Электронная микроскопия с замораживанием и разрушением для анализа внеклеточных пузырьков

1. Культивирование раковых уротелиальных клеток и выделение EV ПРИМЕЧАНИЕ: Представлен протокол получения EV из инвазивной уротелиальной клеточной линии рака мочевого пузыря человека (Т24). Тем не менее, условия культивирования должны быть оптимизированы для использования других типов клеток. Пластинчатые Т24 клетки плотностью 3 × 104 клетки/см2 в трех колбах (растущая поверхность 75см2) и начинают с культивирования клеток в инкубатореСО2 в течение 3 дней при 37 °C и 5% CO2 (Рисунок 2A). Используйте культуральную среду для Т24-клеток в смеси 1:1 (v/v) A-DMEM и F12, дополненной 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 4 мМ Глутамакса, 100 мг/мл стрептомицина и 100 Ед/мл пенициллина.ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая изоляция дает электромобили, обогащенные МВ. Перед началом изоляции осмотрите клетки с помощью светового микроскопа, чтобы подтвердить жизнеспособность и слияние (рисунок 2B). Начните собирать EV из кондиционированной культуральной среды, когда клетки T24 находятся на 70% слиянии. Собрать питательную среду с МВ с пипеткой из колб (Т75) в конические центрифужные трубки (рис. 2С). Центрифуга при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C (рисунок 2D). Аккуратно соберите супернатант в новую центрифужную трубку с пипеткой (рисунок 2Е). Центрифугировать супернатант при 2000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Аккуратно соберите супернатант с пипеткой в новую центрифужную трубку. Центрифуга при 10 000 × г в течение 40 мин при 4 °C. Обратите внимание на наличие беловатой гранулы на дне трубки.ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости измените ротор центрифуги для достижения требуемой перегрузки. Гранула EV видна как белая гранула в нижней части трубки центрифуги (рисунок 2F); обозначьте его местоположение, чтобы избежать потери гранулы во время пипетки (рисунок 2G). Осторожно выбросьте супернатант пипеткой. К грануле добавить 1,5 мл PBS и повторно суспендировать гранулу, содержащую MVs. Поместите суспензию в новую центрифужную трубку. Центрифугу при 10 000 × г в течение 40 мин при 4 °C и ищите наличие белой гранулы на дне трубки.ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула EV видна как белое пятно на дне трубки центрифуги; обозначьте его расположение, чтобы избежать потери гранулы во время пипетки. Осторожно выбросьте супернатант пипеткой. Осторожно добавьте фиксатор, 2,5% глутаровый альдегид в буфер какодилата натрия 0,1 М (рН 7,2). Оставьте на 20 мин при 4 °C (рисунок 2H).ВНИМАНИЕ: Глутаральдегид и какодилат натрия токсичны. Работайте в вытяжном капюшоне, надевайте защитные перчатки и выбрасывайте их соответствующим образом. Аккуратно снимите фиксатор пипеткой. Добавьте промывочный буфер (0,1 М буфера какодилата натрия) к грануле. Оставить на 10 мин при 4 °C без повторного использования гранулы. 2. Замораживание электромобилей ПРИМЕЧАНИЕ: Перед замораживанием сначала криозащитите образцы глицерином. Готовят 0,1 М буфера какодилата натрия. Удалите буфер промывки и добавьте 50 мкл 30% глицерина в буфер 0,1 М какодилата. Осторожно повторно суспендируйте электромобили, чтобы сделать раствор однородным. Инкубировать в течение 30 мин при 4 °C. Очистите медоносцы центральной ямой в ультразвуковой ванне хлороформом в течение 5 мин (рисунок 3А). Высушите их на воздухе и пометьте цветами при использовании нескольких образцов (рисунок 3B). До использования храните носители в сухом, чистом месте (например, на бумаге для линз в чашке Петри). Не прикасайтесь к носителям голыми руками. Подготовьте пипетки, растворы, фильтровальную бумагу, пинцет, стереомикроскоп, колбу Дьюара с фреоном и жидким азотом (LN2), металлический стержень и криовиалы. Охладите его с помощью LN2.ВНИМАНИЕ: Носите защитное снаряжение и работайте соответственно при обращении с LN2 и охлажденным фреоном. Повторно суспендируйте электромобили перед замораживанием. Избегайте образования пузырьков воздуха.ПРИМЕЧАНИЕ: Быстро выполните шаги 2.4-2.7. Работа под стереомикроскопом (рисунок 3С). Перенесите 1,5-1,7 мкл образца в центральную яму меденосца, чтобы сделать выпуклое падение, достигающее выше края медного носителя, не проливая образец через край (рисунок 3D). В случае чрезмерного разлива используйте фильтровальную бумагу для сушки наружного кольца носителя. Смешайте затвердевший фреон с металлическим стержнем, чтобы снова разжижить его (рисунок 3E). Захватите пинцетом наружное кольцо медного носителя и погрузите его в охлажденный фреон с легким встряхиванием пинцета в течение 8 с (рисунок 3F). Через 8 секунд быстро перенесите носитель в другую колбу Дьюара, наполненную LN2. Немедленно приступайте к ГРП или хранению образцов в LN2. В последнем случае пометьте криовиал и охладите кончики флакона и пинцета, погрузив их в LN2 (рисунок 3G). В соответствии с LN2 соберите замороженные носители меди во флакон, закройте его и храните их в контейнере LN2 (рисунок 3H) до замораживания разрыва пласта. 3. Разрыв электромобилей и изготовление реплик ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте установку замораживания-разрыва пласта в соответствии с инструкциями производителя по эксплуатации. (Рисунок 4А). Очистите камеру агрегата. Позиционируйте платиновые (Pt/C) и углеродные (C) пушки под углами 45° и 90° соответственно (рисунок 4B). Запустите вакуумную систему установки. При достижении давления 6,6 × 10−2 Па (5 × 10−4 Торр) охладите камеру блока до −150 °C. Переложите медные носители с замороженными образцами в установку замораживания-разрыва пласта с помощью сухого пинцета (рисунок 4С). Используйте криотрансфер или работайте быстро, чтобы избежать размораживания образца и осаждения кристаллов льда. Закрепите носители на столе образцов. Подождите, пока вакуум снова не достигнет 6,6 × 10−2 Па (5 × 10−4 Торр), а затем установите температуру ножа на −100 °C (рисунок 4D). Подождите, пока вакуум достигнет 1,0 × 10−3 Па (8 × 10−6 Торр). Понаблюдайте за образцом в бинокль и внимательно подойдите к ножу (рисунок 4Е). Начните секционирование образца, включив моторизованное движение ножа (рисунок 4F) и сечение до тех пор, пока поверхность образца не станет гладкой (рисунок 4G). Для разрыва пласта выключите моторизованное движение ножа и приступайте к медленному ручному управлению ножом, тем самым разрывая образец (рисунок 4H). Чтобы защитить трещиноватую поверхность от образования кристаллов льда и обломков до затенения, переместите нож над сломанным образцом. Продолжайте затенение Pt под углом 45° (рисунок 4I, J). Подготовьте секундомер и/или включите монитор кристаллов кварца на блоке замораживания-разрыва пласта, что позволит контролировать толщину Pt на образце. Рекомендуемая толщина слоя Pt, измеренная на кварцевом кристаллическом мониторе, составляет 2,5 нм, что соответствует 4 с затенения при заданном высоком напряжении и токе (т.е. скорость затенения Pt составляет 0,63 нм/с). Перед началом затенения отведите нож от образца. Нанесите высокое напряжение на пушку Pt/C (1 600 В) и увеличьте ток до 60 мА. Искры Pt должны появиться и должны начать затенять образец. На этом этапе начните обратный отсчет 4 с и/или наблюдайте и определяйте положение Pt на кварцевом кристаллическом мониторе.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая толщина слоя C составляет 2,5 нм, что соответствует 10 с затенения при заданном высоком напряжении и токе. Выключите ток и высокое напряжение при получении желаемой толщины Pt. Продолжайте затенение C под углом 90° (т.е. скорость затенения C составляет 0,25 нм/с). Нанесите высокое напряжение на пистолет С (1 900 В), увеличьте ток до 90 мА, и искры С должны появиться и начать затенять образец; в этот момент начните обратный отсчет 10 с. Выключите ток и высокое напряжение при получении желаемой толщины С. 4. Очистка реплик и анализ реплик Используйте медные носители со стола для образцов и переложите их пинцетом в дистиллированную воду комнатной температуры в фарфоровой 12-луночной пластине (рисунок 4К). Реплики будут плавать на поверхности воды, в то время как носители тонут (рисунок 4L). Перенесите реплики с помощью проволочной петли из дистиллированной воды в колодец с гипохлоритом натрия. Накройте крышкой и оставьте на ночь при комнатной температуре в вытяжке.ВНИМАНИЕ: Гипохлорит натрия токсичен. Работайте в вытяжном капюшоне, надевайте защитные перчатки и выбрасывайте их соответствующим образом. Переведите реплики на ddH2Oи мойте в течение 30 мин. Повторите 3 раза. Перенесите реплики с помощью проволочной петли в сетчатую медную сетку ТЭМ (например, квадратную или сотовую сетку 100+). Высушите сетки на воздухе в течение 2 ч, а затем храните их в ячейке для хранения сетки до микроскопии.ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, сетки могут храниться в течение нескольких месяцев в темных, сухих условиях комнатной температуры. Используйте микроскоп TEM для получения изображений реплик и получения микроснимков. Для этого вставьте сетку ТЕА с репликой и запустите визуализацию ТЭМ в соответствии с руководствами по эксплуатации завода-изготовителя. Работа на 80 кВ или 100 кВ. Осмотрите образец и получите микроснимки при все большем и большем увеличении с помощью камеры на ТЕА. Проанализируйте микроснимки МВ. Для измерения диаметров среднего напряжения используйте программное обеспечение Fiji/ImageJ16. Диаметр МВ в 4/π раз больше, чем измерение на микроснимках согласно Hallett et al.17.