膠芽腫のパルス電界治療のための柔軟な有機電子デバイス

すべての実験手順は、フランスの法律に従い、実験動物の世話と使用に関する1986年11月24日の欧州共同体理事会指令(86/609 / EEC)に準拠して実施されました。動物に関する研究は、ブッシュデュローヌのサービスデパルテメンタルデサービスデブッシュデュローヌによって承認され、プロヴァンスコートダジュールの倫理委員会によって承認されました(Apafis #22689-2019100414103054)。 1. フレキシブルデバイスの微細加工(図1) スライドガラスのクリーニングガラススライドを2%石鹸溶液で15分間超音波処理します。水ですすいでください。 80%の純粋なアセトンと20%の純粋なイソプロパノールの混合物で15分間再び超音波処理する。注意: これらの溶剤は有害で可燃性です。個人用保護具(PPE)を着用し、ドラフトの下で取り扱ってください。 スライドをイソプロパノールですすぎ、エアガンで乾かします。注意: プロセス全体を通して、アセトンが基板上で乾燥しないようにしてください。 金電極パターニング(図 1A)パリレン堆積システムで3 μmのパリレンC(PaC)層を堆積します(図1Aa)。洗浄したスライドガラスを成膜チャンバーに入れます。チラーに石鹸をスプレーし、乾燥させて、堆積システムの指定されたコールドトラップに挿入します。この接着剤防止剤は、堆積後にチラーからPaCを簡単に除去することを容易にします。注意: PaCは刺激物であり、健康上の危険をもたらします。取り扱い中は手袋を着用してください。 アルミボートで6 gのPaCを計量し、炉に入れます。機械を排気し(P = 10 mTorr)、次のパラメータで堆積を開始します:Tチラー = -100 °C、T炉 = 690 °C、T気化器 = 175 °C、およびTチャンバー = 135 °C。 堆積が終了し、気化器の温度が40°Cを下回ったら、チラー、気化器、および炉の電源を切ります。機械をベントし、サンプルを収集します。 30秒間(100 W、50 sccm)の酸素プラズマ処理によってサンプルの表面を活性化します。 プラズマ処理したサンプルをネガ型フォトレジストで1,000 x g で40秒間スピンコートします。サンプルを110°Cのホットプレートに2分間置きます(図1Ab)。注意: フォトレジスト溶液は可燃性であり、刺激を引き起こします。PPEを着用し、ヒュームフードの下で取り扱ってください。 UV広帯域コンタクトアライナーのビームラインにiラインフィルターを配置し、インターディジット電極設計を特徴とするマスクを通してフォトレジストを露光します(図1Ac)。注:ギャップ50または250μmの桁間電極はレイアウトエディタを使用して設計され、フォトマスクはレーザーフォトプロットによってポリエステルフォトマスクを製造する会社に注文されました。 上記のサンプルをホットプレートで110°Cで3分間焼き、室温まで5分間冷却します。サンプルを金属イオンフリーの現像液に3分間浸漬し、未露光のフォトレジストを除去します。サンプルを水ですすぎ、エアガンで乾燥させます(図1Ad)。注意: 開発者ソリューションは刺激物です。PPEを着用し、ヒュームフードの下でハンドルを取ります。 60秒間(100W、50sccm)の酸素プラズマ処理によってサンプルの表面を活性化します。 次のように、20 nmのクロム付着層と300 nmの金の層を熱蒸発器で堆積させます(図1Ae)。 蒸発器マシンを通気し、金属ネジで上部の丸いプレートにサンプル(下向き)をクリップします。専用のるつぼにそれぞれクロムと金を入れます。機械を密閉して排気し、5・10-6 Torr未満の圧力に到達します。サンプルホルダーの回転を開始します。 クロムを含むるつぼを選択し、0.2 Å·s-1 の堆積速度に達するまで、そこを流れる電流をゆっくりと増やします。シャッターを開き、20nmのクロムが堆積するまで待ちます。シャッターを閉じ、0mAになるまで電流をゆっくりと下げます。 金を含むるつぼを選択し、0.2 Å·s-1 の堆積速度に達するまで、そこを通過する電流をゆっくりと増やします。シャッターを開いて金を蒸発させ、10 nmの金が堆積するまで待ってから、約300 nmが堆積するまで堆積速度を1.5 Å・s-1 に上げます。シャッターを閉じ、電流をゆっくりと0mAまで下げます。 堆積後、サンプルを室温まで15分間冷却します。サンプルホルダーの回転を停止し、機械を通気してサンプルを収集します。 サンプルをアセトンの入ったビーカーに浸します。ビーカーを110rpmに設定された振とうプレートに15分間置き、フォトレジストを持ち上げます。サンプルをイソプロパノールですすぎ、エアガンで乾燥させます(図1Af)。 30秒間(100 W、50 sccm)の酸素プラズマ処理によってサンプルの表面を活性化します。 パリレン蒸着システムでPaCの3μm絶縁層を堆積します(ステップ1.2.1を参照)(図1Ag)。 アウトライン開口部(図1B)サンプルをポジ型フォトレジストで600 x g で35秒間スピンコートします。110°Cのホットプレートに2分間置きます(図1Ba)。注意: フォトレジスト溶液は可燃性であり、刺激を引き起こします。PPEを着用し、ヒュームフードの下でハンドルを取ります。 UVブロードバンドコンタクトアライナーのビームラインにiラインフィルターがないことを確認し、UVブロードバンドコンタクトアライナーでデバイスの輪郭を特徴とするマスクを通してフォトレジストを露光します(図1Bb)。 サンプルを金属イオンフリーの現像液に4分間浸漬し、露光されたフォトレジストを除去します。サンプルを水ですすぎ、エアガンで乾燥させます(図1Bc)。 反応性イオンエッチャー(160W、22分、O2:50sccm、CF4:10sccm)でPaCの2層を通して輪郭をエッチングする(図1Bd)。 残りのフォトレジストをアセトンで取り除き、イソプロパノールですすぎ、エアガンでサンプルを乾燥させます。 PEDOT:PSSコーティング(図1C)2%石鹸溶液を70 x g で35秒間スピンコートします(図1Ca)。 パリレン蒸着システムでPaCの3 μm犠牲層を堆積します(ステップ1.2.1を参照)(図1Cb)。 ポジ型フォトレジストを600 x g で35秒間スピンコートします。サンプルを110°Cのホットプレートに2分間置きます(図1Cc)。 UV広帯域コンタクトアライナーのビームラインにi-lineフィルターがないことを確認し、電極の活性面を特徴とするマスクを通してフォトレジストを露光します(図1Cd)。 サンプルを金属イオンフリーの現像液に4分間浸漬し、露光されたフォトレジストを除去します。サンプルを水ですすぎ、エアガンで乾燥させます(図1Ce)。 反応性イオンエッチャーでPaCをエッチングし、電極の活性面を開いた(160W、24分、O2:50sccm、CF4:10sccm)。活性表面に残留PaCがないことを顕微鏡で確認します(図1Cf)。 残りのフォトレジストをアセトンで取り除き、イソプロパノールですすぎ、エアガンでサンプルを乾燥させます。 酸素プラズマ処理を90秒間(100 W、50 sccm)使用してサンプルの表面を活性化します。 化学重合PEDOT:PSSの市販分散液を5体積%のエチレングリコール(EG)および0.1体積%のドデシルベンゼンスルホン酸(DBSA)と混合します。15分間超音波処理します。1重量%の(3-グリシジルオキシプロピル)トリメチルシロキサン(GOPS)を加え、5分間超音波処理する。溶液を1.2 μmフィルターでろ過します。注意: EGは刺激物であり、健康上の危険をもたらします。DBSAは刺激性および腐食性です。GOPSは腐食性です。適切なPPEを着用し、これらの化学物質をヒュームフードの下で取り扱ってください。注意: 総量はサンプル数によって異なります。10枚の標準スライドガラスに対して、次の量に対応する少なくとも20 mLを準備します:18.78 mLのPEDOT:PSS、1 mLのEG、20 μLのDBSA、および200 μLのGOPS。 4層のPEDOT:PSS溶液を150 x g で35秒間スピンコートします。各層を成膜した後、サンプルをホットプレート上で110°Cで60秒間焼き、室温まで5分間冷却してから、次の層を回転させます(図1Cg)。 サンプルを水に浸して犠牲PaC層を除去します(図1Ch)。 サンプルを140°Cで1時間焼きます。 サンプルを脱イオン水に30分間浸漬して、PEDOT:PSSフィルムに残っている石鹸と低分子化合物を除去し、サンプルをガラス基板から剥離します(図1Ci)。 接続とパッケージング(図1D)銅でコーティングされたポリイミドフィルムにアクリル塗料の薄層を堆積させます(図1Da)。エアロゾルを使用して、均一な塗料層を取得します(図1Db)。 アクリル絵の具をレーザー(75 kHz、7 W、1レーザーパス、400 mm・s-1)でパターン化し、2つの長方形のコンタクトパッド(5 mm x 15 mm、1.5 mmギャップ)を得ました(図1Dc)。 銅を飽和30%(w / v)塩化第二鉄(FeCl3)で40°Cで15分間水中でウェットエッチングします(図1Dd)。注意: FeCl3 は刺激性および腐食性です。ヒュームフードの下で手袋で取り扱ってください。 アクリル絵の具を布で軽くこすり、アセトンで剥がします(図1De)。 パターン化されたポリイミドフィルムをレーザー(15 kHz、10 W、30 レーザーパス、130 mm・s-1)で長方形(15 mm x 30 mm)にカットします(図1Df)。 銀ペーストを3軸分注機で3気圧の圧力で直径330μmの針(5m・min-1)で分注します(図1Dg)。注意: 銀ペーストは刺激物です。手袋で取り扱ってください。 ピンセットを使用して双眼顕微鏡下でPaCプローブをポリイミドフィルムに合わせ、取り付けます(図1Dh)。注意: 位置合わせマークは、コンタクトパッドへのプローブの位置決めを容易にするために、手順1.5.2でパターン化できます。 オーブンで140°Cで2時間焼きます。 コンタクトパッドに1 cm2 のポリイミド保護テープを貼ります(図1Di)。 PaCプローブとポリイミドフィルムが接続されている界面をPDMSに浸します(図1Dj)。 50°Cで2時間焼きます。 保護テープをはがしてコンタクトパッドを開きます(図1Dk)。注意: in vitro デバイスの微細加工も同様ですが、手順1.2.1、1.3、および1.5はスキップする必要があります。 2. 膠芽腫GCaMP6f安定細胞株の作製 レンチウイルス産生75 cm²のフラスコで、レンチウイルス産生に最適化されたHEK 293T由来の細胞株を、4.5 g·グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムのL-1、および10%テトラサイクリンフリーウシ胎児血清(FBS)、100単位・mL-1のペニシリンおよび100μg・mL-1のストレプトマイシンを80%コンフルエントになるまで少なくとも3日間補給した。 フラスコから培地を取り出します。細胞を10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で穏やかにすすぎます。 1 mLの0.25%トリプシン/EDTA溶液を加え、フラスコを37°Cで5分間インキュベートします。注意:トリプシン/ EDTA溶液は健康上の危険をもたらします。PPEを着用し、ヒュームフードの下でハンドルを取ります。 8 mLの培地を追加します。細胞懸濁液を静かに洗い流します。 細胞をカウントし、8mLの培養液中のシャーレ中の4 x 106 細胞をプレート化する。 翌日、遺伝子GCaMP6fおよびピューロマイシンに対する耐性を付与する選択マーカーを含むプラスミド25μgを総容量600μLの水で希釈する。トランスフェクション試薬のチューブに加えます。3,000rpmで10秒間渦巻き、チューブを室温で10分間インキュベートして、ナノ粒子の生成を可能にします。 チューブの内容物をHEK 293 T細胞の培養物に滴下し、手で穏やかに揺らします。細胞を37°Cで少なくとも4時間インキュベートします。 ナノ粒子複合体を含む培地を新鮮な培地と交換し、細胞を37°Cで戻します。 3日後、上清を収集し、500 x g で10分間遠心分離して細胞の破片を除去します。ウイルス粒子を含む液相を収集します。注:上清中のウイルス産生は、定量的レンチウイルス力価試験を使用して確認でき、-80°Cで少なくとも2年間保存できます。 膠芽腫細胞形質導入75cm²のフラスコに、1g・cm2を含む10mLのDMEM中で膠芽腫細胞を培養する。グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムのL-1を、10%テトラサイクリンフリーFBS、100単位・mL-1のペニシリン、および100μg・mL-1のストレプトマイシンを少なくとも4日間補給した。 培地を廃棄し、ステップ2.1.9で得られた上清を標的細胞に加えます。 培地に5 μg・mL-1 の臭化ヘキサジメトリンを添加して、形質導入を改善します。37°Cで6時間インキュベートします。 培地を10 mLの新しい培地と交換します。注意:臭化ヘキサジメトリンは刺激物です。.手袋で取り扱ってください。 安定細胞株の作製形質導入の2〜3日後に、1g・1 g・sを含むDMEM10 mLを加えます。グルコースのL-1、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および重炭酸ナトリウム、10S、100単位・mL-1のペニシリン、100μg・mL-1のストレプトマイシン、およびピューロマイシンを添加して、形質導入されていない細胞を殺します。この培地で細胞を少なくとも3日間培養する。注意:ピューロマイシンは刺激物です。手袋で取り扱ってください。注:ピューロマイシンに対する細胞の感受性は、形質導入前に、異なる濃度のピューロマイシンを含む推奨培地で細胞を培養することによりテストする必要があります。1日後、顕微鏡で細胞を確認します。抗生物質が毒性が強すぎず、トランスフェクトされた細胞も殺す可能性があることを確認するために、大部分の細胞が死んでいるが生きている細胞はほとんどない適切な濃度を選択してください。 培地を取り出し、10 mLのPBSで細胞を洗い流します。 0.25%のトリプシン/EDTA溶液を1 mL加え、フラスコを37°Cで5分間インキュベートします。 8 mLの培地を追加します。細胞懸濁液を静かに洗い流します。 100 μLの細胞懸濁液を採取し、セルカウンターで細胞濃度を測定します。50 μLの細胞懸濁液を、60 μmセンサーを備えたハンドヘルド自動セルカウンターで吸引します。 1 セル/ウェルを 96 ウェルプレートにシードします。例えば、1mLあたり1×103 細胞の濃度の場合、1/(1×103)、すなわちウェル当たり0.001mLの細胞懸濁液を添加する。成功の可能性を高めるためにすべての井戸に種をまきます。培養液で完了し、ウェルあたり総容量200 μLに達します。 1日後、1つの細胞を含む各ウェルを見つけ、その蛍光を確認します(λexc = 490 nmおよびλem = 530 nm)。トランスフェクトされた細胞を1つだけ含むウェルに印を付けます。井戸がほぼ合流するまで数日間成長を続けます。 培地を廃棄し、200 μLのPBSで細胞を洗い流します。100 μLの0.25%トリプシン/EDTA溶液を加え、96ウェルプレートを37°Cで5分間インキュベートします。 100 μLの培地を加え、細胞懸濁液を静かに洗い流します。細胞懸濁液をペトリ皿に移す。5 mLの培地を加え、ペトリ皿がほぼコンフルエントになるまで細胞を数日間増殖させます。 培地を廃棄し、5 mLのPBSで細胞を洗い流します。1 mLの0.25%トリプシン/EDTA溶液を加え、ペトリ皿を37°Cで5分間インキュベートします。 6 mLの培地を加え、細胞懸濁液を静かに洗い流します。細胞懸濁液をT25フラスコに移します。フラスコがほぼコンフルエントになるまで数日間成長を続けます。 培地を廃棄し、5 mLのPBSで細胞を洗い流します。1 mLの0.25%トリプシン/EDTA溶液を加え、T25フラスコを37°Cで5分間インキュベートします。 1 g·グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムのL-1、および10S、100単位・mL-1のペニシリン、および100μg・mL-1のストレプトマイシンを補充した。細胞懸濁液を静かに洗い流します。 細胞懸濁液を4つのT25フラスコ(フラスコあたり2 mL)に分割し、各フラスコに5 mLの培地を追加します。フラスコがほぼコンフルエントになるまで、細胞を数日間成長させます。 3つのフラスコに対して手順2.3.12を繰り返し、最後のフラスコを手順3.1.3のために保管します。細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、150 x g で5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを900 μLに再懸濁します。 細胞を穏やかに混合して、均質な細胞懸濁液を維持します。 細胞懸濁液を極低温保存バイアルに移します。100 μLのジメチルスルホキシドを加える。クライオバイアルを-80°Cで一晩置きます。凍結細胞を液体窒素に移し、さらなる実験を行います。注:トランスフェクションの効率は、培地に5 μMのイオノマイシンカルシウム塩を添加し、蛍光顕微鏡(λexc = 490 nmおよびλem = 530 nm)で誘導蛍光の増加を確認することで評価できます。 3.3Dモデル 回転楕円体文化脱イオン(DI)水中の1%(w / v)アガロースの溶液を調製します。100 mLのDI水に100 gのアガロース粉末を加え、すべての粉末が溶解するまで電子レンジで溶液を加熱します。塊を避けるために定期的に溶液をかき混ぜます。溶液を120°Cで20分間オートクレーブします。 オートクレーブから取り出したら、ウェルあたり75 μLのアガロース溶液を96ウェルプレートに慎重に加えます。それを井戸の側面に堆積させて半月板を形成し、付着しない丸い底をもたらします。室温で15分間固化させます。 ステップ2.3.14で得られたフラスコから細胞を剥離する(ステップ2.3.12)。 膠芽腫細胞のウェルあたり10,000細胞を追加し、1g·グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムのL-1、および10%ウシ胎児血清(FBS)、100単位・mL-1のペニシリンおよび100μg・mL-1のストレプトマイシンを添加した。 プレートを動かさずに細胞を37°Cで3日間インキュベートします。次に、さらなる実験が行われるまで、2日ごとに培地の半分をマルチチャンネルピペットで新鮮な培地に交換します。アガロースまたはスフェロイド自体への損傷を避けるために、ピペットチップをウェルの上部に保管してください。注:スフェロイドのサイズは、播種する細胞の数と細胞株に依存するため、実験に応じて調整する必要があります。 インオボモデルウズラ(C. japonica)の受精卵をインキュベーター(37°C、湿度57%)に置き、2時間ごとに卵を回転させる自動回転子付きのトレイに置きます。この日は胚の日 (ED) 0 と見なされます。 プラスチック製の計量ボートを70%(w / v)エタノールに入れて洗浄します。計量ボートを取り出し、ドラフトの下で乾燥させます。注:この時点から、実験は無菌状態では実行されません。しかしながら、胚のカビの発生を避けるためには、清潔な条件が必要である。 ED3では、70%(w / v)エタノールで事前に洗浄した細い先端のピンセットを使用して卵をそっと開きます。胚をプラスチック製の計量ボートに注ぎ、別の計量ボートで覆い、37°Cの標準的な加湿インキュベーターに3日間入れます。 ED6では、23 Gの針で絨毛尿膜(CAM)を少し切開します。 ピペットを使用して、切開部に7日間のスフェロイドを置き、さらなる実験が行われるまで、胚を3日間インキュベーターに戻します。注:蛍光色素を胚の目に注入して、血管を視覚化することができます。 実験当日、マイクロマニピュレーターを使用して血管新生腫瘍の上にフレキシブルプローブを置きます。 ザ in vivo モデル注:プロトコルのこの部分は、以前にリファレンスで公開されたものから適応されています14.成体多色蛍光AMU-神経炎症マウス(B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD)を用いた。これらのマウスは、Thy1の亜集団の標識を提示します+ ECFPの遺伝子導入発現による神経細胞、末梢LyzMの標識+ EGFPの遺伝子導入発現およびCd11cの制御下でEYFPを発現するミクログリアのサブタイプの標識による炎症細胞+.簡単に言えば、動物を治療または注射の前に1.5%イソフルランで2分間軽く鎮静させる。手術の前に、動物はケタミン(120 mg / kg;IP)およびキシラジン(12 mg / kg;IP)。次に、3%リドカインゲルを局所的に塗布して、定位サポートの固定に関連する耳の痛みを軽減します。次に、0.25%ブピバカイン溶液を手術部位に投与して、開頭術による痛みを軽減します。マウスが手術の準備をしたら、参照に従って直径4mmの開頭術を行った。14.26Gの針で、開頭術の中央の硬膜に穴を開け、腫瘍スフェロイドに参考文献に記載されている注射システムを注入しました。14.さらに、ここで説明したように、開頭術をガラス窓で密封する前に、腫瘍スフェロイドを発現するGCamp6またはDsRed上に可撓性電極を配置した。開頭術を覆うように、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を一滴置きます。フレキシブル電極をDPBSのドロップの上に置き、コンタクトパッド付きのプローブの背面をマウスの背面にそっと置きます(図4B)。注意: 滅菌手袋と「チップのみ」のテクニックを使用してください。非滅菌面に接触した場合は、手袋を交換してください。この手順の間、熱サポートを提供します。 プローブが硬膜の上に平らに置かれ、脳の湾曲を追跡するまで、DPBSを小さな紙で触れてDPBSを吸収します。DPBSの小さな層が電極の側面から逃げずに電極の下に残っていることを確認してください。これにより、次のステップでの接着剤の波及に対するバリアが保証されます。注意: 使用前にすべての機器を滅菌してください。 プローブにシリコン接着剤を少量滴下し、5mmの丸いカバーガラスで覆います。シリコーンが均等に分散し、カバーガラスとプローブの間の距離が最小になるまで、カバーガラスを押し下げます。カバーガラスをさらに30秒間押し下げて、シリコーンが固まるようにします。 カバーガラスを固定するには、側面に瞬間接着剤をすばやく塗布し、接着剤が硬化して固まるまで押し下げます。 つまようじを使用して、プローブの首に瞬間接着剤を塗布し、瞬間接着剤が首の下に引き込まれるように注意して、安定したサポートを提供します。 頭蓋骨を歯科用セメントで覆い、慢性キャップを作ります。カバーガラスの端だけを覆うように特に注意してください。 プローブの背面を持ち上げ、プローブのネックの下にセメントを塗布します。プローブが硬化する前に、プローブをセメントの上に置きます。実験中にプローブの表面がカバーガラスの表面と同じ高さになり、顕微鏡の対物レンズの邪魔にならないように、鈍い鉗子でプローブの首をそっと押し下げます。 プローブネックの上部を1.5mm以下の歯科用セメント層で覆い、プローブをしっかりと保持します。カバーガラスの周りに1〜2 mmの距離で1.5 mmの隆起を示すセメントウェルを構築し、2光子イメージング用の浸漬流体用の盆地を作成します(図4C)。 セメントが硬化したら、ブプレノルフィン術後鎮痛薬(0.05 mg / kg、体重10 gあたり0.1 mL)を皮下投与し、動物が目覚めるまで暖かい雰囲気に保ちます。.これには、赤外線電球への近さや、動物をペーパータオルで包むことが含まれます。注意: 温度を監視するために、マウスの高さに温度計を置きます。 ポテンショスタットを使用して1〜10kHzの範囲のインピーダンスを特性評価します。 動物を少なくとも10日間手術から回復させます。手術直後に抗炎症薬を投与し、動物の状態を監視し続けて、適切な術後鎮痛を提供します。 4. パルス電界(PEF)の送達とイメージング 標本を蛍光顕微鏡の下に置きます。3Dモデルの場合、腫瘍は上からしか観察できません。注:in ovo モデルでは、落射蛍光顕微鏡(ただし、2光子顕微鏡でも可能です)で実験を行いましたが、 in vivo モデルでの実験は2光子顕微鏡で行われました(図6)。 ポゴピンコネクタ(in vitro)またはクロコダイルクリップ(in vivoおよびin vivo)を使用して、パルス発生器をデバイスのコンタクトパッドに接続します(図4A)。必要なパラメータ(パルス数、電圧、パルス幅、周波数)を設定し、発電機を実行してPEFを適用します(図4A)。蛍光を同時に測定して、PEFの効果をリアルタイムで観察します。