使用200 KV透射电子显微镜常规收集高分辨率冷冻电镜数据集

该协议的所有步骤均针对配备Selectris-X能量滤波器（以下简称能量滤波器）和Falcon 4探测器（以下简称直接电子探测器）的200 kV Glacios TEM系统（以下简称200 kV TEM）进行了描述。协议步骤特定于 EPU 应用程序，EPU 应用程序是每个 Glacios 系统上预安装的默认 SPA 数据收集软件。下面的协议步骤对应于 EPU 版本 2.14，使用不同的 EPU 版本时，需要进行少量修改。该协议的先决条件是：i）喷枪和色谱柱对齐良好，ii）EM校准正确，iii）EPU自动功能正确校准。 1. 将网格加载到显微镜中 注意：本实验中使用的200 kV TEM可以在盒内容纳多达12个自动网格（即，夹入特殊墨盒的传统TEM网格），该盒装入显微镜的自动进样器内，并始终保持在低于-170°C的温度下，以防止样品失透。 在液氮条件下将自动格栅插入自动加载机盒中。 将带有自动格栅的暗盒插入液氮冷却的转移胶囊中。 将胶囊插入显微镜，然后单击显微镜UI中的 Dock 按钮，将胶囊中的盒式磁带加载到显微镜的自动加载器中。 单击“ 清单 ”按钮以检查加载的盒中是否存在自动网格。 单击“ 加载 ”和“ 卸载 ”按钮，将自动网格插入到列中以进行TEM成像。 2. 在数据管理平台中设置项目（可选） 注意：样本信息和收集的数据可以在提供的数据管理平台中进行组织，该平台允许存储所有连接仪器的结构化数据。可以创建一个项目，可以为其定义任何工作流步骤，以有组织的方式捕获图像和元数据，以便进行查看和导出。 启动数据管理门户应用程序并使用用户名和密码登录。 在门户 UI 的左侧面板中，单击“ 添加项目 ”按钮以创建新项目，或单击下面列表中现有项目的按钮以打开项目。 单击“ 添加实验 ”按钮，在打开的项目中创建新实验。 在新实验的 “元数据 ”面板中填写描述，然后单击“ 添加工作流 ”按钮以在实验中创建新工作流（例如，单颗粒分析）。 （可选）单击中间面板中的“ 添加步骤 ”按钮以创建自定义工作流，或向预定义的 SPA 工作流添加其他步骤（图 1 和 图 2）。注意：这些步骤可能代表样品制备，通过生物化学技术进行样品表征，样品玻璃化，冷冻电镜网格筛选，数据收集会话和数据分析。 （可选）在每个步骤的 “注释 ”中填写说明，其中可能包括图像和照片。 在工作流中创建数据集步骤，然后选择数据集类型作为 EPU。注意：这将允许分析软件在数据采集期间自动将所有结果数据/元数据放在数据管理门户中的正确位置，并自动将数据导出到首选目的地，同时保持所有步骤和数据传输的完整记录。 在 “生物化学 ”步骤中填充有关样本和 EM 网格的模板，并将每个网格与一个示例相关联（请注意，一个样本可以与多个网格相关联）。 在 “数据集” 步骤的元数据部分中关联示例网格组合。 3. 在分析软件中设置成像预设和图像偏移校准 设置各种成像模式的成像参数，如 表1所示。“讨论”部分详细介绍了选择特定设置的注意事项。 在分析软件的 数据采集 预设中为所选放大倍率设置平行照明注意：在2聚光透镜TEM系统上，C2透镜只有一个设置，用于在给定的SPOT尺寸（即C1透镜的预设强度）下对样品进行平行照明，例如本研究中使用的200 kV透射电镜。因此，每单位面积的电子剂量率（e-/Å2/s）只能通过更改SPOT尺寸设置并根据以下步骤重新调整C2强度（光束强度）来调整。 移动到有支撑碳箔和薄冰或无冰的区域。 在TEM UI的孔径菜单中选择100μm或70μm 物镜孔 径。 按控制面板上的 衍射 按钮切换到衍射模式。 插入荧光屏并将 FluCam 模式更改为 高分辨率。 将中心衍射光斑移动到孔径的边缘。如果光圈边缘不可见，请增加相机长度（使用放大旋钮）。 小心地转动控制面板上的对 焦 旋钮，使后焦平面对焦。当光圈边缘明显锐利时，后焦平面会聚焦。 将FluCam的灵敏度降低到最低水平，并将中心衍射点移动到FluCam的中心。 使用控制面板上的 强度 旋钮最小化中心点的大小。 缩回TEM UI中的物镜孔径并切换回成像模式。 单击分析软件中的“ 获取 ”按钮，将设置保存到数据采集预设中。 在数据采集预设中调整电子剂量率，这是使用检测器的最佳选择： 移动到网格上的空白区域（例如，带有破损碳箔的网格正方形） 单击分析软件中的 测量剂量 按钮以测量电子剂量率。 更改 SPOT 大小以达到最佳剂量率。对于该协议中使用的直接电子检测器，通常使用4-5 e-/pixel/s的剂量率进行高分辨率数据采集。这通常对应于 SPOT 大小 4-6。 如上所述，在新的SPOT尺寸设置下检查并调整平行照明。 选择“分数”下的“EER”选项，以在直接电子检测器33 上使用 EER 模式。 单击分析软件中的“ 获取 ”按钮，将设置保存到数据采集预设中。 切换到 自动对焦 预设，然后按“ 获取 ”按钮以保存用于对焦的照明设置。手动将曝光时间更改为 1 秒，并将分档模式更改为 2。 切换到 “松环” 预设，然后按“ 获取 ”按钮以保存此预设的照明设置。手动将曝光时间更改为 1-2 秒，并将分档模式更改为 2。 切换到 零损耗 预设，然后 按 Get 按钮 保存此预设的照明设置。手动将曝光时间更改为 0.5 秒，并分档模式 4。 使用“准备”选项卡中的“图像偏移校准”任务，按照分析软件手册中所述，校准设置光学设置之间的图像偏移（补充图 1）。 表 1：使用配备能量滤波器和直接电子探测器的 200 kV 冷冻透射电镜进行高分辨率数据采集的典型成像设置。 显示用于设置自动数据收集的每个光学预设的设置（《议定书》第3节）。这些设置特定于本研究中使用的200 kV TEM显微镜和直接电子检测器。 请按此下载此表格。 4. 网格映射和选择用于数据收集的最佳冷冻电镜网格 选择 Atlas 选项卡，然后单击 新建会话 按钮以打开新会话。 填写会话名称和数据存储位置等详细信息，然后单击“ 应用 ”按钮打开新的 “筛选 ”任务窗口，该窗口显示自动加载程序清单中所有网格的列表。（可选）编辑网格的名称。 通过选中相应网格编号旁边的复选框来选择感兴趣的网格。 单击“ 开始 ”按钮以启动所有选定网格的完全自动化的地图集集合。 集合完成后，单击网格标签以查看获取的地图集。注意：各个格网方块根据其相对冰层厚度进行分类，这是基于每个地图集中的相对灰度值评估。分类的网格方块以不同的配色方案进行描述，可用于指导数据采集区域的选择。使用Vitrobot Mk IV生成的网格通常会在整个网格上显示冰层厚度梯度，这可能有助于确定理想的冰层厚度以进行数据收集。最佳网格应包含尽可能少的转移冰污染，并表现出足够的不间断和无裂纹的网格正方形（图3）。可以进一步研究具有合适冰分布的网格，以评估高放大倍率下冰中颗粒的分布（即单个颗粒的密度和方向）。 单击顶部菜单中的 加载样品 按钮，将具有合适冰分布的选定网格插入显微镜柱中。 选择“ 图集 ”选项卡，右键单击图集图像中合适的网格方块，然后从下拉菜单中选择“ 将舞台移动到此处 ”选项，将舞台移动到网格正方形。 选择“ 自动函数 ”选项卡，将网格正方形设置为真心高度。切换到 “欧心高度 ”预设，单击所选网格正方形中间的“ 光束倾斜自动以优心 ”自动功能，然后单击“ 开始 ”按钮。 切换到 网格方块 预设并获取图像。通过右键单击和“将载物台移动到此处”选项，将 载物台 移动到有冰且无污染或污染最小的孔中。 切换到 孔/真心高度 预设并获取图像。通过右键单击和“将载物台移动到此处”选项，将 载物台移动到 感兴趣孔旁边的碳区域。 单击 自动对焦 自动功能，将所需散焦的值设置为 0 μm，迭代为 -2 μm。切换到 自动对焦 预设，然后单击“ 开始” 按钮。 再次选择“ 准备 ”选项卡，然后切换到 “孔/真心高度” 预设。在先前获取的孔图像上，选择孔内的感兴趣区域，然后通过右键单击并选择“ 将载物台移动到此处”选项将载物台移动到 此位置。 切换到 数据采集 预设，并将波束偏移后的等待时间设置为0.5 s，并将载物台后的等待时间设置为20 s。使用 -3 μm 和 -5 μm 之间的散焦采集图像，以提高低分辨率对比度，从而更好地可视化单个颗粒。 或者，根据需要重复步骤4.7-4.13以对不同孔和不同网格正方形中的颗粒进行成像，这些颗粒具有不同的冰厚度。 确定并选择最适合高分辨率数据收集的网格后，单击顶部菜单中的“ 加载样本 ”按钮，将所选网格加载到TEM中。注意：或者，如果需要更多信息和/或需要此筛选过程的自动化，请执行第5节。 5. 在单颗粒分析软件中设置数据收集会话 注意：如果使用金箔网格，客观散光和昏迷对齐的细化（第6节）可能无法可靠地工作。建议加载碳箔网格或交叉光栅EM网格，并在设置数据收集之前执行这些最终对齐。 选择 EPU 选项卡，然后单击 会话创建 按钮以在左侧面板中创建新会话。选择“ 新建会话”选项以使用当前的光学预设，或选择 “从首选项新建” 选项以加载以前导出的会话设置。 填写会话名称和数据存储位置。注意：此位置将用于将数据收集会话中的集成图像和元数据保存在具有会话名称的子文件夹中。虽然这些数据不会占用大量的存储空间，但建议将这些数据保存在DMP服务器的Falcon卸载数据存储上，因为EER相机帧始终存储在具有会话名称的目录中。 选择会话的 “手动 ”类型，以控制在协议中稍后为数据收集选择的网格正方形中各个孔的选择。 选择 “更快 ”采集模式，使用无像差图像偏移（AFIS）进行数据采集，以减少各个孔之间的载物台移动，减少整体样品漂移，并在不降低图像质量的情况下提高数据采集的吞吐量。 选择已保存集成映像的默认 mrc 格式。 指定使用的网格及其类型。该协议使用R-1.2 / 1.3 UltraAufoil用于apo-ferritin，R-2 / 1 Quantifoil网格用于20S蛋白酶体。在标本载体下选择绢剂，在绢型下选择 R1.2/1.3 或 2/1。 可选：单击右下角的 “雅典娜登录 ”按钮以使用 EPU 质量监视器 （EQM）。 在浏览器弹出窗口中输入登录详细信息，以激活会话设置概述中的 设置 部分。 单击设置部分中的 “选择 ”按钮，然后浏览以前创建的数据集（协议部分 2），以将其与当前数据收集相关联。打开 “启用质量监视器 ”复选框。 单击“ 应用 ”按钮以创建新会话。注意：此操作将在左列菜单中打开新任务。在会话期间的任何时候，如果某些详细信息不正确，则可以返回到 会话设置 任务，更改/更新详细信息，然后再次单击“ 应用 ”以更新会话。 在左侧面板中选择 “方块选择” 任务以显示收集的网格图集。 （可选）双击地图集的任何磁贴以查看更高质量的图像，从而更好地判断网格方块中的冰质量。再次双击图像以返回到网格图集。 识别具有以下特征的网格正方形（图4）：（i）网格正方形中的支撑箔完好无损，（ii）箔孔中的玻璃体薄冰（孔看起来比支撑碳箔更亮），（iii）网格正方形中尽可能少的结晶冰污染（黑色斑点），（iv）网格正方形和单个箔孔内的最小亮度梯度。注意：通过选择预设和良好的网格，本研究中使用的200 kV冷冻透射电镜可以以约200-300张短片/小时的速率成像。考虑到这一点，根据需要选择尽可能多的正方形，或者稍后根据显微镜可用的时间返回正方形选择任务来添加更多正方形。作为参考，收集了3000部电影以实现载脂蛋白的1.6 Å分辨率。 选择网格方块以在完整地图集或高质量切片图像中收集数据 右键单击感兴趣的网格正方形，然后选择上下文菜单中的 “选择” 选项 或者，按住键盘上的 Ctrl 键 ，然后左键单击所需的网格方块 相反，右键单击并 取消选择 或按住 Shift 键并左键以删除方块 注意：后续步骤对于确保数据收集导致高分辨率重建至关重要。开始在网格正方形中用薄冰层选择孔。在此网格方块上单击鼠标右键，然后选择 “选择孔” 选项以开始 “孔选择” 任务。 在左侧面板中选取 “孔选择” 任务，以选取所选栅格方块中的孔。 单击“ 自动尤心 ”按钮可自动移动到第一个选定的网格正方形，调整欧心高度并获取网格正方形图像以查找箔孔。 单击“ 查找孔 ”按钮以查找图像中的箔孔。注：如果找孔效果不佳（即，图像中存在跳过的孔或大小不正确的孔），请检查在“会话设置”任务的“定量箔类型”条目中输入的值是否正确，然后再次查找孔。如果仍未正确找到孔，请单击“测量孔尺寸”按钮以手动设置孔直径和距离，然后再次查找孔。 单击网格栏按钮附近的 “移除孔” 按钮，以取消选择网格栏附近的孔。 调整 Ice滤镜 的亮度直方图（位于软件窗口的右下角）中的限制，以消除所有冰太厚的孔（使用左限制线）以及所有空孔（使用右限制线），如图 4所示。注意：为了优化，还可以在“ 应用 ”按钮旁边的相应文本框中输入特定强度值。 或者，使用 “选择画笔”手动优化孔的选择：左键单击并拖动画笔以取消选择不需要的孔。按住 Ctrl 键 并左键可重新选择箔孔。按住 Shift 键并使用鼠标滚轮滚动以调整画笔大小。 选择一个孔来设置和测试将在整个数据收集过程中重复使用的数据采集模板：在网格方形图像中的孔上单击鼠标右键，然后选择“将舞台移动到位置”选项。 在左侧面板中选择 模板定义 任务。 选择 孔/优心 预设，然后单击“ 采集 ”按钮以获取图像。 单击“ 查找并居中孔 ”按钮，将图像中的孔居中。 将 图像偏移后的延迟 设置为 0.5 秒（默认值）和 舞台偏移后的延迟 设置为 20 秒的值。注意：由于平行光束直径固定在本研究中使用的200 kV冷冻透射电镜系统上，并且通常对应于50μm孔径下的1.6-1.7μm，因此使用R-1.2 / 1.3网格每个孔只能获得1个图像，使用R-2 / 1或R-2 / 2网格每个孔（接近相反的边缘）可以获取2个图像。请注意，屏幕上设置的采集区域的大小与实际光束直径不符。可以使用图像比例尺来估计适当的放置距离。 选择“ 添加采集区域 ”按钮，然后单击图像以选择中心孔中将采集高放大倍率图像的位置。 选择“ 添加自动对焦区域 ”按钮，然后单击图像以选择支撑箔上的位置，该位置位于将执行图像自动对焦的中心孔旁边。注意：用于聚焦的光束尺寸为1.6-1.7μm，应与碳上的相邻孔等距放置。 单击绿色采集区域，在软件窗口顶部的“ 散焦列表”中设置一系列散焦 值。首先输入最高散焦，以在以下 模板执行 任务的测试运行中增强粒子的可视化效果。 单击蓝色自动对焦区域，在同一区域中设置特定于自动对焦的设置： 选择“ 居中后 ”选项以在每个 AFIS 群集开始时自动对焦。 选择物 镜 选项，实现更快的自动对焦和更低的载物台漂移。 选择 模板执行 任务，然后单击按钮 执行。 观察数据采集过程的各个步骤（将孔居中，在所选区域自动对焦，在设定区域中进行图像采集），并检查最终高倍率图像中成像颗粒的质量。 单击高放大倍率图像窗口右下角的FFT 按钮以 检查FFT图像，并直观地评估松环是否显示多个振荡并在FFT图像中扩展到高分辨率。 如果模板执行成功完成，请单击“孔选择”任务中的“准备所有方块”按钮，以便根据第一个格网方块中使用的设置，在所有其他选定的格网方块中自动设置数据收集组。 6. 开始数据收集前的最终显微镜对准 注意：为了获得最佳的高分辨率结果，最灵敏的对准应该在数据采集软件中与数据采集模式完全相同的设置下完成，并且就在开始实际数据采集之前。这些对齐应在网格的薄支撑碳的位置完成，与任何网格条保持足够远的位置，并在欧心高度对齐。 选择 模板执行 任务，获取新图像，并通过右键单击将舞台移动到碳箔上的干净区域，然后选择菜单选项 将舞台移动到此处。 选择 自动功能 选项卡，将 所需散焦 设置为 0 μm ，迭代 为 -2 μm。切换到 自动对焦 预设，然后单击“ 开始 ”按钮以运行自动对焦功能。 放下荧光屏，然后在TEM UI中打开 直接对齐 菜单。 为了获得最佳效果，有经验的用户可以验证枢轴点对齐：在“直接对齐”菜单中选择nP Beam Tilt pp X任务，并使用控制面板上的多功能旋钮最大限度地重叠反弹光束。对 np Beam Tilt pp Y 任务重复上述步骤。 单击荧光屏相机菜单中的 EF 按钮以显示一个绿色圆圈，指示能量滤光片入口孔径，并将光束居中在绿色圆圈上。注：在继续操作之前，请确保涡轮泵已停止;它的振动减少了可见的松环的数量，并经常导致自动功能失败。 返回软件窗口，然后选择菜单栏中的“ 自动功能 ”选项卡。 选择“ 自动恢复” 任务，切换到“ 传递环” 预设，然后按 “开始” 按钮。观察该过程以确保（i）拍摄的图像在碳上，（ii）Thon环清晰可见，以及（iii）计算的CTF拟合（虚线）很好地放置在Thon环最小值处（补充图2）。 选择 “自动昏迷”任务， 然后按 “开始” 按钮 。观察该过程，以确保拍摄的图像在碳上，并且Thon环清晰可见，并且计算出的配合（虚线）很好地放置在Thon环最小值处。使用鼠标滚轮放大每个 Thon 环图像（补充图 3）。注意：如果显微镜配备了能量滤光片，则应将能量滤光片调谐作为对准序列的一部分进行，以使滤光片狭缝居中到零损耗峰值，并校正能量滤光片棱镜中的任何变形（步骤6.9-6.14）。这些对齐应在网格的空白区域完成，例如在断开的网格正方形内。 打开 夏尔巴 UI 并选择 能量过滤器 应用程序（补充图 4）。 在“设置”窗口中将相机设置为EF-Falcon，图盒4倍，曝光时间为0.2秒。 单击“零损耗”选项中的“中心”按钮，将零损耗能量滤波器狭缝居中。 单击“等色度”选项中的“调谐”按钮（补充图 4）。 单击“几何和色度失真”选项中的“调谐放大倍率”和“调谐失真”（补充图 5，补充图 6） 如果结果不在指示的规格范围内，并且在输出报告中以红色显示，请再次迭代步骤 6.11 中的对齐方式。注意：虽然直接电子探测器增益参考可以在几个月内保持稳定，但如果空白区域的图像没有显示均匀的强度，但表现出条纹或其他明显特征，则应使用 Falcon 4参考图像管理器 获取新的增益参考。或者，计算此类图像的快速傅里叶变换 （FFT），并确保没有可见的线。 在软件窗口中，选择“ 准备 ”选项卡并切换到“ 数据采集” 预设。 将剂量设置设置为 40 e-/Å2 ，然后单击测量 剂量率 按钮。 进入 EPU 选项卡，选择 自动采集 任务，并可选择检查 自动零损失 功能;单击“ 开始运行 ”按钮以开始全自动数据收集。 7. 在数据收集过程中监控和优化数据质量 注意：在数据收集过程中，可以通过数据管理门户使用 EQM 监视收集的数据。EQM 动态执行运动校正和 CTF 确定，并在门户中显示结果。然后，用户能够判断单个采集的质量，查看各种质量指标的图表，过滤掉不需要的采集，并将数据导出到其最终存储中，无论是动态还是作为批处理作业。 导航到分析软件使用 Web 浏览器将数据放置到的数据集。 在数据集概览中，采集卡以图形格式显示有关运动校正和CTF确定的信息。单击单个卡片以获取更多信息。 启用 DataViz 面板以显示来自完整数据集的聚合图形，这些图形显示每次采集的散焦、散光和 CTF 置信度范围（补充图 7）。 使用面板顶部的过滤器仅选择在请求的散焦范围内、散光接近于零的数据，并且可以确定 CTF 直到指定的（目标）分辨率。设置筛选器后，按 应用 按钮以在数据集概述窗口中仅显示所选数据。 当大多数采集的图像都在设定的标准范围内时，让数据收集会话继续完成。如果只有极小部分采集的图像满足设定的标准，请重新配置分析软件设置，移动到样品上的另一个区域（按分析软件中的 “下一个网格方块 ”按钮），或停止数据收集。