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Abstract
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Protocol
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Neurosciences

동시 광유전학적 변조 및 전기 신경 기록을 위한 광섬유 어레이

Published: September 01, 2022
doi:
10.3791/63460
, , , , , , ,
1Department of Electronic and Electrical Engineering,Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory,Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice,Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences,Ewha Womans University

Summary

여기에서는 광 전달을위한 광섬유와 신경 기록을위한 전극 어레이가있는 옵트로드 시스템의 제조 방법을 제시합니다. 채널로돕신-2를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 이용한 생체내 실험은 광유전학적 자극 및 전기생리학적 기록을 동시에 위한 시스템의 실현가능성을 보여준다.

Abstract

지난 십 년 동안, 광유전학은 선택적 신경 조절 또는 모니터링의 독특한 능력으로 인해 신경 신호 전달의 조사에 필수적인 도구가되었습니다. 특정 유형의 뉴런 세포가 옵신 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있기 때문에, 광유전학은 선택된 뉴런의 광학 자극 또는 억제를 가능하게 한다. 광유전학을 위한 광학 시스템에는 몇 가지 기술적 진보가 있었다. 최근에, 광전달을 위한 광학 도파관과 전기생리학적 기록을 결합하여 광유전학적 자극 또는 억제에 대한 신경 반응을 동시에 모니터링하는 것이 제안되었다. 이 연구에서, 이식형 옵트로드 어레이(2×2 광섬유)가 내장된 다채널 전극으로 개발되었다.

발광 다이오드(LED)를 광원으로 사용하였고, 광섬유의 팁에 충분한 광 전력을 제공하기 위해 미세제작된 마이크로렌즈 어레이가 집적되었다. 옵트로드 어레이 시스템은 일회용 부분과 재사용 가능한 부분을 포함한다. 일회용 부품에는 광섬유와 전극이 있으며 재사용 가능한 부분에는 광 제어 및 신경 신호 처리를위한 LED 및 전자 회로가 있습니다. 이식형 옵트로드 어레이 시스템의 신규한 설계는 옵트로피드 이식 수술, 광유전학적 광 자극, 및 전기생리학적 신경 기록의 절차 이외에 수반되는 비디오에 도입된다. 생체 내 실험의 결과는 마우스의 해마 흥분성 뉴런으로부터의 빛 자극에 의해 유발되는 시간 고정 신경 스파이크를 성공적으로 보여주었습니다.

Introduction

신경 활동을 기록하고 제어하는 것은 뇌가 신경망과 세포 수준에서 어떻게 기능하는지 이해하는 데 필수적입니다. 통상적인 전기생리학적 기록 방법은 마이크로피펫을 사용하는 패치 클램프 1,2,3,4 및 미세신경 전극(5,6,7,8)을 이용한 세포외 기록을 포함한다. 신경 조절 방법으로서, 전기 자극은 신경 세포의 직접 또는 간접적 탈분극을 통해 초점 뇌 영역을 직접 자극하기 위해 자주 사용되어 왔다. 그러나, 전기적 방법은 전류가 모든 방향으로 확산되기 때문에 기록 또는 자극을 위한 뉴런 세포 유형을 구별할 수 없다.

신흥 기술로서, 광유전학은 신경계가어떻게 작동하는지 이해하는 새로운 시대를 열었습니다 9,10,11,12,13,14,15,16. 광유전학 기술의 본질은 빛을 사용하여 유전자 변형 세포에 의해 발현되는 빛에 민감한 옵신 단백질의 활성을 조절하는 것이다. 따라서, 광유전학은 복잡한 신경 회로(14,17)에서 유전적으로 선택된 세포의 정교한 변조 또는 모니터링을 가능하게 한다. 광유전학적 접근법의 광범위한 사용은 광학 신경 조절을 직접 확인하기 위해 동시 신경 기록이 필요했다. 따라서 조명 제어 및 기록 기능을 갖춘 통합 장치는16,18,19,20,21,22,23,24,25 매우 유용합니다.

기존의 레이저 기반 광유전학적 자극에는 한계가 있으며, 이는 부피가 크고 고가의 광 전달 시스템(26,27,28,29,30)을 필요로 한다. 따라서, 일부 연구 그룹은 광 전달 시스템(31,32,33,34)의 크기를 최소화하기 위해 μLED 기반 실리콘 프로브를 사용했다. 그러나 LED의 낮은 에너지 변환 효율로 인해 μLED와의 직접 접촉으로 인한 열적 뇌 손상의 위험이 있습니다. 광섬유, SU-8 및 실리콘 산화 질화물 (SiON)과 같은 광 도파관은 열 손상 30,35,36,37,38,39를 피하기 위해 적용되었습니다. 그러나 이 전략은 광원과 도파관 간의 결합 효율이 낮기 때문에 단점도 있습니다.

마이크로렌즈 어레이는 LED와 광섬유(40) 사이의 광 결합 효율을 향상시키기 위해 이전에 도입되었다. 옵트로드 시스템은 마이크로스케일(40)에서 광학 자극 및 전기 기록을 위한 미세전자기계 시스템(MEMS) 기술에 기초하여 개발되었다. LED와 광섬유 사이의 마이크로렌즈 어레이는 광 효율을 3.13dB까지 높였습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 2×2 광섬유 어레이는 4×4 마이크로렌즈 어레이에 정렬되고 LED는 마이크로렌즈 어레이 아래에 위치합니다. 뇌 손상을 줄이기 위해 4×4 대신 2×2 광섬유가 장착됩니다. 텅스텐 전극 어레이는 전기 생리학적 기록을 위해 실리콘 비아홀을 사용하는 옵트로드 어레이에 인접하게 위치한다(그림 1B).

이 시스템은 상단 일회용 부품과 탈착식 하단 부품으로 구성됩니다. 광섬유 어레이, 마이크로 렌즈 어레이 및 텅스텐 전극 어레이를 포함하는 상단 일회용 부분은 생체 내 실험을 위해 뇌에 영구적으로 이식되도록 설계되었습니다. 하단 부분에는 LED 광원과 외부 전원 공급 장치 라인이 포함되어있어 쉽게 분리 할 수 있으며 다른 동물 실험에 재사용할 수 있습니다. 부착 가능한 플라스틱 커버는 탈착식 부품을 제거할 때 일회용 부품을 보호합니다.

시스템의 타당성은 Ca2+/calmodulin-의존성 단백질 키나제 II 양성 뉴런(CaMKIIα::ChR2 마우스)에서 채널로돕신-2(ChR2)를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 뇌에 이식함으로써 검증된다. 기록 전극은 뉴런의 광학 자극 동안 개별 뉴런으로부터의 신경 활동을 기록하기 위해 사용되었다.

Protocol

동물 관리 및 외과 수술은 이화여자대학교 기관동물보호이용위원회(IACUC)의 승인을 받았다(제20-029호). 1. 옵트로드 어레이의 제조(도 1 및 도 2) 마이크로렌즈 어레이로 광섬유를 부착합니다. 광섬유의 패시베이션 코팅을 제거하고 정밀 광섬유 절단기를 사용하여 5mm 길이의 조각으…

Representative Results

옵트로드 시스템은 표적 뉴런을 활성화시키기에 충분한 광력을 제공하기 위해 성공적으로 제조된다. 텅스텐 전극의 미세 정렬은 구멍을 통해 미세 제작 된 실리콘을 통해 달성됩니다. 측정된 광도는 50mA 전류가 인가될 때 광섬유 팁에서 3.6mW/mm2 입니다. 마이크로 렌즈는 광 효율을 3.13dB까지 높였습니다. 광 커플링을 향상시키는 마이크로렌즈 어레이로 인해, 인가된 전류는 마이크로렌즈 ?…

Discussion

광유전학적 자극 및 전기생리학적 기록의 동시 구축을 위한 시스템의 타당성이 검증되었다(도 6). 광 자극 동안 큰 스파이크는 광 자극과 동시에 발생하는 광전 아티팩트입니다 (그림 6A). 이것은 빨간색 점선 사각형의 파형을 확대 한 뷰에서 분명합니다 (그림 6A). 도 6A에 도시된 바와 같이, 광전기 아티팩트?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

본 연구는 한국과학기술정보통신부(NRF-2019M3C1B8090805)가 후원하는 한국연구재단(NRF-2019M3C1B8090805)을 통한 인간증강을 위한 융합기술 R&D 프로그램의 지원을 받았으며, 한국연구재단(MSIT)이 후원하는 한국연구재단(NRF) 보조금(제2019R1A2C1088909호)의 지원을 받았다. 형질전환 생쥐를 친절하게 제공해주신 KAIST 한국생명과학부 이승희 연구실에 감사드립니다.

Materials

5-pin Connector NW3 HD127K 1.27 mm (.050") pitch
Bovie Fine Science Tools(F.S.T) 18010-00 High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition Software Intan Technologies, LLC USB Interface Board software Work with the RHD USB Interface Board
Dental Cement Lang Dental Manufacturing Company, Inc. 1223CLR Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator Arm Stoelting Co. 51904/51906 Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel Foam Cutanplast Standard (70*50*10 mm) Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage Preamplifier Intan Technologies, LLC #C3314 RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating Pad Stoelting Co. 53800R Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LED OSLON GB CS8PM1.13 λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLAB MathWorks, Inc. R2019a
Micro Clamp SURGIWAY 12-1002-04 Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical Fiber Thorlabs, Inc. FT200UMT 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 – 1200 nm
PFA-Coated Tungsten Wire A-M System Custom ordered Rod type, Ø 101.6 μm (.004")
Photodiode Thorlabs S121C
power meter Thorlabs Inc. PM100D
Precision cleaver FITEL S326 Fiber slicer tool
Prism GraphPad 5.01 version
Scalpel Feather™ #20 Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screw Nasa Korea stainless steel diameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver Wire The Nilaco Corporation AG-401265 Ø 200 µm
Stereotaxic Fxrame Stoelting Co. 51500D Digital new standard stereotaxic, rat and mouse
suture ETHICON W9106 suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
Vaseline Unilever PLC Original 100% pure petroleum jelly
Wave_Clus N/A N/A https://github.com/csn-le/wave_clus
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Citer Cet Article
Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., Cho, Y. K., Ji, C., Kim, Y., Jun, S. B. Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording. J. Vis. Exp. (187), e63460, doi:10.3791/63460 (2022).
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