарушения этих взаимодействий связаны как с местными, так и с системными заболеваниями, включая воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и рак желудочно-кишечного тракта². Примечательным примером одного недавно описанного критического регулятора гомеостаза является исследование врожденных лимфоидных клеток (ILC), которые стали ключевыми игроками в кишечном иммунном ландшафте³. ILC представляют собой группу гетерогенных врожденных иммунных клеток, которые регулируют гомеостаз кишечника и организуют воспаление в основном через цитокин-опосредованную сигнализацию⁴.

Мышиные ILC широко делятся на подтипы на основе транскрипционного фактора, рецептора и профилей экспрессии цитокинов⁵. ILC типа-1, которые включают цитотоксические естественные киллерные (NK) клетки и хелпероподобные ILC типа 1 (ILC1s), определяются экспрессией транскрипционного фактора (эомезодермина) Эомса и белка Т-бокса, экспрессируемого в Т-клетках (T-bet)⁶, соответственно, и секретируют цитокины, связанные с иммунитетом Т-хелпера типа 1 (T_H1): интерферон-γ (IFNγ) и фактор некроза опухоли (TNF), в ответ на интерлейкин (IL)-12, Ил-15 и Ил-18⁷. Во время гомеостаза тканевые резиденты ILC1 секретируют трансформирующий фактор роста β (TGF-β), чтобы стимулировать пролиферацию эпителия и ремоделирование^{матрицы 8}. ILC типа 2 (ILC2s) в первую очередь реагируют на гельминтную инфекцию через секрецию цитокинов, ассоциированных с T-хелпером типа 2 (T_H2): IL-4, IL-5 и IL-13, и характеризуются экспрессией ретиноевой кислоты, связанной с орфанным рецептором (ROR) α (ROR-α)⁹ и GATA-связывающим белком 3 (GATA-3)10,11,12 . У мышей кишечные «воспалительные» ILC2 дополнительно характеризуются экспрессией лектин-подобного рецептора клеток-киллеров (подсемейство G-член 1, KLRG)¹³, где они реагируют на эпителиальный пучко-клеточный IL-25^14,15. Наконец, ILC типа 3, которые включают клетки индуктора лимфоидной ткани и хелпероподобные ILC типа 3 (ILC3s), зависят от транскрипционного фактора ROR-γt¹⁶ и группируются в группы, которые секретируют либо гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), IL-17 или IL-22 в ответ на местные сигналы IL-1β и IL-23¹⁷. Клетки-индукторы лимфоидной ткани группируются в пятнах Пейера и имеют решающее значение для развития этих вторичных лимфоидных органов во время развития¹⁸, тогда как ILC3s являются наиболее распространенным подтипом ILC во взрослой мочевой тонкой кишке lamina propria. Одна из самых ранних мышиных кишечных органоидных кокультурных систем с ILC3s была использована для того, чтобы отделить влияние цитокина IL-22 на сигнальный преобразователь и активатор транскрипции 3 (STAT-3), опосредованный лейцин-богатым повторением, содержащим рецептор, связанный с G-белком, 5 (Lgr5) ⁺ пролиферацию кишечных стволовых клеток¹⁹, мощный пример регенеративного ILC-эпителиального взаимодействия. ILC проявляют импринт-гетерогенность между органами ^20,21 и проявляют пластичность между подмножествами в ответ на поляризующие цитокины²². То, что движет этими тканеспецифическими отпечатками и различиями в пластичности, и какую роль они играют в хронических заболеваниях, таких как ВЗК²³, остаются захватывающими темами, которые могут быть решены с использованием органоидных кокультур.

Кишечные органоиды стали успешной и надежной моделью для изучения кишечного эпителия^24,25. Они генерируются культивированием эпителиальных стволовых клеток Lgr5⁺ или целых изолированных крипт, которые включают клетки Paneth в качестве эндогенного источника члена семейства Wnt 3A (Wnt3a). Эти 3D-структуры поддерживаются либо в синтетических гидрогелях²⁶, либо в биоматериалах, которые имитируют базальную lamina propria, например, термосшивающий базальный внеклеточный матрикс (TBEM), и дополнительно дополняются факторами роста, которые имитируют окружающую нишу, в первую очередь эпителиальным фактором роста (EGF), ингибитором костного морфогенетического белка (BMP) Ноггином и Lgr5-лигандом и Wnt-агонистом R-Spondin1^27. . В этих условиях органоиды сохраняют эпителиальную апико-базальную полярность и рекапитулируют крипто-ворсинчатую структуру кишечного эпителия с почковыми криптами стволовых клеток, которые терминально дифференцируются в абсорбирующие и секреторные клетки в центре органоида, которые затем сбрасываются во внутренний псевдолюмен^{аноикисом 28}. Хотя одни только кишечные органоиды были чрезвычайно выгодны в качестве редукционистских моделей развития и динамики эпителия в изоляции^29,30, они обладают огромным будущим потенциалом для понимания того, как это поведение регулируется, влияет или даже нарушается иммунным компартментом.

В следующем протоколе описан метод кокультурирования между мышиными тонкокишечными органоидами и ILC1, полученными из lamina propria, который недавно был использован для определения того, как эта популяция неожиданно уменьшает кишечные сигнатуры воспаления и вместо этого способствует увеличению эпителиальной пролиферации через TGF-β в этой системе⁸.