Sivrisinekler ve Meyve Sinekleri için İnsektisit Toksisitesini Ölçmek için Topikal Uygulama Biyotahlili
Summary
Sivrisineklerde ve meyve sineklerinde insektisit duyarlılığını ölçmek için topikal uygulama biyotestinin metodolojisini ve önemini açıklıyoruz. Sunulan tahlil yüksek verimlidir, böcek kütlesini kullanır – böylece konsantrasyon yerine kütle ile ilişkili ölümcül bir dozun hesaplanmasına izin verir – ve muhtemelen diğer benzer yöntemlerden daha düşük değişkenliğe sahiptir.
Abstract
İnsektisitlerin halk sağlığı ve tarım için kullanılmaya devam edilmesi, insektisit direncinin yaygınlaşmasına ve kontrol yöntemlerinin engellenmesine yol açmıştır. Sivrisinek popülasyonlarının insektisit direnci sürveyansı tipik olarak Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) şişe biyotahlilleri veya Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tüp testleri yoluyla yapılır. Bununla birlikte, bu yöntemler, böcekle değişken insektisit teması, test edilen nispeten az sayıda organizma, popülasyonlar arasındaki kütlede geniş çaplı varyasyon ve sürekli değişen çevresel koşullar nedeniyle mortalite verilerinde yüksek derecede değişkenliğe neden olabilir ve değişken sonuçlara yol açabilir. Bu yazıda, bir dizi insektisit konsantrasyonu boyunca çok sayıda böceği test etmek için hem sivrisinekler hem de meyve sinekleri için yüksek verimli bir fenotipik biyotahlil olarak uyarlanmış topikal uygulama biyotahlili sunulmaktadır.
Bu tahlil 1) her organizma ile tutarlı tedavi ve insektisit teması sağlar, 2) suşlar ve cinsiyetler arasındaki ortalama kütledeki farklılıkları hesaba katan oldukça spesifik doz-yanıt eğrileri üretir (özellikle sahada toplanan organizmalar için önemlidir) ve 3) istatistiksel olarak titiz medyan ölümcül dozların hesaplanmasına izin verir (LD50 ), direnç oranı karşılaştırmaları için gerekli olan – larvikid direnci sürveyansı için de kullanılan tanısal doz mortalitesinden alternatif bir sürveyans yaklaşımı. Bu tahlil, sivrisinek popülasyonlarını doğru bir şekilde fenotiplemek için tamamlayıcı bir araç olacaktır ve meyve sinekleri kullanılarak gösterildiği gibi, diğer böceklerle kullanım için kolayca uyarlanabilir. Bu tahlilin, çoklu böcek türlerinde genotipik ve fenotipik insektisit direnci arasındaki boşluğu doldurmaya yardımcı olacağını savunuyoruz.
Introduction
Sivrisinekler, insanlara bulaştırdıkları hastalıklar nedeniyle her yıl 700.000’den fazla ölümden sorumludur ve bu ölümlerin yarısından fazlası yalnızca sıtmaya bağlıdır1. Sıtma ve diğer vektör kaynaklı hastalıkların bulaşmasına karşı ana önleyici yöntem, genellikle uzun ömürlü insektisit ağları veya iç mekanda artık püskürtme şeklinde insektisitlerin kullanılmasıdır2. Bununla birlikte, böcek ilacı direnci sivrisinekler ve diğer böcek vektörleri ile tarımsal zararlılar arasında yaygındır 3,4. Direnişi etkili bir şekilde yönetmek için, gözetim kilit öneme sahiptir5. Bunun için son derece doğru ve yüksek verimli direnç algılama yöntemlerine ihtiyaç vardır. Şu anda, sivrisinekler için en yaygın insektisit direnci gözetim araçları WHO tüp testi6 ve CDC şişe biyotahlili7’dir. Meyve sinekleri için artık temas uygulama yöntemi (CDC şişe biyotahliline benzer) yaygın olarak kullanılan bir insektisit biyotahlilidir 8,9,10. Bununla birlikte, bu yöntemlerden elde edilen verilerdeki değişkenlik tipik olarak yüksektir, aynı laboratuvar suşunun ölçümleri CDC şişe tahlillerinde ~% 20-70 mortalite ve sublethal dozlara maruz kaldığında DSÖ tüp testlerinde% 0-50 arasında değişmektedir11. Bu tür varyasyonlar şaşırtıcıdır, çünkü çoğu laboratuvar suşundaki sınırlı genetik varyasyonun, popülasyonda sınırlı insektisit duyarlılık varyasyonuna yol açması beklenmektedir. Bununla birlikte, biyotahlil sonuçlarında hala yüksek düzeyde bir varyasyon gözlenmektedir.
Bu varyasyonun potansiyel kaynakları, yüzey yoluyla dolaylı insektisit maruziyeti, heterojen çevresel etkiler, aynı genotipteki bireyler arasındaki normal biyolojik varyasyon ve aynı popülasyondaki örneklerin kütlesindeki varyasyon nedeniyle biyotahlildeki örnekler arasındaki heterojen insektisit maruziyetinin bir sonucuolabilir12 . Daha yüksek tekrarlanabilirliğe sahip nadir kullanılan bir yöntem, topikal uygulama biyotahlilidir. Bu tahlilde, insektisit doğrudan her bir böceğe13,14 uygulanır ve aynı tahlil içindeki farklı örneklerin heterojen maruziyet faktörünü ortadan kaldırır. Bununla birlikte, bu yöntemin yavaş verimli doğası nedeniyle, sivrisinek popülasyonları için rutin olarak bir insektisit duyarlılığı gözetim aracı olarak kullanılmamaktadır. Bu yazıda, topikal uygulama biyotahlili için, daha yüksek verimli maruziyetlere izin veren ve aynı zamanda böcek kütlesindeki varyasyonu düzelten, insektisit duyarlılığındaki değişikliklerle ilişkili bir parametre olan modifiye edilmiş bir protokol sunulmaktadır12. Değişken insektisit maruziyetinden kaynaklanan mortalite verilerinde gürültü ve kütle ile ilişkili varyasyonda bir azalma, daha doğru teknik direnç sürveyansı için izin verecektir11,15. Bu veriler, fenotipik direnci genetik belirteçler, uygunluk parametreleri ve / veya vektör yeterliliği ile daha doğru bir şekilde ilişkilendirmek için kullanılabilir. Ek olarak, daha küçük gövdeli bir böcek türü olan meyve sinekleri üzerindeki topikal uygulama biyotahlilini kullanarak bu tahlilin diğer böcek türlerine nasıl kolayca adapte edilebileceğini gösteriyoruz.
Yukarıda bahsedilen kalıntı temas uygulamalarının temel sınırlaması, insektisit maruziyetinin aynı tahlil içinde numuneden numuneye değişebilmesidir. CDC şişe biyotahlilleri ve temas yöntemi durumunda, insektisit maruziyeti aynı tahlilin replikaları arasında değişebilir. Böcekler, bir cam şişenin içine (CDC şişe biyotahlili ve temas yöntemi) veya emprenye edilmiş kağıtlara (WHO tüp testi) dağıtılan insektisitlere maruz kalır. Her iki yüzeydeki (cam ve kağıt) insektisit konsantrasyonu, bilinen genotiplerin farklı türlerinin taranmasıyla bilinir ve önceden belirlenir. Bununla birlikte, böcek tarafından potansiyel olarak emilebilecek miktar, kullanılan yüzeye, böcek ilacı karışımı bileşenlerine ve insektisitin yüzey malzemesi boyunca homojen bir şekilde nasıl dağıldığına bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir16,17. CDC şişe biyotahlilinde, şişenin içindeki insektisit kaplama, her laboratuvar ve kullanıcı tarafından kullanılan prosedürlere bağlıdır. DSÖ tüp testinde, insektisit ile muamele edilmiş kağıtlar merkezi olarak üretilir ve bu nedenle büyük olasılıkla laboratuvarlar arasında oldukça homojendir. Bununla birlikte, WHO tüp testinde, maruz kalma tüpü, örneklerin iniş inişine maruz kalmayan metal ağ üzerinde inmesine ve dinlenmesine izin verir, bu da her testteki örnekler arasında potansiyel heterojen insektisit maruziyetine yol açar. Her yöntemle örnekler tarafından toplanan ve emilen gerçek insektisit miktarının halaaraştırılması gerekiyor 18.
Ek olarak, CDC şişe biyotahlili, WHO tüp testi ve temas yöntemi en yaygın olarak önceden belirlenmiş bir insektisit konsantrasyonunu test eden eşik tahlilleri olarak kullanılır. Bu yaklaşım, direncin varlığını doğru bir şekilde tespit edebilir ve direnç gözetimi için değerlidir (özellikle direnç yayılırken). Bununla birlikte, eşik testleri direncin gücünü ölçemez, bu da müdahale araçlarının etkinliğinin daha öngörücü olabilir. Bu yöntemlerle çoklu insektisit konsantrasyonları kullanılıyorsa, yoğunluk tahlilleri olarak kullanılabilirler. CDC şişe biyotahlili ve WHO tüp testi için yoğunluk testleri, gözetim 6,19’daki bu boşluğu gidermek için önceden belirlenmiş ayırıcı dozajların 5x ve 10x’ini test ederek tanıtılmıştır. Dirençli popülasyonlar arasında ayrım yapmak için daha fazla yetenek sağlarken, 3-5 (önceden belirlenmiş) dozaj, ölümcül konsantrasyonları hesaplamak için sınırlı çözünürlük sağlar. Ek olarak, bu tür tahlillerde çeşitli boyutlarda sivrisinekler kullanılır. Bununla birlikte, kütlenin ölçülmesi önemlidir, çünkü daha büyük örneklerin öldürülmesi için daha yüksek bir doza ihtiyaç duyulabilir, çünkü kütle birimi başına etkili doz, daha küçük bir organizmanınkinden çok daha düşük olacaktır12. Kütle ile ilişkilendirilmiş ölümcül bir dozun (böcek kütlesi başına böcek ilacı miktarı) hesaplanması, böcek kütlesinin cinsiyetler, popülasyonlar ve genotipler arasındaki değişimini göz önünde bulundurduğu için daha yaygın ölümcül konsantrasyondan (örneğin, yüzey alanı başına böcek ilacı miktarı) daha yararlı bir metrik olacaktır. Bu tür veriler, laboratuvar ve sahadaki genotipik ve fenotipik direnç arasındaki boşluğu doldurmaya yardımcı olacak ve ayrıca bilinen ortalama kütleye sahip bir böcek popülasyonunu tedavi etmek için gerekli uygulama konsantrasyonunu hesaplamanın kolay bir yolunu sağlayabilir.
Örneklerin% 50’sini öldüren kütle göreli ölümcül dozajların kullanımı (LD50) ayrıca diğer birçok faydayı da içerir. Belirli bir bileşiğin mg / kg (= ng / mg) cinsinden toksisitesinin değerlendirilmesi insan ve veteriner toksikolojisinde standarttır14 ve LD50 değerleri malzeme güvenlik bilgi formlarında bulunur. Ölümcül dozajlar ayrıca, belirli bir türe yönelik farklı kimyasallar arasındaki toksisitenin doğrudan karşılaştırılmasına veya aynı kimyasalın farklı türlere doğru doğrudan karşılaştırılmasına izin verir20, ayrıca yeni böcek öldürücülerin ve kimyasalların yüksek kalitede değerlendirilmesine izin verir13. Ek olarak, LD50 , tanısal doz mortalite sonuçlarından elde edilenlerden daha anlamlı ve doğru direnç oranları sağlayabilir, bu da bir popülasyonda mevcut direnç seviyesinin abartılmasına neden olabilir. Bu nedenle, bu tahlil, diğer biyotahliller21 için önerilenden daha fazla örnekten elde edilen kütle-görecelileştirilmiş ölümcül dozlara dayanan daha titiz direnç izlemesi sağlayarak rutin sürveyans programları için uygun olacaktır.
Topikal uygulama yöntemi, direnç zaten bilindiğinde veya şüphelenildiğinde standart insektisit duyarlılık biyotahlillerine alternatif olarak sivrisinekler ve sinekler için insektisit duyarlılık sürveyansındakullanılmış 22,23, ayrıca bazı haşere böceklerinde sürveyans için24 direnç profillerini ve insektisit içsel toksisitesini daha doğru bir şekilde değerlendirmek için 21 . Topikal uygulama biyotahlillerinde, insektisit her organizmaya uygulanır ve insektisit maruziyetinde minimum varyasyona neden olur. Bu yazıda, böcek öldürücü maruziyetinin kısa sürede çok sayıda böceğe uygulanmasına izin veren ve aynı zamanda böcek kütlesini kontrol eden biraz uyarlanmış ve geliştirilmiş bir yöntem sunulmaktadır22. İyi düzeyde tekrarlanabilirliğe sahip bu yüksek verimli yöntem, rutin insektisit duyarlılığı gözetimi için yararlı bir ek araç olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda sivrisinekler ve meyve sinekleri için topikal uygulama testi için uyarlanmış bir protokol sunulmaktadır. Bu prosedür, minimum özel ekipman gerektirdiğinden, sahada ve diğer organizmalarla kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilir. Aşağıda bu protokolün kritik adımları, potansiyel değişiklikleri, sorun giderme önerileri, yöntemin sınırlamaları ve bu yöntemin önemi ele alınmıştır.
Protokoldeki kritik adımlar: Protokolde, yanlış tamamlanırsa, biyotahlilin sonuçlarını büyük ölçüde etkileyebilecek üç kritik adım vardır: insektisit konsantrasyon doğruluğu, numune nakavtı ve mortalite değerlendirmesi.
İnsektisit konsantrasyonu doğruluğu:
Tekrarlanabilir doz-yanıt eğrileri ve anlamlı sonuçlar elde etmek için doğru insektisit çözeltilerine sahip olmak son derece önemlidir. İnsektisit çözeltisi hazırlamaya hacimsel yaklaşım, hem CDC şişe biyotahlili7 hem de topikal uygulamalar13,14,43 için literatürde daha yaygındır. Bununla birlikte, burada açıklanan gravimetrik yaklaşım, (sıcaklığa özgü) yoğunluğun dahil edilmesi yoluyla sıcaklığın dikkate alınması nedeniyle doğal olarak daha doğrudur ve bu da daha doğru formülasyon hazırlığına yol açar.
Örnek nakavt:
Numunelerin yıkılması, bu yöntemin kritik bir bileşenidir ve insektisit ve ağırlık ölçümlerinin doğru bir şekilde uygulanmasını sağlar. Bununla birlikte, organizmaları devirmek kaçınılmaz olarak, daha önce gösterildiği gibi fiziksel stres ve hasar riski içerir30. Bu nedenle, i) her numunenin benzer bir süre boyunca devrilmesini, ii) nakavt süresinin minimumda tutulmasını ve iii) nakavt yönteminin tüm numuneler arasında tutarlı olmasını sağlamak için numuneleri devirirken dikkatli ve dikkatli olun. Ek olarak, yöntemin başarılı olduğundan ve% 10’dan fazla kontrol mortalitesine neden olmadığından emin olmak için insektisit uygulamasından önce knockdown yönteminin ayrı ayrı test edilmesi önerilir. İlk test deneyimsiz bir kullanıcı için daha uzun sürebilir ve bu da daha uzun nakavt sürelerine yol açabilir. Bu nedenle, ilk tahlillerden elde edilen sonuçları yorumlarken dikkatli olun.
Mortalite değerlendirmesi:
Ölüm oranını değerlendirmek, özellikle insektisit tamamen öldürmediğinde, ancak sadece sivrisinek veya sineği devirdiğinde veya sakat bıraktığında zor olabilir. Bu nedenle, insektisitin hedef organizmayı nasıl etkilediğinin farkında olmak ve başlamadan önce “ölü” (veya yıkılmış) organizmalar için net bir tanıma sahip olmak önemlidir. Ek olarak, varyasyonu azaltmak için aynı kişinin dozlar ve replikasyonlar arasındaki mortaliteyi değerlendirmesi önerilir.
Protokol değişiklikleri: Çok yönlülüğünü ve erişilebilirliğini artırmak için bu protokole aşağıda açıklanan çeşitli değişiklikler uygulanabilir.
Tahlilin daha küçük veya daha büyük boyutlu böceklere uyarlanması:
Daha küçük veya daha büyük örnekler kullanıldığında, sırasıyla daha küçük veya daha büyük bir doz insektisit hacminin uygulanması tavsiye edilir. Örnek olarak, 0.5 μL dozunu 0.2 μL’lik bir doza düşürerek sivrisinek protokolünü meyve sineklerine uyarladık. Seçilen doz hacmi için doğru şırınga boyutunun seçildiğinden emin olun.
Tahlilin tarla böceklerine uyarlanması:
Tarla böcekleri kullanırken, böcek boyutunda daha fazla değişiklik olabilir. Bu nedenle, böceklerin büyük bir grup yerine daha küçük gruplar halinde (örneğin, fincan başına) tartılması önerilir (örneğin, bir deney için kullanılan tüm böcekler). Bu, tarla böcek kütlesindeki farklılıklarla ilişkili insektisit duyarlılığındaki potansiyel varyasyonun yakalanmasına yardımcı olabilir.
Ekipman modifikasyonları:
Böcek taşıma çadırı: Numunenin dozlanması, PVC boru ve cibinlik ile basitçe inşa edilmiş bir böcek taşıma çadırı altında tamamlanabilir. Bu, kapalı bir odaya (örneğin, böcek) bir alternatif olabilir ve böcek yetiştiriciliğinin meydana gelebileceği alanlarda potansiyel böcek ilacı kontaminasyonunu ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir. Bu böcek taşıma çadırının yapımı kolaydır ve düşük maliyetlidir (~ 70 $). Alternatif olarak, bir böcek taşıma kafesi satın alınabilir (~ 425 $).
Soğuk masa: Buz paketleri veya buz tepsileri, numuneyi devirmek ve / veya numuneyi devirmek için kullanılabilir.
İnkübatör: İnkübatörler, inhibisit tedavisinden sonra numunenin yetiştirilmesi ve numunenin 24 saat tutulması için önerilir. Bir inkübatör mevcut değilse, inşa edilebilir. İnkübatörü inşa etmek için gereken ekipman, yalıtımlı bir kap, nemlendirici, ısı kabloları, nem ve sıcaklık kontrolörü ve önceki yöntemleri takip ederek ve genişleterek toplam maliyeti ~ 170 $ ‘a kadar çıkarması gereken bir ışık içerir44.
Tutma bardakları: İşlem görmüş numuneyi sıralamak ve tutmak için plastik bardaklar kullanılsa da, balmumu kaplı kağıt bardaklar veya cam kaplar uygun alternatifler olacaktır.
Organizma ve yaşam evresi modifikasyonu:
Bu yöntem, Culex quinquefasciatus sivrisinekleri 32, ev sinekleri32 ve hamamböceği45 gibi diğer vektörler, böcekler ve / veya eklembacaklılar ile ve ayrıca sivrisinek larvaları46 gibi yetişkin olmayan yaşam aşamaları ile kullanım için çok uyarlanabilir.
Topikal uygulama konumu değişikliği:
Bu yöntem, insektisitin sivrisinekler için ventral toraks ve karın bölgesine (ve meyve sinekleri için dorsum) uygulanmasını açıklar. Ancak, maruz kalma sitesi tutarlı olduğu sürece diğer uygulama konumları kullanılabilir. Tutarlılık önemlidir, çünkü insektisit duyarlılığı uygulama konumuna bağlı olarak değişebilir32.
Sorun giderme önerileri: Bu yöntemin başlangıçta zorlayıcı olan birkaç adımı vardır. Aşağıda, karşılaşılabilecek en yaygın sorunlardan bazıları açıklanmaktadır.
Sızdıran / buharlaşan insektisit çözeltileri:
İnsektisitler genellikle oldukça uçucu bir bileşik olan aseton içinde çözülür. Bu, asetonun oda sıcaklığında hızla buharlaştığı ve zamanla insektisit konsantrasyonlarını arttırdığı anlamına gelir. İnsektisit çözeltileri sızıntı yapıyor veya buharlaşıyor gibi görünüyorsa, çözeltileri yeniden yapın, tüpün kapağının sıkıca açık olduğundan emin olun ve depolama protokollerinin uygun şekilde takip edilip edilmediğini iki kez kontrol edin (örneğin, parafilm kullanılıyor ve tüpler dik olarak saklanıyor). Sızıntı devam ederse, asetonun farklı sıcaklıklarda yaşadığı hacim değişikliği için daha fazla alana izin vermek için tüpleri daha düşük bir hacimle doldurmayı deneyin. Ek olarak, çözücü olarak aseton kullanılıyorsa, tüplerin aseton depolama için derecelendirildiğinden emin olun (örneğin, FEP, TFE ve PFA plastikleri). Hidrofobik böcek öldürücüler kullanıyorsanız, çözeltileri cam şişelerde saklayın (hidrofobik böcek öldürücüler cama plastikten daha az yapıştığından). Buharlaşmayı izlemek için depolamadan önce çözeltinin menisküsünü işaretlemek de iyi bir uygulamadır.
Organizmaları tartarken mikro terazide sürüklenen ağırlık:
Ölçekteki ağırlık okuması sürükleniyorsa (yavaşça yukarı veya aşağı gidiyorsa), bunun nedeni statik olabilir. Sürüklenme en sık plastik eşyalardaki organizmaları tararken meydana gelir, çünkü plastik statik bir yükü kolayca tutabilir. Bunu önlemek için, tartılan plastik kabın altına bir tartım kağıdı yerleştirilebilir veya cam gibi plastik olmayan bir kap kullanılabilir.
Anormal mortalite sonuçları:
Mortalite sonuçlarının anormal görünebileceği, kontrollerde yüksek mortalite veya tüm insektisit dozlarında yüksek / düşük mortalite gözlemlemek gibi birçok yol vardır. Her senaryoda sorun gidermek için aşağıdaki örnekleri gözden geçirin.
Yüksek kontrollü mortalite
Kontrol grubunda yüksek mortalite varsa (% 10 veya daha fazla), nakavt yöntemini ve örneklerin nakavt edilme süresini değerlendirin. Mümkünse, örneklerin devrildiği süreyi kısaltın. Kontrollerde yüksek mortalite için göz önünde bulundurulması gereken diğer potansiyel faktörler arasında i) inkübatör ayarlarının doğru olup olmadığının kontrol edilmesi – anormal sıcaklıklar ve / veya nem mortalitenin artmasına neden olabilir. Sıcaklık ve nem bağımsız bir datalogger ile kontrol edilmelidir. ii) Böcek kullanımının değerlendirilmesi. Böcekleri çok fazla veya çok kabaca ele almak, yüksek ölüm oranına yol açabilir. iii) Kontrol grubunu tedavi etmek için kullanılan %100 asetonda veya enstrümantasyonda insektisit kontaminasyonu olup olmadığını kontrol etmek. Asetonu değiştirin ve tüm aletleri aseton veya etanol ile temizleyin. Eldivenleri sık sık değiştirerek, dökülmeyi önleyerek ve aletleri temizleyerek kontaminasyonu önleyin. Ek Dosya 3’te, kontrol (yalnızca aseton) bardaklarında en fazla iki sivrisineğin öldüğünü unutmayın. Bu mortalite seviyesi yüksek olarak kabul edilmez (% 10’dan azdır) ve bu nedenle endişe için bir neden yoktur.
Maruz kalan tüm gruplarda yüksek mortalite (ancak kontrol gruplarında değil)
Test için daha düşük insektisit konsantrasyonları veya daha küçük doz hacimleri kullanın. Kullanılan dozajlar, mortaliteye neden olmayacak minimum dozun üzerinde olabilir. Doğru doz aralığını belirlemek ve kontaminasyonu dışlamak için birkaç 10 kat seyreltme kullanın. Kontaminasyonu önlemek için, en düşük konsantrasyonda dozlamaya başlayın ve en yüksek konsantrasyona doğru çalışın. Ek olarak, kullanılan tüm ekipmanların düzenli olarak aseton ve/veya etanol ile temizlendiğinden, numuneye uygulanan dozların çok küçük olduğundan ve en ufak bir çapraz kontaminasyonun bile sonuçları etkileyebileceğinden emin olun.
Maruz kalan tüm gruplarda düşük mortalite
Daha yüksek insektisit konsantrasyonları kullanın. Kullanılan dozajların hepsi popülasyonda mortaliteye neden olamayacak kadar düşük olabilir. Doğru doz aralığını belirlemek için, numuneleri birkaç kat daha 10 kat konsantre dozlara maruz bırakın. İnsektisit çözeltilerinin süresinin dolmadığından veya bozulmadığından emin olun (potansiyel olarak yüksek sıcaklık veya ışığa maruz kalma nedeniyle). Çözümlerin süresi dolmuşsa veya bozulduğundan şüpheleniliyorsa, çözümleri yeniden oluşturun ve uygun depolama koşullarına uyulduğundan emin olun.
Replikasyonlar/günler arasındaki tutarsız mortalite
Böceklerin insektisitlere maruz kaldığı günün zamanı, özellikle metabolik direnç için ifade edilen direnç seviyesini etkileyebilir34. Mortalitedeki değişikliklere katkıda bulunan potansiyel bir değişken olarak günün saatinden kaçınmak için bu protokolü her gün aynı zaman penceresinde tekrarlayın. Replikalar arasındaki tutarsız mortaliteye katkıda bulunan diğer potansiyel faktörler arasında i) deneyler arasında farklı şekilde yetiştirilen örnekler bulunur. Tüm numunelerin aynı yaş aralığında olduğundan, aynı sıcaklıkta ve benzer yoğunluklarda ve gıda mevcudiyetinde yetiştirildiğinden emin olun. ii) aseton buharlaşması nedeniyle zamanla bozulan veya daha konsantre hale gelen insektisit konsantrasyonları. Çözümleri yeniden oluşturun ve uygun depolama koşullarını sağlayın. iii) Tutarsız mortalite puanlaması. Aynı kişinin ölüm oranını puanladığından emin olun veya ekip genelinde tutarlı bir şekilde kullanılacak net bir protokol geliştirin. Mortalite puanlamasında önyargıyı azaltmak için kör skorlamayı kullanın.
Sıralama tepsisinin yüzeyine yapışan böcekler:
Aseton Petri yemekleri gibi bu protokolde kullanılan plastiklere tepki verir. Petri kaplarında veya benzer plastik yüzeylerde aseton kullanılıyorsa, numune muhtemelen yüzeye yapışacaktır. Bu yapışma, ayıklama tepsisini tartım kağıdıyla kaplayarak veya plastik olmayan bir ayıklama tepsisi kullanarak önlenebilir. Ek olarak, ayırma tepsisindeki veya tutma kaplarındaki plastiğin yüzeyindeki yoğuşma, böceklerin yoğuşmaya yapışmasına neden olabilir veya numune çok soğuk olabilir ve potansiyel olarak yüzeye donabilir. Numunelerin çok soğuk/donmuş olmasını önlerken yoğuşmayı azaltmak için knockdown yöntemini ayarlayın (ör. numuneler ile plastik ayıklama tepsisi arasına tartım kağıdı yerleştirin).
R analizi hataları:
Mortalite verileri toplandıktan sonra, analiz sırasında çeşitli komplikasyonlar ortaya çıkabilir. Bir R kodunun veri dosyası için eylemleri tamamlayamamasının en yaygın nedeni, veri biçiminin kodla eşleşmemesidir (örneğin, sütun başlıkları ve/veya boş hücreler). Daha ciddi komplikasyonlar ortaya çıkarsa, Rstudio35’te yerleşik olarak bulunan R yardım sayfalarına bakın.
Yukarıda açıklanan topikal uygulama yönteminin sınırlamaları:
Topikal uygulama yöntemi ile insektisit emilimi doğal maruziyeti taklit etmez:
Birincil vücutta topikal uygulama, insektisit emiliminin doğal yolu değildir. Sahada, böcekler çoğunlukla insektisitleri, insektisitle muamele edilmiş yüzeyle temas halinde oldukları süre boyunca bacaklarından veya kanatlarında, ventral yüzeyde hızlı bir şekilde maruz kalmak yerine, küçük aerosol parçacıkları 47,48 yoluyla emer. Bununla birlikte, bilinen bir insektisit dozunun doğrudan uygulanması, genetik ve evrimsel çalışmalar veya uzay veya zaman boyunca insektisit duyarlılığının karşılaştırılması için gerekli olan insektisitlere fenotipik bir yanıtı doğru bir şekilde oluşturacaktır. Bu nedenle, bu yaklaşım teknik direnci test etmek için faydalıdır, ancak pratik direnci doğrudan ölçmez (gerçek müdahale aracının bir saha ayarındaki etkinliği15). Bununla birlikte, mevcut standart yöntemlerin (örneğin, DSÖ tüp testleri ve CDC şişe biyotahlilleri) de sahadaki aerosol insektisit maruziyetini (yani sisleme yoluyla) yakalayamayacağını veya taklit edemeyeceğini belirtmek önemlidir.
Topikal uygulama testleri sadece temas absorpsiyon insektisitlerini değerlendirebilir:
Bu yöntem, insektisitin teması ve emilimi yoluyla çalışan ve çekici toksik şeker yemlerinde yaygın olarak kullanılan borik asit gibi oral insektisitlerle kullanım için tasarlanmamıştır49.
Yöntemin önemi:
Topikal uygulama yöntemi, ölümcül dozu (konsantrasyon değil) hesaplayarak ve teknik (pratik olmayan) direnci ölçerek insektisit biyotahlilleri için iyi kurulmuş standartları genişletir15. Aşağıda verilmiştir, bu yöntemin mevcut insektisit duyarlılık testlerine göre avantajları ve dezavantajları verilmiştir.
Ölümcül doz hesaplaması:
Bu yöntem, CDC ve WHO biyotahlillerinin ayırıcı doz11’i oluşturmak için kullandığı ölümcül konsantrasyondan ziyade, insektisitin ölümcül dozunu belirler. Ölümcül doz daha anlamlıdır, çünkü mortaliteyi ortaya çıkardığı bilinen niceliklendirilmiş bir insektisit miktarıdır. Buna karşılık, ölümcül konsantrasyon, organizmanın gerçekte ne kadar böcek ilacı edindiğini dikkate almaz. Ölümcül doz hesaplamasını kullanırken, cinsiyete veya boyuta bağlı duyarlılık profilleri arasındaki farklar daha doğru bir şekilde gözlemlenebilir ve ölçülebilir, bu da bu ölçümü daha da çok yönlü hale getirir.
Teknik direnç:
Bu yöntem, standartlaştırılmış, kontrollü ortamlarda ölçülen direnç olan teknik direnci değerlendirir. Bu tür ölçümler, insektisit direncinin yayılmasının gözetimi ve fenotipik direncin potansiyel belirteçlerle ilişkilendirilmesi için uygundur15. Topikal uygulama biyotahlilinden kaynaklanan mortalitedeki azalmış varyasyon nedeniyle, yeni direnç belirteçlerinin daha iyi tanımlanmasını sağlar. Bununla birlikte, insektisitlerin sivrisineğe doğal olmayan bir şekilde maruz kalması nedeniyle, bu tahlil, belirli bir popülasyonda spesifik bir müdahalenin etkinliğinin tahmini için uygun değildir. Bu tür pratik direncin ölçümleri için başka tahlillere ihtiyaç vardır15.
Numune uyarlanabilirliği:
Bu yöntem, mahsul zararlıları (örneğin, Colorado Patates böceği), ev zararlıları (örneğin, hamamböceği ve yatak böcekleri) veya tozlayıcılar (örneğin, arılar) gibi diğer önemli eklembacaklılarda, nakavt yaklaşımında ve / veya böcek ilacı dozunda, hacminde ve / veya konsantrasyonunda (yukarıda açıklandığı gibi) basit değişikliklerle uygulanabilir. Uyarlanabilirlik kolaylığı, farklı araştırma alanlarında insektisit direnci araştırmalarını analojize etmeye yardımcı olabilir. Örneklerin% 50’sini öldüren ölümcül bir konsantrasyon yerine LD 50 değerinin kullanılması (LC50), türler arasında doğru karşılaştırmaya izin verir.
Masraf:
CDC şişe biyotahlillerine ve WHO tüp testlerine benzer şekilde, topikal uygulama tahlilini çalıştırma maliyetleri minimumdur ( Malzeme Tablosuna bakınız). Temel ekipman parçaları, tahliller arasında yeniden kullanılabilen şırınga (yaklaşık 70 $) ve dağıtıcıdır (yaklaşık 100 $).
Gerekli numune sayısı:
Topikal uygulama tahlil kabı başına en az 20-25 örnek kullanılmalıdır. Deney başına en az beş insektisit konsantrasyonunun test edilmesi önerilir, prosedür için en az üç kopya önerilir. Genel olarak, bu, WHO tüp testleri veya CDC şişe biyotahlilleri kullanarak direnç yoğunluğu testleri yapmak için gereken numune sayısıyla karşılaştırılabilir, tam bir test için gereken en az 300-375 numune ile sonuçlanır. Bununla birlikte, topikal uygulama biyotahlili ile azaltılmış değişkenlik elde edilirse, aynı sayıda örnek, uzay veya zaman boyunca duyarlılık verilerini karşılaştırmak için daha fazla istatistiksel güce yol açabilir.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Ulusal Bilim Vakfı tarafından SH’ye 2047572 ödül numarası altında verilen bir KARİYER ödülü ile desteklenmiştir. Damien Rivera’ya meyve sineği yetiştiriciliği ve topikal uygulama testine hazırlık konusundaki yardımları için, Wisconsin-Madison Üniversitesi’nden Dr. Ganetzky’ye Kanton-S meyve sineği suşunu paylaştığı için, Rockefeller suşunu paylaştığı için Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerine ve IICC izolin suşunu paylaştığı için Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı Tıbbi Tarım ve Veterinerlik Entomolojisi Merkezi’ne teşekkür ederiz. Şekil 1 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
| 1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
| 15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
| 20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
| 25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
| Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
| Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
| Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
| Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
| Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
| Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
| Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
| Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
| Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
| Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
| Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
| Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
| Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
| Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
| Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
| Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
| Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
| Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
| Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
| Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
| Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
| PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
| Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
| Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
| Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |
References
- World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , (2020).
- World Health Organization. Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors. World Health Organization. , (2012).
- Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60 (1), 537-559 (2015).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45 (1), 371-391 (2000).
- World Health Organization. Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquito populations. World Health Organization. , (2016).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes (Second edition). World Health Organization. , (2016).
- McAllister, J. C., Scott, M. CONUS manual for evaluating insecticide resistance in mosquitoes using the CDC bottle bioassay kit. Centers for Disease Control and Prevention. , (2020).
- Duneau, D., et al. Signatures of insecticide selection in the genome of Drosophila melanogaster. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3469-3480 (2018).
- Pittendrigh, B., Reenan, R., ffrench-Constant, R. H., Ganetzky, B. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Molecular & General Genetics: MGG. 256 (6), 602-610 (1997).
- Rinkevich, F. D., Du, Y., Dong, K. Diversity and convergence of sodium channel mutations involved in resistance to pyrethroids. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 93-100 (2013).
- Lissenden, N., et al. Review and meta-analysis of the evidence for choosing between specific pyrethroids for programmatic purposes. Insects. 12 (9), 826 (2021).
- Owusu, H. F., Chitnis, N., Müller, P. Insecticide susceptibility of Anopheles mosquitoes changes in response to variations in the larval environment. Scientific Reports. 7 (1), 3667 (2017).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e57768 (2019).
- Burgess, E. R., King, B. H., Geden, C. J. Oral and topical insecticide response bioassays and associated statistical analyses used commonly in veterinary and medical entomology. Journal of Insect Science. 20 (6), 1-9 (2020).
- Namias, A., Jobe, N. B., Paaijmans, K. P., Huijben, S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. eLife. 10 (1), 65655 (2021).
- Zhu, X., et al. Manipulating solid forms of contact insecticides for infectious disease prevention. Journal of the American Chemical Society. 141 (1), 16858-16864 (2019).
- Dang, K., Singham, G. V., Doggett, S. L., Lilly, D. G., Lee, C. Y. Effects of different surfaces and insecticide carriers on residual insecticide bioassays against bed bugs, Cimex spp. (Hemiptera: Cimicidae). Journal of Economic Entomology. 110 (2), 558-566 (2017).
- Spielmeyer, A., Schetelig, M. F., Etang, J. High-throughput analysis of insecticides on malaria vectors using liquid chromatography tandem mass spectrometry. PLoS ONE. 14 (2), 0211064 (2019).
- Bagi, J., et al. When a discriminating dose assay is not enough: measuring the intensity of insecticide resistance in malaria vectors. Malaria Journal. 14 (1), 210 (2015).
- Pridgeon, J. W., Becnel, J. J., Clark, G. G., Linthicum, K. J. Permethrin induces overexpression of multiple genes in Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 46 (3), 1-8 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications. World Health Organization. , (2009).
- Estep, A. S., et al. Quantification of permethrin resistance and kdr alleles in Florida strains of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (10), 0006544 (2018).
- Waits, C. M., et al. A comparative analysis of resistance testing methods in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) from St. Johns County, Florida. Florida Entomologist. 100 (3), 571-577 (2017).
- Kostromytska, O. S., Wu, S., Koppenhöfer, A. M. Diagnostic dose assays for the detection and monitoring of resistance in adults from Listronotus maculicollis (Coleoptera: Curculionidae) populations. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2329-2339 (2018).
- Aktar, W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Maïga, H., et al. Guidelines for routine colony maintenance of Aedes mosquito species. IAEA Physical and Chemical Sciences. , (2017).
- Gjullin, C. M., Hegarty, C. P., Bollen, W. B. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of aedes mosquito eggs. Journal of Cellular Physiology. 17 (2), 193-202 (1941).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420 (1), 27-44 (2008).
- Jass, A., Yerushalmi, G. Y., Davis, H. E., Donini, A., MacMillan, H. A. An impressive capacity for cold tolerance plasticity protects against ionoregulatory collapse in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 222 (1), 214056 (2019).
- Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., Vandenbrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5 (1), 15298 (2015).
- Jung, Y., Kennedy, A., Chiu, H., Mohammad, F., Claridge-Chang, A., Anderson, D. J. Neurons that function within an integrator to promote a persistent behavioral state in Drosophila. Neuron. 105 (2), 322-333 (2020).
- Aldridge, R. L., Kaufman, P. E., Bloomquist, J. R., Gezan, S. A., Linthicum, K. J. Impact of topical application site on the efficacy of permethrin and malathion to Culex quinquefasciatus. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (4), 300-307 (2016).
- Rinkevich, F. D., et al. Distinct roles of the DmNav and DSC1 channels in the action of DDT and pyrethroids. Neuro Toxicology. 47 (1), 99-106 (2015).
- Balmert, N. J., Rund, S. S. C., Ghazi, J. P., Zhou, P., Duffield, G. E. Time-of-day specific changes in metabolic detoxification and insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Journal of Insect Physiology. 64 (1), 30-39 (2014).
- R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. R Core Team. , (2021).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), 0146021 (2015).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3 (2), 302-303 (1987).
- Ravichandran, S. Data analysis through SAS with special emphasis on Probit analysis. National Academy of Agricultural Research Management (NAARM). , (2021).
- Smith, L. B., et al. CYP-mediated resistance and cross-resistance to pyrethroids and organophosphates in Aedes aegypti in the presence and absence of kdr. Pesticide Biochemistry and Physiology. 160 (1), 119-126 (2019).
- Finney, D. J. . Probit Analysis. , (1971).
- Silva, J. J., Kouam, C. N., Scott, J. G. Levels of cross-resistance to pyrethroids conferred by the Vssc knockdown resistance allele 410L+1016I+1534C in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 15 (7), 0009549 (2021).
- Fan, Y., Scott, J. G. The F1534C voltage-sensitive sodium channel mutation confers 7- to 16-fold resistance to pyrethroid insecticides in Aedes aegypti. Pest Management Science. 76 (1), 2251-2259 (2020).
- Miller, A. L. E., Tindall, K., Leonard, B. R. Bioassays for monitoring insecticide resistance. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2129 (2010).
- Glunt, K. D., et al. Long-lasting insecticidal nets no longer effectively kill the highly resistant Anopheles funestus of southern Mozambique. Malaria Journal. 14 (1), 298 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T., Roush, R. T., Tabashnik, B. E. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , (1990).
- Akdag, K., et al. Synthesis and larvicidal and adult topical activity of some hydrazide-hydrazone derivatives against Aedes aegypti. Marmara Pharmaceutical Journal. 18 (1), 120-125 (2014).
- Richards, S. L., Byrd, B. D., Reiskind, M. H., White, A. V. Assessing insecticide resistance in adult mosquitoes: perspectives on current methods. Environmental Health Insights. 14 (1), (2020).
- Cooperband, M., Golden, F., Clark, G., Jany, W., Allan, S. Prallethrin-induced excitation increases contact between sprayed ultra-low volume droplets and flying mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a wind tunnel. Journal of Medical Entomology. 47 (1), 1099-1106 (2010).
- Barbosa, D. S., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Evaluation of attractive toxic sugar baits (ATSB) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory. Tropical Biomedicine. 36 (2), 578-586 (2019).
