Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Bu yöntemin amacı, retinal girdinin zebra balığı beynindeki görsel işlem merkezi olan optik tektumun büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaktır. Bir gözün çıkarılması ve ardından optik tektumun iki tarafının karşılaştırılmasıyla, aynı numunedeki tektal değişiklikler gözlemlenebilir ve normalleştirilebilir, böylece birden fazla örnek arasında karşılaştırma yapılabilir. Bu teknikle birleştirilen modern moleküler yaklaşımlar, görsel sistem büyümesi ve gelişiminin altında yatan mekanizmaların yanı sıra aksonal dejenerasyon ve rejenerasyon hakkında fikir verecektir.

Duyusal sistemler – görsel, işitsel ve somatosensoriyel – dış organlardan bilgi toplar ve bu bilgiyi merkezi sinir sistemine iletir, orta beyindeki dış dünyanın “haritalarını” oluşturur ^1,2. Görme, birçok balık da dahil olmak üzere neredeyse tüm omurgalılar için baskın duyusal modalitedir. Gözdeki nöral doku olan retina, öncelikle retinanın projeksiyon nöronları olan fotoreseptörler, bipolar hücreler ve retinal ganglion hücrelerinden (RGC’ler) oluşan nöronal bir devre ile bilgi toplar. RGC’ler, retinanın iç yüzeyinden optik sinir kafasına giden yolu bulan uzun aksonlara sahiptir, burada beyinde büyülenir ve birlikte hareket ederler, sonuçta dorsal orta beyindeki görsel işlem merkezinde sona ererler. Bu yapıya balıklarda ve diğer memeli olmayan omurgalılarda optik tektum denir ve memelilerdeki üstün kollikulusa homologdur³.

Optik tektum, dorsal orta beyinde bilateral simetrik çok katmanlı bir yapıdır. Zebra balıklarında ve diğer balıkların çoğunda, optik tektumun her bir lobu yalnızca kontralateral gözden görsel girdi alır, böylece sol optik sinir sağ tektal lobda sona erer ve sağ optik sinir sol tektal^lobda sona erer 4 (Şekil 1). Memeli meslektaşı olan üstün kollikulus gibi, optik tektum da görsel bilgiyi seçmeler ve somatosensation dahil olmak üzere diğer duyusal girdilerle bütünleştirir, görsel dikkatteki kaymaları ve sakkadlar ^1,5,6 gibi göz hareketlerini kontrol eder. Bununla birlikte, memeli superior kollikulusundan farklı olarak, optik tektum, tektal proliferasyon bölgesi⁷ olarak adlandırılan tektal lobların medial ve kaudal kenarlarının yakınındaki özel bir kök hücre nişinden sürekli olarak yeni nöronlar ve glia üretir. Optik tektumda ve merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerinde proliferatif progenitörlerin bakımı, kısmen, zebra balığı^8’de belgelenen olağanüstü rejeneratif kapasiteye katkıda bulunur.

Kör veya tek gözlü balıkların beyinlerini inceleyen önceki çalışmalar, optik tektum büyüklüğünün aldığı retinal innervasyon miktarı^ile doğru orantılı olduğunu ortaya koymuştur 9,10,11. Gözleri erken embriyogenezde dejenere olan yetişkin mağara balıklarında, optik tektum, yakından ilişkili, gören yüzey balıklarından belirgin şekilde daha küçüktür⁹. Mağara balık gözü dejenerasyonu, embriyogenez sırasında endojen lensin yüzey balığından bir mercekle değiştirilmesiyle engellenebilir. Bu tek gözlü mağara balıkları yetişkinliğe yetiştirildiğinde, innerve tektal lob, innerve edilmemiş tektal lobdan yaklaşık% 10 daha fazla hücre içerir⁹. Benzer şekilde, aynı birey içinde farklı boyutlarda gözler üretmek için kimyasal işlemlerle inkübe edilen larva killifish’te, tektumun daha fazla innervasyona sahip tarafı daha büyüktü ve daha fazla nöron içeriyordu¹⁰. Yetişkin akvaryum balıklarında optik sinir ezme deneylerinden elde edilen kanıtlar, innervasyonun proliferasyonu desteklediğini, innervasyon bozulduğunda tektal hücre proliferasyonunun azaldığını göstermektedir¹¹.

Bu klasik çalışmaları doğrulayan ve genişleten birkaç yeni rapor, innervasyona yanıt olarak proliferasyonun, en azından kısmen, BDNF-TrkB yolu^12,13 tarafından modüle edildiğini gösteren veriler sunmaktadır. Gelişmekte olan bir duyusal sistemin yaralanma ve akson dejenerasyonu ile nasıl başa çıktığı, hangi hücresel ve moleküler sinyallerin retina girişinin optik tektum büyümesini düzenlemesini sağladığı, bu mekanizmaların ne zaman aktif hale geldiği ve innervasyona bağlı proliferasyon ve farklılaşmanın retina ve hedef dokusunun büyüme oranlarını koordine etmesini ve doğru retinotopik haritalamayı sağlamasını sağlayıp sağlamadığı da dahil olmak üzere optik tektum büyümesi ve gelişimi hakkında birçok açık soru devam etmektedir. Ek olarak, zebra balığı görsel sistemini aşağıda tarif edilenler gibi cerrahi yaklaşımlarla sorgulayarak ele alınabilecek aktiviteye bağlı gelişim hakkında çok daha büyük sorular vardır.

Nöral aktivitenin, özellikle görsel girdiden, hücre sağkalımını ve proliferasyonunu değiştirdiği hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için, tarif edilen yaklaşım, bireysel zebra balığı larvaları içindeki innerve ve denervated tektal lobları (Şekil 1) doğrudan karşılaştırmaktadır. Bu yöntem, optik tektumdaki RGC akson dejenerasyonunun belgelenmesine ve mitotik hücrelerin sayısının innervasyon ile ilişkili olduğunun doğrulanmasına izin verir.

Şekil 1: Zebra balığı larvalarının tek taraflı göz çıkarılmasından önce ve sonra çizikleri . (A) Diseksiyon mikroskobu altında görüldüğü gibi 5 dpf larvasının çizimi. Her larva, düşük erime noktalı agaroza gömülür ve gözü yukarı bakacak şekilde çıkarmak için keskin, kancalı bir ucu olan bir tungsten iğnesi kullanılmadan önce yanal olarak yönlendirilir (bu örnekte sol göz). (B) A’da tasvir edilen ameliyattan kaynaklanan 9 dpf larvanın dorsal görünümünün çizilmesi. Sağ gözden sadece üç yüksek şematize RGC aksonunun defasciculating olduğu ve sol tektal lobdaki nöronlarla bağlandığı gösterilmiştir. Kısaltmalar: dpf = döllenmeden sonraki günler; dps = ameliyat sonrası günler; RGC = retinal ganglion hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.