Glioblastoma'nın Darbeli Elektrik Alan Terapisi için Esnek Organik Elektronik Cihazlar

Tüm deneysel prosedürler Fransız mevzuatına ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için 24 Kasım 1986 tarihli Avrupa Topluluğu Konseyi Direktifi’ne (86/609/EEC) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar üzerindeki araştırma, Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône tarafından yetkilendirilmiş ve Provence Cote D’Azur etik komitesi tarafından onaylanmıştır (Apafis # 22689-2019100414103054). 1. Esnek cihaz mikrofabrikasyonu (Şekil 1) Cam kızakların temizlenmesiSonicate cam 15 dakika boyunca% 2 sabun çözeltisinde kayar. Onları suyla durulayın. 15 dakika boyunca% 80 saf aseton ve% 20 saf izopropanol karışımında tekrar sonikat.DİKKAT: Bu çözücüler zararlı ve yanıcıdır. Kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyin ve bunları bir duman başlığı altında tutun. Slaytları izopropanol ile durulayın ve bir hava tabancasıyla kurulayın.NOT: Tüm işlem boyunca asetonun substratlar üzerinde kurumadığından emin olun. Altın elektrot deseni (Şekil 1A)Bir parilen biriktirme sistemi ile 3 μm’lik bir parilen-C (PaC) tabakası biriktirin (Şekil 1Aa).Temizlenmiş cam kızakları biriktirme odasına yerleştirin. Soğutucunun üzerine sabun püskürtün, kurumasını bekleyin ve biriktirme sisteminin belirlenen soğuk tuzağına yerleştirin. Bu yapışkan önleyici, biriktirme işleminden sonra PaC’nin soğutucudan kolayca çıkarılmasını kolaylaştırır.DİKKAT: PaC tahriş edicidir ve sağlık açısından tehlike oluşturur. Kullanırken eldiven giyin. Alüminyum bir teknede 6 g PaC tartın ve fırına yerleştirin. Makineyi boşaltın (P = 10 mTorr) ve biriktirmeye aşağıdaki parametrelerle başlayın: TChiller = -100 °C, TFırın = 690 °C, TBuharlaştırıcı = 175 °C ve TOdası = 135 °C. Biriktirme işlemi tamamlandığında ve buharlaştırıcının sıcaklığı 40 °C’nin altında olduğunda, soğutucuyu, buharlaştırıcıyı ve fırını kapatın. Makineyi havalandırın ve örnekleri toplayın. Numunelerin yüzeyini 30 s (100 W, 50 sccm) oksijen plazma işlemi ile aktive edin. Plazma ile muamele edilmiş numuneleri 40 s boyunca 1.000 x g’da negatif bir fotodirenç ile spin-co’layın. Numuneleri 2 dakika boyunca 110 °C’de bir sıcak plakaya yerleştirin (Şekil 1Ab).DİKKAT: Fotorezistlik çözeltisi yanıcıdır ve tahrişe neden olur; KKD giyin ve bir duman başlığı altında tutun. UV geniş bant temas hizalayıcısının ışın hattına bir i-line filtre yerleştirin ve fotodirenci interdigite elektrot tasarımına sahip bir maske ile açığa çıkarın (Şekil 1Ac).NOT: 50 veya 250 μm boşluklu ara sayısallaştırılmış elektrotlar bir düzen editörü kullanılarak tasarlanmış ve lazer fotoplotlama ile polyester fotomaskeler üreten bir şirketten fotomaskeler sipariş edilmiştir. Yukarıdaki numuneleri 110 °C’de bir sıcak tabakta 3 dakika pişirin ve 5 dakika oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Maruz kalmayan fotodirenci çıkarmak için numuneleri metal iyonu içermeyen bir geliştiriciye 3 dakika daldırın. Numuneleri suyla durulayın ve bir hava tabancasıyla kurutun (Şekil 1Ad).DİKKAT: Geliştirici çözümü tahriş edicidir; KKD giyin ve duman başlığının altına tutun. Numunelerin yüzeyini 60 s (100 W, 50 sccm) oksijen plazma işlemi ile aktive edin. Aşağıdaki gibi bir termal evaporatör ile 20 nm yapışma tabakası krom ve 300 nm altın tabakası biriktirin (Şekil 1Ae). Evaporatör makinesini havalandırın ve numuneleri metal vidalarla üst yuvarlak plakaya (aşağı bakacak şekilde) klipsleyin. Özel potaları sırasıyla krom ve altınla doldurun. 5 · 10-6 Torr’un altındaki bir basınca ulaşmak için makineyi kapatın ve boşaltın. Örnek tutucunun rotasyonunu başlatın. Krom içeren potayı seçin ve 0,2 Å·s-1 biriktirme hızına ulaşılana kadar içinden geçen akımı yavaşça artırın. Deklanşörü açın ve 20 nm krom birikinceye kadar bekleyin. Deklanşörü kapatın ve akımı 0 mA’ya kadar yavaşça azaltın. Altın içeren potayı seçin ve 0,2 Å·s-1 biriktirme oranına ulaşana kadar içinden geçen akımı yavaşça artırın. Altını buharlaştırmak için deklanşörü açın, 10 nm altın birikinceye kadar bekleyin ve ardından yaklaşık 300 nm biriktirilene kadar biriktirme oranını 1,5 ş· s-1’e yükseltin. Deklanşörü kapatın ve akımı yavaşça 0 mA’ya düşürün. Numunelerin biriktirildikten sonra 15 dakika oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Numune tutucunun dönüşünü durdurun, makineyi havalandırın ve numuneleri toplayın. Numuneleri asetonlu bir beherin içine batırın. Fotodirenci kaldırmak için beheri 110 rpm’de ayarlanmış sallanan bir plakaya 15 dakika boyunca yerleştirin. Numuneleri izopropanol ile durulayın ve bir hava tabancasıyla kurutun (Şekil 1Af). Numunelerin yüzeyini 30 s (100 W, 50 sccm) oksijen plazma işlemi ile aktive edin. Bir parilen biriktirme sistemi ile 3 μm’lik bir PaC yalıtım tabakası biriktirin (bkz. adım 1.2.1) (Şekil 1Ag). Anahat açma (Şekil 1B)Numuneleri 35 s için 600 x g’da pozitif bir fotodirenç ile spin-colayın. 2 dakika boyunca 110 °C’de sıcak bir tabağa yerleştirin (Şekil 1Ba).DİKKAT: Fotorezistlik çözeltisi yanıcıdır ve tahrişe neden olur; KKD giyin ve duman başlığının altına tutun. UV geniş bant kontak hizalayıcısının ışın çizgisinde i-line filtre olmadığından emin olun ve fotodirenci, cihazın ana hatlarını bir UV geniş bant temas hizalayıcısı ile içeren bir maske ile açığa çıkarın (Şekil 1Bb). Maruz kalan fotodirenci çıkarmak için numuneleri metal iyonu içermeyen bir geliştiriciye 4 dakika daldırın. Numuneleri suyla durulayın ve bir hava tabancasıyla kurutun (Şekil 1Bc). Anahattı PaC’nin iki katmanı boyunca reaktif iyon kazıyıcı ile kazıyın (160 W, 22 dakika, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (Şekil 1Bd). Kalan fotodirenci asetonla çıkarın, izopropanol ile durulayın ve numuneleri bir hava tabancasıyla kurulayın. PEDOT: PSS kaplama (Şekil 1C)35 s için 70 x g’de% 2’lik bir sabun çözeltisini spin-coat (Şekil 1Ca). Bir parilen biriktirme sistemi ile 3 μm’lik bir PaC kurban tabakası biriktirin (bkz. adım 1.2.1) (Şekil 1Cb). 35 s için 600 x g’da spin-coat pozitif fotodirenç. Numuneleri 2 dakika boyunca 110 °C’de bir sıcak plakaya yerleştirin (Şekil 1Cc). UV geniş bant temas hizalayıcısının ışın çizgisinde i-line filtre olmadığından emin olun ve fotodirenci elektrotların aktif yüzeyini içeren bir maske ile açığa çıkarın (Şekil 1Cd). Maruz kalan fotodirenci çıkarmak için numuneleri metal iyonu içermeyen bir geliştiriciye 4 dakika daldırın. Numuneleri suyla durulayın ve bir hava tabancasıyla kurutun (Şekil 1Ce). Elektrotların aktif yüzeyini açmak için PaC’yi reaktif bir iyon kazıyıcı ile aşındırın (160 W, 24 dakika, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). Aktif yüzeyde artık PaC olmadığını mikroskopla kontrol edin (Şekil 1Cf). Kalan fotodirenci asetonla çıkarın, izopropanol ile durulayın ve numuneleri bir hava tabancasıyla kurulayın. 90 s (100 W, 50 sccm) için oksijen plazma işlemi kullanarak numunelerin yüzeyini aktive edin. Kimyasal olarak polimerize PEDOT: PSS’nin ticari bir dispersiyonunu, etilen glikolün% 5 hacmi (EG) ve dodesilbenzen sülfonik asidin% 0.1 hacmi ile karıştırın. 15 dakika boyunca sonikate. Ağırlıkça% 1 (3-glisidiloksipropil) trimetilsiloksan (GOPS) ekleyin ve 5 dakika boyunca sonikat yapın. Çözeltiyi 1,2 μm’lik bir filtreden süzün.DİKKAT: EG tahriş edicidir ve sağlık tehlikesi oluşturur. DBSA tahriş edici ve aşındırıcıdır. GOPS aşındırıcıdır. Uygun KKD giyin ve bu kimyasalları bir duman başlığı altında tutun.NOT: Toplam hacim, numune sayısına bağlıdır. 10 standart cam slayt için, aşağıdaki miktarlara karşılık gelen en az 20 mL hazırlayın: 18.78 mL PEDOT: PSS, 1 mL EG, 20 μL DBSA ve 200 μL GOPS. 35 s için 150 x g’de dört kat PEDOT: PSS çözeltisinin spin-co’su. Her katmanın biriktirilmesinden sonra, numuneleri 110 °C’de bir sıcak plaka üzerinde 60 s pişirin ve bir sonraki katmanı eğirmeden önce 5 dakika oda sıcaklığına soğutun (Şekil 1Cg). Kurbanlık PaC tabakasını numuneleri suya batırarak çıkarın (Şekil 1Ch). Numuneleri 1 saat boyunca 140 °C’de pişirin. PEDOT:PSS filminde kalan sabunu ve düşük molekül ağırlıklı bileşikleri çıkarmak ve numuneleri cam substrattan ayırmak için numuneleri 30 dakika boyunca deiyonize suya batırın (Şekil 1Ci). Bağlantılar ve paketleme (Şekil 1D)Bakırla kaplanmış bir poliimid film üzerine ince bir akrilik boya tabakası bırakın (Şekil 1Da). Homojen bir boya tabakası elde etmek için bir aerosol kullanın (Şekil 1Db). İki dikdörtgen temas pedi (5 mm x 15 mm; 1,5 mm boşluk) elde etmek için akrilik boyayı bir lazerle (75 kHz, 7 W, 1 lazer geçişi, 400 mm·s-1) desenleyin (Şekil 1Dc). Bakırı doymuş (w/v) ferrik klorür (FeCl3) ile 40 °C’de 15 dakika suda ıslak kazıyın (Şekil 1Dd).DİKKAT: FeCl3 tahriş edici ve aşındırıcıdır; duman başlığının altında eldivenlerle tutun. Akrilik boyayı bir bezle hafifçe ovalayarak asetonla sıyırın (Şekil 1De). Desenli poliimid filmi lazerle dikdörtgen şekillere (15 mm x 30 mm) kesin (15 kHz, 10 W, 30 lazer geçişi, 130 mm·s-1) (Şekil 1Df). Gümüş macunu üç eksenli bir dağıtım makinesiyle 330 μm çapında bir iğne (5 m · dak-1) ile üç bar basınçta dağıtın (Şekil 1Dg).DİKKAT: Gümüş macunu tahriş edicidir; eldivenlerle tutun. PaC probunu cımbız kullanarak dürbün mikroskobu altında poliimid film ile hizalayın ve takın (Şekil 1Dh).NOT: Hizalama işaretleri, probun temas pedleri üzerinde konumlandırılmasını kolaylaştırmak için adım 1.5.2’de desenlenebilir. Fırında 140 °C’de 2 saat pişirin. Kontakt pedlerin üzerine 1cm2 poliimid koruma bandı yerleştirin (Şekil 1Di). PaC probu ve poliimid filmin PDMS’ye bağlandığı arayüzü daldırın (Şekil 1Dj). 50 °C’de 2 saat pişirin. Kontak pedlerini açmak için koruma bandını çıkarın (Şekil 1Dk).NOT: İn vitro cihazların mikrofabrikasyonu benzerdir, ancak 1.2.1, 1.3 ve 1.5 numaralı adımlar atlanmalıdır. 2. Glioblastoma GCaMP6f kararlı hücre hattının oluşturulması Lentivirüs üretimi75 cm²’lik bir şişede, 4,5 g içeren 10 mL’lik Dulbecco’nun Modifiye Kartal Ortamı’nda (DMEM) lentivirüs üretimi için optimize edilmiş HEK 293T türevi bir hücre hattını kültürleyin. L-1 glukoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat ve% 10 tetrasiklin içermeyen fetal sığır serumu (FBS), 100 ünite · mL-1 penisilin ve 100 μg · mL-1 streptomisin ile en az 3 gün boyunca% 80 birleşmeye kadar desteklenir. Ortamı şişeden çıkarın. Hücreleri 10 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile nazikçe durulayın. 1 mL% 0.25 Tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin ve şişeyi 37 ° C’de 5 dakika boyunca inkübe edin.DİKKAT: Tripsin / EDTA çözeltisi sağlık tehlikesi oluşturur; KKD giyin ve duman başlığının altına tutun. 8 mL kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu yavaşça yıkayın. Petri kabındaki hücreleri ve plakayı 4 x 106 hücreyi 8 mL kültür ortamında sayın. Ertesi gün, GCaMP6f genini içeren plazmidin 25 μg’ını ve toplam 600 μL su hacminde püromisine direnç kazandıran bir seçim belirtecini seyreltin. Bir transfeksiyon reaktifi tüpüne ekleyin. 3.000 rpm’de 10 s vorteks yapın ve nanopartiküllerin üretimine izin vermek için tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Tüpün içeriğini HEK 293 T hücrelerinin kültürüne damla damla ekleyin ve elle hafifçe sallayın. Hücreleri 37 °C’de en az 4 saat boyunca inkübe edin. Nanopartikül kompleksleri içeren ortamları taze ortamlarla değiştirin ve hücreleri 37 ° C’de geri getirin. Üç gün sonra, hücresel kalıntıları çıkarmak için süpernatant ve santrifüjü 10 dakika boyunca 500 x g’de toplayın. Viral parçacıklar içeren sıvı fazı toplayın.NOT: Süpernatanttaki virüs üretimi, kantitatif bir lentiviral titre testi kullanılarak doğrulanabilir ve en az 2 yıl boyunca -80 ° C’de saklanabilir. Glioblastoma hücre transdüksiyonu75 cm²’lik bir şişede, 1 g içeren 10 mL’lik DMEM’deki kültür glioblastoma hücreleri L-1 glukoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat ve% 10 tetrasiklin içermeyen FBS, 100 ünite · mL-1 penisilin ve 100 μg · mL-1 streptomisin ile en az 4 gün boyunca desteklenir. Ortamı atın ve adım 2.1.9’da elde edilen süpernatantı hedef hücrelere ekleyin. İletimi iyileştirmek için ortama 5 μg · mL-1 Hexadimethrine Bromür ekleyin. 37 °C’de 6 saat inkübe edin. Ortamı 10 mL taze ortamla değiştirin.DİKKAT: Hekzadimetrin Bromür tahriş edicidir. Eldivenlerle tutun. Kararlı bir hücre hattının oluşturulmasıTransdüksiyondan iki ila üç gün sonra, 1 g · içeren 10 mL DMEM ekleyin L-1 glukoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat,% 10 FBS,100 birim · mL-1 penisilin, 100 μg · mL-1 streptomisin ve dönüştürülmemiş hücreleri öldürmek için puromisin ile desteklenir. Bu ortamda en az 3 gün boyunca kültür hücreleri.DİKKAT: Puromisin tahriş edicidir; eldivenlerle tutun.NOT: Hücrelerin puromisine duyarlılığı, transdüksiyondan önce, farklı konsantrasyonlarda puromisin içeren önerilen ortamlarında hücreler kültürlenerek test edilmelidir. Bir gün sonra, hücreleri mikroskopla kontrol edin. Antibiyotiğin çok toksik olmadığından ve transfekte edilen hücreleri de öldürebileceğinden emin olmak için hücrelerin çoğunluğunun öldüğü ancak çok azının hala hayatta olduğu yeterli konsantrasyonu seçin. Ortamı çıkarın ve hücreleri 10 mL PBS ile durulayın. Bir Tripsin / EDTA çözeltisinin% 0.25’inden 1 mL’lik bir miktar ekleyin ve şişeyi 37 ° C’de 5 dakika boyunca inkübe edin. 8 mL kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu yavaşça yıkayın. 100 μL hücre süspansiyonu toplayın ve bir hücre sayacı ile hücre konsantrasyonunu ölçün. 60 μm sensörlü el tipi otomatik hücre sayacında 50 μL hücre süspansiyonunu aspire edin. 96 delikli bir plakada 1 hücre/kuyu tohumlayın. Örneğin, mL başına 1 x 10 3 hücrelik bir konsantrasyon için, kuyucuk başına 1 / (1 x 103), yani kuyucuk başına 0.001 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Başarı şansını artırmak için her kuyuyu tohumlayın. Kuyu başına toplam 200 μL hacme ulaşmak için kültür ortamı ile tamamlayın. Bir gün sonra, bir hücre içeren her kuyuyu bulun ve floresansını kontrol edin (λexc = 490 nm ve λem = 530 nm). Sadece bir transfekte hücre içeren kuyucukları işaretleyin. Kuyu neredeyse birleşene kadar büyümeye birkaç gün devam edin. Ortamı atın ve hücreleri 200 μL PBS ile durulayın. 100 μL% 0.25 Tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin ve 96 delikli plakayı 37 ° C’de 5 dakika boyunca inkübe edin. 100 μL orta ekleyin ve hücre süspansiyonunu yavaşça yıkayın. Hücre süspansiyonunu bir Petri kabına aktarın. 5 mL orta ekleyin ve Petri kabı neredeyse birleşene kadar hücrelerin birkaç gün büyümesine izin verin. Ortamı atın ve hücreleri 5 mL PBS ile durulayın. 1 mL% 0.25 Tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin ve Petri kabını 37 ° C’de 5 dakika boyunca inkübe edin. 6 mL orta ekleyin ve hücre süspansiyonunu yavaşça yıkayın. Hücre süspansiyonunu bir T25 şişesine aktarın. Şişe neredeyse birleşene kadar büyümeye birkaç gün devam edin. Ortamı atın ve hücreleri 5 mL PBS ile durulayın. 1 mL% 0.25 Tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin ve T25 şişesini 37 ° C’de 5 dakika boyunca inkübe edin. 1 g· içeren 7 mL DMEM ekleyin L-1 glikoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat ve% 10 FBS, 100 birim · mL-1 penisilin ve 100 μg · mL-1 streptomisin ile desteklenir. Hücre süspansiyonunu yavaşça yıkayın. Hücre süspansiyonunu dört T25 şişeye bölün (şişe başına 2 mL) ve her şişeye 5 mL orta madde ekleyin. Şişeler neredeyse birleşene kadar hücrelerin birkaç gün büyümesine izin verin. Üç şişe için adım 2.3.12’yi tekrarlayın ve adım 3.1.3 için son şişeyi saklayın. Hücre süspansiyonunu 15 mL’lik bir konik tüp içinde aktarın ve 5 dakika boyunca 150 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücre peletini 900 μL’de yeniden askıya alın. homojen bir hücre süspansiyonunu korumak için hücreleri yavaşça karıştırın. Hücre süspansiyonunu kriyojenik depolama şişelerine aktarın. 100 μL dimetil sülfoksit ekleyin. Kriyovalleri gece boyunca -80 ° C’ye yerleştirin. Daha fazla deney için dondurulmuş hücreleri sıvı nitrojene aktarın.NOT: Transfeksiyonun verimliliği, ortama 5 μM iyonomisin kalsiyum tuzu eklenerek ve bir floresan mikroskobu altında indüklenen floresan artışı kontrol edilerek değerlendirilebilir (λexc = 490 nm ve λem = 530 nm). 3.3D modeller Küresel kültürDeiyonize (DI) suda% 1 (w / v) agaroz çözeltisi hazırlayın.100 mL DI suyuna 100 g agaroz tozu ekleyin ve çözeltiyi tüm toz çözülene kadar mikrodalga fırında ısıtın. Kümelenmeleri önlemek için çözeltiyi düzenli olarak karıştırın. Çözeltiyi 120 °C’de 20 dakika otoklav yapın. Otoklavdan alındıktan sonra, 96 delikli bir plakaya kuyucuk başına 75 μL agaroz çözeltisi dikkatlice ekleyin. Bir menisküs oluşturmak için kuyunun kenarına koyun, yapışmaz yuvarlak bir tabanla sonuçlanır. Oda sıcaklığında 15 dakika katılaşmasına izin verin. Hücreleri (adım 2.3.12) adım 2.3.14’te elde edilen şişeden ayırın. Glioblastoma hücrelerinin kuyusu başına 10.000 hücre ekleyin ve 1 g · içeren DMEM ile kuyu başına toplam 150 μL hacme ulaşmak için tamamlayın. L-1 glukoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat ve% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 ünite · mL-1 penisilin ve 100 μg · mL-1 streptomisin ile desteklenir. Plakayı 3 gün boyunca hareket ettirmeden hücreleri 37 ° C’de inkübe edin. Ardından, daha sonraki deneylere kadar ortamın yarısını her 2 günde bir çok kanallı pipetle taze medyayla değiştirin. Agarozun veya sferoidin kendisinin zarar görmesini önlemek için pipet ucunu kuyunun üst kısmında tutun.NOT: Sferoidlerin boyutu, tohumlanan hücre sayısına ve hücre hattına bağlıdır, bu nedenle deneylere bağlı olarak uyarlanmalıdır. In ovo modeliDöllenmiş Japon bıldırcın yumurtalarını (C. japonica) bir inkübatöre (37 ° C ve% 57 nem) her 2 saatte bir yumurta döndüren otomatik bir rotatöre sahip tepsilere yerleştirin. Bu gün Embriyonik Gün (ED) 0 olarak kabul edilir. Plastik tartım teknelerini (w/v) etanol içine yerleştirerek yıkayın. Tartım teknelerini çıkarın ve bir duman başlığı altında kurutun.NOT: Bu noktadan itibaren, deneyler steril koşullarda yapılmaz. Bununla birlikte, embriyolarda küf gelişmesini önlemek için temiz koşullar gereklidir. ED3’te, (w/v) etanol ile önceden yıkanmış ince uçlu bir cımbız kullanarak yumurtaları nazikçe açın. Embriyoyu plastik bir tartım teknesine dökün, başka bir tartım teknesiyle örtün ve 3 gün boyunca 37 ° C’de standart nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. ED6’da, 23 G’lik bir iğne ile koryoallantoik membranda (CAM) küçük bir kesi yapın. Bir pipet kullanarak, insizyon üzerine 7 günlük bir sferoid yerleştirin ve embriyoyu daha sonraki deneylere kadar 3 gün boyunca inkübatöre geri koyun.NOT: Kan damarlarını görselleştirmek için embriyonun gözüne floresan bir boya enjekte edilebilir. Deney gününde, esnek probu bir mikromanipülatör kullanarak vaskülarize tümörün üzerine yerleştirin. Burası in vivo modelNOT: Protokolün bu bölümü, daha önce referansta yayınlanmış olandan uyarlanmıştır.14. Erişkin çok renkli floresan AMU-Neuroinflam fareler (B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD) kullanıldı; Bu fareler Thy1’in bir alt popülasyonunun etiketlenmesini sunar+ ECFP’nin transgenik ekspresyonu ile nöronlar, periferik LyzM’nin etiketlenmesi+ EGFP’nin transgenik ekspresyonu ve Cd11c kontrolü altında EYFP’yi eksprese eden bir mikroglia alt tipinin etiketlenmesi ile inflamatuar hücreler+. Kısacası, hayvanlar herhangi bir tedavi veya enjeksiyondan önce 2 dakika boyunca% 1.5 izofluran ile hafifçe sakinleştirilir. Ameliyattan önce hayvanlar Ketamin (120 mg/kg; IP) ve Ksilazin (12 mg/kg; IP). Daha sonra, stereotaktik desteğin sabitlenmesiyle ilişkili kulaklardaki herhangi bir ağrıyı hafifletmek için% 3 Lidokain jeli lokal olarak uygulanır. Daha sonra, kraniyotomiye bağlı herhangi bir ağrıyı hafifletmek için% 0.25 Bupivakain çözeltisi cerrahi bölgeye uygulanır. Fare ameliyat için hazırlandıktan sonra, referansa göre 4 mm çapında bir kraniyotomi yapıldı.14. 26 G’lik bir iğne ile, kraniyotominin ortasındaki dura-materde bir delik açıldı ve tümör sferoidine referansta tarif edilen enjeksiyon sistemi enjekte edildi.14. Ek olarak, burada açıklandığı gibi, kraniyotomi cam bir pencereyle kapatılmadan önce GCamp6 veya DsRed üzerine tümör sferoidini eksprese eden esnek bir elektrot yerleştirildi.Dulbecco’nun Fosfat Tamponlu Salininden (DPBS) bir damla damla yerleştirin, böylece kraniyotomi örtün. Esnek elektrodu DPBS damlasının üzerine yerleştirin ve probun arkasını temas pedleriyle yavaşça farenin sırtına yerleştirin (Şekil 4B).NOT: Steril eldivenler ve “sadece uç” tekniği kullanın. Steril olmayan bir yüzeye temas edilirse eldivenleri değiştirin. Bu prosedür sırasında termal destek sağlayın. DPBS damlasına küçük bir kağıt parçasıyla dokunarak DPBS’yi emmek için prob dura üzerinde düz durup beynin eğriliğini takip edin. Elektrotun yanından kaçmadan elektrotların altında küçük bir DPBS tabakasının kaldığından emin olun. Bu, sonraki adımlarda tutkal dökülmesine karşı bir bariyer sağlar.NOT: Kullanmadan önce tüm ekipmanı sterilize edin. Probun üzerine küçük bir damla silikon yapıştırıcı yerleştirin ve 5 mm’lik yuvarlak kapaklı bir camla örtün. Silikon eşit olarak dağıtılana ve kapak camı ile prob arasındaki mesafe minimum olana kadar kapak camını aşağı doğru itin. Silikonun katılaşabilmesi için kapak camını 30 sn daha aşağı itin. Kapak camını sabitlemek için, yanlarına hızlı bir şekilde süper yapıştırıcı uygulayın ve tutkal katılaşana kadar aşağı doğru itin. Bir kürdan kullanarak, probun boynuna süper yapıştırıcı uygulayın ve süper yapıştırıcının boynun altına çekilmesine dikkat ederek sabit bir destek sağlayın. Kronik bir kapak oluşturmak için kafatasını diş çimentosu ile örtün. Sadece kapak camının kenarlarını örtmeye özellikle dikkat edin. Probun arkasını kaldırın ve probun boynunun altına çimento uygulayın. Probu kürlenmeden önce çimento üzerine koyun. Probun boynunu künt forseps ile yavaşça aşağı doğru itin, böylece yüzeyi deney sırasında mikroskop hedefinin yolunda değil, kapak camınınkiyle aynı seviyede olur. Prob üzerinde sağlam bir tutuş elde etmek için prob boynunun üst kısmını 1,5 mm’den fazla olmayan diş çimento tabakası ile örtün. İki foton görüntüleme için daldırma sıvısı için bir havza oluşturmak üzere kapak camının etrafında 1-2 mm’lik bir mesafede 1,5 mm’lik bir sırt sunan bir çimento kuyusu inşa edin (Şekil 4C). Çimento kürlendikten sonra, cerrahi sonrası buprenorfin analjezikleri (0.05 mg / kg, deri altından 10 g vücut ağırlığı başına 0.1 mL) uygulayın ve hayvanı uyanana kadar ılık bir atmosferde tutun. Bu, kızılötesi bir ampule yakınlığın yanı sıra hayvanı bir kağıt havluya sarmayı da içerir.NOT: Sıcaklığı izlemek için fare hizasına bir termometre yerleştirin. Bir potansiyostat kullanarak 1-10 kHz aralığında empedansı karakterize edin. Hayvanın ameliyattan en az 10 gün iyileşmesine izin verin. Ameliyattan hemen sonra anti-enflamatuar ilaçlar uygulayın ve uygun postoperatif analjezi sağlamak için hayvanın durumunu izlemeye devam edin. 4. Darbeli Elektrik Alanı (PEF) dağıtımı ve görüntüleme Örnekleri bir floresan mikroskobu altına yerleştirin. 3D modellerde, tümörler sadece üstten gözlemlenebilir.NOT: In ovo modeli için, deneyler bir epifloresan mikroskobu altında gerçekleştirilmiştir (ancak iki foton mikroskobu ile de mümkündür), oysa in vivo model üzerindeki deneyler iki foton mikroskobu altında gerçekleştirilmiştir (Şekil 6). Pogo pin konektörleri (in vitro) veya timsah klipsleri (in ovo ve in vivo) kullanarak cihazların temas pedlerine bir darbe jeneratörü bağlayın (Şekil 4A). İstenilen parametreleri (darbe sayısı, voltaj, darbe süresi, frekans) ayarlayın ve jeneratörü çalıştırarak PEF’leri uygulayın (Şekil 4A). PEF’lerin etkilerini gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için floresanı aynı anda ölçün.