Изучение биомолекулярного взаимодействия между молекулярным шапероном Hsp90 и его клиентской протеинкиназой Cdc37 с использованием технологии полевого биозондирования

Биомолекулярные взаимодействия:
Белки являются неотъемлемой частью организмов и участвуют в многочисленных молекулярных путях, таких как клеточный метаболизм, клеточная структура, клеточная сигнализация, иммунные реакции, клеточная адгезия и многое другое. В то время как некоторые белки выполняют свою функцию (функции) независимо, большинство белков взаимодействуют с другими белками, используя связующий интерфейс для координации надлежащей биологической активности¹.

Биомолекулярные взаимодействия могут быть в основном классифицированы на основе различных структурных и функциональных характеристик вовлеченных белков², например, на основе белковых поверхностей, комплексной стабильности или персистенции взаимодействий³. Идентификация основных белков и их роли в биомолекулярных взаимодействиях имеет жизненно важное значение для понимания биохимических механизмов на молекулярном уровне⁴. В настоящее время существуют различные подходы к обнаружению этих взаимодействий⁵: in vitro⁶, in silico⁷, в живых клетках⁸, ex vivo⁹ и in vivo¹⁰, причем каждый из них имеет свои сильные и слабые стороны.

Анализы in vivo выполняются с использованием всего животного в качестве экспериментального инструмента¹¹, а анализыt he ex vivo выполняются на экстрактах тканей или целых органов (например, сердце, мозг, печень) в контролируемой внешней среде, обеспечивая минимальные изменения в естественных условиях. Наиболее распространенным применением исследований in vivo и ex vivo является оценка фармакокинетики, фармакодинамики и токсичности потенциальных фармакологических агентов до испытаний на людях путем обеспечения их общей безопасности и эффективности¹².

Биомолекулярные взаимодействия также могут быть обнаружены в живых клетках. Визуализация живых клеток позволяет нам наблюдать динамические взаимодействия, поскольку они выполняют реакции определенного биохимического пути¹³. Кроме того, методы обнаружения, такие как биолюминесценция или флуоресцентный резонансный перенос энергии, могут предоставить информацию о том, где и когда эти взаимодействия происходят в клетке¹⁴. Хотя обнаружение в живых клетках предлагает важные детали, эти методологии обнаружения основаны на оптике и метках, которые могут не отражать нативную биологию; они также менее контролируемы, чем методы in vitro , и требуют специализированных знаний для выполнения¹⁵.

Вычислительные методы in silico в основном используются для крупномасштабного скрининга молекул-мишеней перед экспериментами in vitro . Вычислительные методы прогнозирования, компьютерные базы данных, молекулярная стыковка, количественные отношения структура-активность и другие подходы к моделированию молекулярной динамики являются одними из хорошо зарекомендовавших себя инструментов in silico ¹⁶. По сравнению с трудоемкими экспериментальными методами, инструменты in silico могут легко делать прогнозы с высокой чувствительностью, но с пониженной точностью в прогностической производительности¹⁷.

Анализы in vitro проводятся с микроорганизмами или биологическими молекулами вне их стандартного биологического контекста. Изображение биомолекулярных взаимодействий с помощью методов in vitro имеет решающее значение для понимания функций белка и биологии, стоящей за сложной сетью функционирования клеток. Предпочтительная методология анализа выбирается в соответствии с внутренними свойствами белка, кинетическими значениями, а также режимом и интенсивностью взаимодействий^18,19.

Взаимодействие Hsp90/Cdc37:
Путь шаперон-киназы, соединяющий Hsp90 и Cdc37, является перспективной терапевтической мишенью в биологии опухоли²⁰. Hsp90 играет центральную роль в контроле клеточного цикла, сборке белка, выживании клеток и сигнальных путях. Белки, которые полагаются на Hsp90 для своих функций, доставляются в Hsp90 для комплексообразования через ко-шаперон, такой как Cdc37. Комплекс Hsp90/Cdc37 контролирует сворачивание большинства протеинкиназ и служит концентратором для множества внутриклеточных сигнальных сетей²¹. Это многообещающая противоопухолевая мишень из-за ее повышенной экспрессии при различных злокачественных новообразованиях, включая острый миелобластный лейкоз, множественную миелому и гепатоцеллюлярную карциному^22,23.

Широко используемые методы обнаружения биомолекулярного взаимодействия in vitro
Коиммунопреципитация (co-IP) представляет собой метод, основанный на специфичности антиген-антитело для идентификации биологически значимых взаимодействий²⁴. Основным недостатком этого метода является его неспособность обнаруживать низкоаффинные взаимодействия и кинетические значения²⁴. Биофизические методы, такие как изотермическая титрующая калориметрия (ITC), поверхностный плазмонный резонанс (SPR), биослойная интерферометрия (BLI) и технология FEB, являются предпочтительными для определения кинетических значений.

ITC представляет собой биофизический метод обнаружения, основанный на определении энергии связывания наряду с полным термодинамическим анализом для характеристики биомолекулярных взаимодействий²⁵. Основным преимуществом ITC является то, что он не требует какой-либо маркировки или фиксации целевого белка. Основными трудностями, с которыми сталкивается ITC, являются высокая концентрация целевого белка, необходимого для одного эксперимента, и сложность анализа нековалентных комплексов из-за небольших энтальпий^{связывания 26}. Как SPR, так и BLI являются биофизическими методами без меток, которые полагаются на иммобилизацию молекулы-мишени на поверхности датчика с последующими инъекциями аналита через иммобилизованную мишень^27,28. В SPR измеряются изменения показателя преломления при биомолекулярных взаимодействиях²⁷; в BLI интерференция в отраженном свете регистрируется в режиме реального времени как изменение длины волны в зависимости от времени²⁸. Как SPR, так и BLI имеют общие преимущества, заключающиеся в высокой специфичности, чувствительности и возможностях обнаружения²⁹. В обоих способах белок-мишень иммобилизуется на биосенсорных поверхностях, и, следовательно, может произойти некоторая потеря нативной конформации мишени, что затрудняет различие между конкретными и неспецифическими взаимодействиями³⁰. BLI использует дорогостоящие одноразовые волоконно-оптические биосенсоры для иммобилизации мишени и, следовательно, является дорогостоящим методом³¹. По сравнению с этими хорошо зарекомендовавшими себя инструментами биомолекулярного обнаружения, технология FEB предлагает надежную и свободную от этикеток платформу, используя низкие наномолярные концентрации для биомолекулярного обнаружения в режиме реального времени с кинетической характеристикой. Технология FEB также преодолевает проблемы, с которыми сталкивается ITC, и является более экономически эффективной по сравнению с SPR или BLI.

Биосенсоры на основе полевых транзисторов (FET) являются новой областью для обнаружения биомолекулярных взаимодействий, предлагая различные биомедицинские приложения. В системе FET мишени иммобилизуются в микросхемы биосенсора, а взаимодействия обнаруживаются изменениями проводимости³². Уникальной особенностью, которую следует учитывать при разработке эффективного электронного биосенсора, являются физико-химические свойства, такие как полупроводниковая природа и химическая стабильность материала покрытия, используемого для изготовления поверхности^{датчика 33}. Обычные материалы, такие как кремний, используемые для FET, ограничивают чувствительность датчиков, поскольку для правильного функционирования требуются оксидные слои, зажатые между транзисторным каналом и определенной средой³⁴. Кроме того, кремниевые транзисторы чувствительны к средам с высоким содержанием соли, что затрудняет измерение биологических взаимодействий в их естественной среде. Биосенсор на основе графена представлен в качестве альтернативы, поскольку он обеспечивает отличную химическую стабильность и электрическое поле. Поскольку графен представляет собой единый атомный слой углерода, он чрезвычайно чувствителен как полупроводник и химически совместим с биологическими растворами; оба эти качества желательны для генерации совместимых электронных биосенсоров³⁵. Замечательный сверхвысокий нагрузочный потенциал биомолекул, предлагаемых биосенсорами с графеновым покрытием, приводит к разработке технологии биосенсоров FEB на основе графена.

Принцип технологии FEB: FEB – это метод биомолекулярного обнаружения без меток, который измеряет электрический ток через графеновый биосенсор, к которому иммобилизуются связывающие мишени. Взаимодействия между иммобилизованным белком и анализируемым веществом приводят к изменениям тока, которые контролируются в режиме реального времени, что позволяет проводить точные кинетические измерения³⁶.

Контрольно-измерительные приборы: Система FEB содержит графеновый полевой транзистор (gFET) сенсорный чип и электронный считыватель, который подает постоянное напряжение на протяжении всего эксперимента (рисунок 1). Аналит наносят в растворе на целевой белок, иммобилизованный на поверхности биосенсора. Когда происходит взаимодействие, изменение тока измеряется и записывается в режиме реального времени. По мере увеличения концентрации анализируемого вещества доля связанного аналита также будет увеличиваться, вызывая более высокие чередования в токе. С помощью автоматизированного аналитического программного обеспечения, поставляемого с прибором (Таблица материалов), I-Response измеряется и регистрируется в единицах биозондирования (BU)³⁷. I-Response определяется как изменение тока (I) через чип биосенсора, измеренное в режиме реального времени при взаимодействии иммобилизованной мишени с анализируемым веществом. Программное обеспечение для автоматизированного анализа FEB может анализировать как I-Response, так и C-Response на события динамического взаимодействия, где C-Response регистрирует изменения емкости (C). Вариации как i-response, так и C-Response непосредственно соответствуют доле связанного аналита и могут быть дополнительно проанализированы для получения значений K_D . Программное обеспечение для автоматизированного анализа по умолчанию предпочитает I-Response.

Рисунок 1: Обзор экспериментальной установки. (A) Чип на основе графена и электронный считыватель. (B) Обзор компонентов микросхемы. Чип прикреплен к двум электродам, которые подают ток в систему. Поверхность чипа покрыта графеном, который при активации может связывать мишень. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Методология:
Первоначально активированный микросхема биосенсора вставляется в устройство FEB (рисунок 1) с последующим выполнением шагов, описанных ниже: (1) Калибровка: Эксперимент начинается с калибровки системы с использованием 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS; pH = 7,4) для создания базового ответа равновесия. (2) Ассоциация: Анализируемый элемент вводится в чип, и I-Response контролируется до тех пор, пока не будет достигнуто насыщение связывания. (3) Диссоциация: анализируемый материал диссоциируется с использованием 1x PBS. (4) Регенерация: Остатки анализируемого вещества удаляются с использованием 1x PBS. (5) Стирка: В общей сложности пять стирок выполняются с использованием 1x PBS для тщательного удаления связанных и несвязанных аналитов из чипа.

Анализ:
Анализ данных выполняется с использованием полностью автоматизированного программного обеспечения, поставляемого с прибором. Автоматизированное аналитическое программное обеспечение генерирует график Hill fit со значением K_D . График соответствия Хилла описывает связь анализируемого вещества с целевым белком в зависимости от концентраций анализируемого вещества. Концентрация, при которой достигается полумаксимальный отклик, пропорциональна значению K_D . Низкое значение K_D представляет собой высокое сродство связывания и наоборот.

Для проверки данных, полученных в ходе эксперимента FEB, I-Ответы извлекаются из каждой точки считывания для каждой концентрации анализируемого вещества с использованием программного обеспечения для анализа/экспорта данных и могут быть экспортированы в другое программное обеспечение для статистического анализа (см. Таблицу материалов), как описано ниже.