JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environnement

환경 오염을 해결하기위한 Extremophilic 미생물의 생물 탐사

Published: December 30, 2021
doi:
10.3791/63453
, , , , ,
1Department of Biology,University of Naples Federico II, 2Institute of Polymers, Composites and Biomaterials (IPCB),Consiglio Nazionale delle Ricerche CNR, 3Division of Biological Systems and Engineering,Lawrence Berkeley National Laboratory, 4BAT Center-Interuniversity Center for Studies on Bioinspired Agro-Environmental Technology,University of Napoli Federico II

Summary

지열 온천에서 중금속 내성 미생물을 분리하는 것은 생물 정화 및 환경 모니터링 바이오 시스템 개발을위한 뜨거운 주제입니다. 이 연구는 온천에서 중금속 내성 박테리아를 분리하고 식별하기위한 방법 론적 접근법을 제공합니다.

Abstract

지열 온천은 깊은 대수층에서 일어나는 암석과 물 사이의 상호 작용으로 인해 다양한 금속 이온이 풍부합니다. 더욱이, pH와 온도의 계절성 변화로 인해, 원소 조성의 변동은 이러한 극한 환경 내에서 주기적으로 관찰되어 환경 미생물 군집에 영향을 미친다. 화산 열 통풍구에서 번성하는 극단 성 미생물은 환경에 존재하는 여러 금속 이온을 처리하기위한 저항 메커니즘을 개발하여 복잡한 금속 생화학 적 사이클에 참여합니다. 또한, 극단 동물과 그 제품은 시장에서 광범위한 발판을 마련했으며, 이는 특히 효소에 해당됩니다. 이러한 맥락에서, 그들의 특성화는 환경 모니터링 및 생물 개선을위한 바이오 시스템 및 바이오 프로세스의 개발에 기능적입니다. 현재까지, 극단성 미생물의 실험실 조건에서의 분리 및 재배는 여전히 그들의 생명 공학 잠재력을 완전히 활용하기위한 병목 현상을 나타냅니다. 이 연구는 온천에서 고온성 미생물을 분리하고 다음 단계를 통해 유전 형 및 표현형을 식별하기위한 간소화 된 프로토콜을 설명합니다 : (1) 지열 사이트 ( “Pisciarelli”, 이탈리아 나폴리의 Campi Flegrei의 화산 지역)에서 미생물 샘플링; (2) 중금속 내성 미생물의 분리; (3) 미생물 분리물의 확인; (4) 단리물의 표현형 특성화. 이 연구에서 설명 된 방법론은 일반적으로 다른 극한 환경으로부터 미생물을 격리하는 데에도 적용될 수 있습니다.

Introduction

지구상의 극한 환경은 가혹한 조건 (즉, 온도, pH, 염분, 압력 및 중금속)1,2을 견딜 수있는 미생물의 훌륭한 원천이며, 아이슬란드, 이탈리아, 미국, 뉴질랜드, 일본, 중앙 아프리카 및 인도, 가장 잘 인정되고 연구 된 화산 지역 3,4,5,6,7,8,9 . 열병은 45°C에서 80°C까지의 온도 범위에서 열악한 환경에서 진화해 왔습니다10,11,12. 고세균 또는 박테리아 왕국에 속하는 고온성 미생물은 생물 다양성, 계통 발생 및 산업 응용을위한 독점적 인 생체 분자 생산 연구를위한 저수지입니다 13,14,15,16. 실제로, 지난 수십 년 동안, 세계 시장에서의 지속적인 산업 수요는 여러 생명 공학 분야 17,18,19에서 다양한 응용 분야를 위해 극단 성애자 및 열접합체의 착취를 장려했습니다.

유기체가 컨소시엄에 살고있는 온천은 생물 다양성의 풍부한 원천이므로 미생물 생태학20,21을 연구하는 매력적인 서식지를 나타냅니다. 더욱이, 이러한 화산 금속이 풍부한 지역은 일반적으로 중금속(22,23)의 존재에 생존하고 적응하기 위해 관용 시스템을 진화시킨 미생물에 의해 식민지화되어 생지화학적 순환에 적극적으로 관여한다. 요즘 중금속은 인간과 환경에 우선 오염 물질로 간주됩니다. 중금속 내성 미생물은 금속을 변형시키고 생태계를 리모델링함으로써 금속을 가용화하고 침전시킬 수 있습니다24,25. 중금속 저항의 분자 메커니즘에 대한 이해는 새로운 녹색 접근법26,27,28을 개발하는 것이 시급한 주제입니다. 이러한 맥락에서, 새로운 내성 박테리아의 발견은 환경 생물 개선을위한 새로운 전략을 개발하기위한 출발점을 나타냅니다24,29. 미생물 실험을 통해 수열 환경을 탐구하고 중금속 내성을 뒷받침하는 유전자의 역할에 대한 지식을 높이려는 노력과 함께 이탈리아의 캄피 플레 그리 (Campi Flegrei)의 온천 지역에서 미생물 스크리닝이 수행되었습니다. 이러한 중금속이 풍부한 환경은 강력한 수열 활동, 푸마롤 및 끓는 풀을 나타내며, 계절성, 강우량 및 지하 지질 운동에 의존하여 pH 및 온도가 가변적입니다30. 이러한 관점에서, 우리는 중금속에 내성을 가진 박테리아를 분리하는 적용하기 쉽고 효과적인 방법, 예를 들어 Geobacillus stearothermophilus GF1631 (분리 1로 명명) 및 Alicyclobacillus mali FL1832 (분리 2로 명명)를 Campi Flegrei의 Pisciarelli 영역에서 설명합니다.

Protocol

1. 지열 부위의 미생물 샘플링 원하는 온도와 pH를 가진 기준 장소로 사용하여 샘플링 할 부위를 선택하십시오. 디지털 써모커플 프로브를 통해 물리적 파라미터를 측정하여 선택한 풀이나 진흙에 삽입합니다. 토양 샘플 20g (이 경우 Pisciarelli Solfatara의 수열 부위의 진흙에서)을 수집하여 멸균 된 숟가락으로 채취하십시오. 선택한 각 사이트에 대해 적어도 두 개의 샘플을…

Representative Results

샘플링 사이트이 프로토콜은 온천으로부터 중금속 내성 박테리아를 분리하는 방법을 예시한다. 이 연구에서, 산-황화 지열 환경인 피시아렐리 지역을 샘플링 부위로 사용하였다(도 1). 이 생태계는 화산 활동에서 파생 된 공격적인 유황 유체의 흐름을 특징으로합니다. 산 황화 지열 시스템의 미생물 군집이 고농도의 중금속의 존재에 의해 만들어…

Discussion

온천은 똑같이 다양한 대사 능력을 가진 미개척 미생물의 다양성을 함유한다12. 중금속을 덜 독성이 적은 화합물(10 )로 효율적으로 전환시킬 수 있는 미생물의 격리를 위한 전략의 개발은 전 세계적으로 관심이 높아지고 있는 연구 분야이다. 이 논문은 독성 화학 물질에 저항 할 수있는 능력을 갖춘 미생물의 선별 및 분리를위한 간소화 된 접근 방식을 설명하는…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 ERA-NET Cofund MarTERA: “FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing”, PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 및 GoodbyWaste: Obtain GOOD제품-익스플로잇 BY-product-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italy의 지원을 받았습니다. 지열 사이트의 식별 및 특성화에 대해 Monica Piochi 박사와 Angela Mormone 박사 (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italy)에게 감사드립니다.

Materials

Ampicillin Sigma Aldrich A9393
Aura Mini bio air s.c.r.l. Biological hood
Bacitracin Sigma Aldrich B0125
Cadmium chloride Sigma Aldrich 202908
Chloramphenicol Sigma Aldrich C0378
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850
Cobalt chloride Sigma Aldrich C8661
Copper chloride Sigma Aldrich 224332
Erythromycin Sigma Aldrich E5389
Exernal Service DSMZ Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit Thermo Scientific #K0721
Kanamycin sulphate Sigma Aldrich 60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000
Mercury chloride Sigma Aldrich 215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific
Nickel chloride Sigma Aldrich 654507
Orion Star A221 Portable pH Meter Thermo Scientific STARA2218
Sodium (meta) arsenite Sigma Aldrich S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate Sigma Aldrich A6756
Sodium chloride Sigma Aldrich S5886
Streptomycin Sigma Aldrich S6501
Tetracycline Sigma Aldrich 87128
Tryptone BioChemica Applichem Panreac A1553
Vancomycin Sigma Aldrich PHR1732
Yeast extract for molecular biology Applichem Panreac  A3732
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
  2. Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
  3. Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
  4. Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
  5. Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
  6. Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
  7. Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
  8. Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
  9. Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
  10. Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
  11. Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
  12. Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , (2013).
  13. Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
  14. Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
  15. Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
  16. Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochimie. 50 (31), 6607-6621 (2011).
  17. Bhattacharya, A., Gupta, A. G. . Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , 161-176 (2022).
  18. Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
  19. Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
  20. Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
  21. He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
  22. Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma’in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
  23. Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
  24. Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
  25. Hlihor, R. -. M., Apostol, L. -. C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , 289-315 (2017).
  26. Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
  27. Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
  28. Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
  29. Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
  30. Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
  31. Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
  32. Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
  33. Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
  34. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  35. Sievers, F., Higgins, D. G. Clustal Omega. Current Protocols in Bioinformatics. 2014, 1-16 (2014).
  36. Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
  37. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
  38. Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
  39. Hsu, H. -. C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
  40. Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
  41. Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
  42. Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).

Tags

BioprospectingExtremophilic MicroorganismsEnvironmental PollutionHeavy Metal ResistanceBiosensingBioremediationGeothermal SpringsLuria-Bertani MediumPHTemperatureGrowth ProfileBacterial Lysis Buffer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Gallo, G., Aulitto, M., Contursi, P., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Bioprospecting of Extremophilic Microorganisms to Address Environmental Pollution. J. Vis. Exp. (178), e63453, doi:10.3791/63453 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image