Bioensayo de aplicación tópica para cuantificar la toxicidad de insecticidas para mosquitos y moscas de la fruta
Summary
Describimos la metodología e importancia del bioensayo de aplicación tópica para medir la susceptibilidad a insecticidas en mosquitos y moscas de la fruta. El ensayo presentado es de alto rendimiento, utiliza masa de insectos, lo que permite calcular una dosis letal relativizada en masa en lugar de concentración, y probablemente tiene una variabilidad más baja que otros métodos similares.
Abstract
El uso continuado de insecticidas para la salud pública y la agricultura ha dado lugar a una resistencia generalizada a los insecticidas y ha obstaculizado los métodos de control. La vigilancia de la resistencia a los insecticidas de las poblaciones de mosquitos generalmente se realiza a través de bioensayos de botellas de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) o pruebas de tubo de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Sin embargo, estos métodos pueden resultar en un alto grado de variabilidad en los datos de mortalidad debido al contacto variable del insecticida con el insecto, el número relativamente pequeño de organismos probados, la amplia variación en la masa entre las poblaciones y las condiciones ambientales en constante cambio, lo que lleva a resultados variables. Este artículo presenta el bioensayo de aplicación tópica, adaptado como un bioensayo fenotípico de alto rendimiento tanto para mosquitos como para moscas de la fruta, para probar un gran número de insectos a lo largo de un rango de concentraciones de insecticidas.
Este ensayo 1) asegura un tratamiento consistente y el contacto insecticida con cada organismo, 2) produce curvas dosis-respuesta altamente específicas que tienen en cuenta las diferencias en la masa promedio entre cepas y sexos (lo cual es particularmente importante para los organismos recolectados en el campo), y 3) permite el cálculo de dosis letales medianas estadísticamente rigurosas (LD50 ), que son necesarios para las comparaciones de la relación de resistencia, un enfoque de vigilancia alternativo de la mortalidad por dosis diagnósticas, que también se utiliza para la vigilancia de la resistencia a los larvicidas. Este ensayo será una herramienta complementaria para fenotipar con precisión las poblaciones de mosquitos y, como se ilustra con moscas de la fruta, es fácilmente adaptable para su uso con otros insectos. Argumentamos que este ensayo ayudará a llenar el vacío entre la resistencia a los insecticidas genotípicos y fenotípicos en múltiples especies de insectos.
Introduction
Los mosquitos son responsables de más de 700,000 muertes cada año debido a las enfermedades que transmiten a los humanos, y más de la mitad de esas muertes se deben solo a la malaria1. El principal método preventivo contra la transmisión del paludismo y otras enfermedades transmitidas por vectores es el uso de insecticidas, a menudo en forma de mosquiteros de larga duración o fumigación residual en interiores2. Sin embargo, la resistencia a los insecticidas está muy extendida entre los mosquitos y otros insectos vectores, así comoentre las plagas agrícolas 3,4. Para gestionar eficazmente la resistencia, la vigilancia es de vital importancia5. Para esto, se necesitan métodos de detección de resistencia altamente precisos y de alto rendimiento. Actualmente, las herramientas de vigilancia de la resistencia a los insecticidas más extendidas para los mosquitos son la pruebade tubo 6 de la OMS y el bioensayode botella 7 de los CDC. Para las moscas de la fruta, el método de aplicación de contacto residual (similar al bioensayo de botella de los CDC) es un bioensayo insecticida de uso común 8,9,10. Sin embargo, la variabilidad en los datos de estos métodos suele ser alta, con mediciones de la misma cepa de mosquito de laboratorio que oscilan entre ~ 20-70% de mortalidad en los ensayos de botellas de los CDC y 0-50% en las pruebas de tubo de la OMS cuando se exponen a dosis subletales11. Tal variación es sorprendente porque se espera que la variación genética limitada en la mayoría de las cepas de laboratorio conduzca a una variación limitada de la susceptibilidad a los insecticidas en la población. Sin embargo, todavía hay un alto nivel de variación observado en los resultados del bioensayo.
Las fuentes potenciales de esta variación podrían ser el resultado de la exposición heterogénea a insecticidas entre especímenes dentro del bioensayo debido a la exposición indirecta a insecticidas a través de la superficie, efectos ambientales heterogéneos, variación biológica normal entre individuos del mismo genotipo y variación en la masa de especímenes de la misma población12 . Un método poco utilizado con mayor replicabilidad es el bioensayo de aplicación tópica. En este ensayo, el insecticida se aplica directamente a cada insecto 13,14, eliminando el factor de exposición heterogénea de diferentes ejemplares dentro de un mismo ensayo. Sin embargo, debido a la naturaleza de rendimiento lento de este método, no se utiliza rutinariamente como una herramienta de vigilancia de la susceptibilidad a los insecticidas para las poblaciones de mosquitos. Este artículo presenta un protocolo modificado para el bioensayo de aplicación tópica que permite exposiciones de mayor rendimiento al tiempo que corrige la variación en la masa de insectos, un parámetro que se correlaciona con los cambios en la susceptibilidad a los insecticidas12. Una reducción en el ruido y la variación asociada a la masa en los datos de mortalidad por exposición variable a insecticidas permitiría una vigilancia técnica de la resistencia más precisa11,15. Dichos datos podrían utilizarse para asociar con mayor precisión la resistencia fenotípica con marcadores genéticos, parámetros de aptitud y/o competencia vectorial. Además, demostramos cómo este ensayo podría adaptarse fácilmente a otras especies de insectos mediante el uso del bioensayo de aplicación tópica en moscas de la fruta, una especie de insecto de cuerpo más pequeño.
La principal limitación de las aplicaciones de contacto residual antes mencionadas es que la exposición a insecticidas puede variar de un espécimen a otro dentro del mismo ensayo. En el caso de los bioensayos de botellas de los CDC y el método de contacto, la exposición a insecticidas puede variar entre réplicas del mismo ensayo. Los insectos están expuestos a insecticidas que se distribuyen en el interior de una botella de vidrio (método de contacto y bioensayo de botellas de los CDC) o en papeles impregnados (prueba de tubo de la OMS). La concentración de insecticida en ambas superficies (vidrio y papel) es conocida y predeterminada mediante el cribado de diferentes especies de genotipos conocidos. Sin embargo, la cantidad disponible para ser potencialmente absorbida por el insecto puede variar mucho dependiendo de la superficie utilizada, los componentes de la mezcla de insecticidas y la homogeneidad con la que el insecticida se distribuye a través del material de la superficie16,17. En el bioensayo de la botella de los CDC, el recubrimiento insecticida en el interior de la botella depende de los procedimientos empleados por cada laboratorio y usuario. En la prueba de tubo de la OMS, los papeles tratados con insecticida se producen centralmente y, por lo tanto, lo más probable es que sean bastante homogéneos en todos los laboratorios. Sin embargo, en la prueba de tubo de la OMS, el tubo de exposición permite que las muestras aterricen y descansen sobre una malla metálica no expuesta a insecticidas, lo que lleva a una posible exposición heterogénea a insecticidas entre las muestras dentro de cada prueba. La cantidad real de insecticida recogido y absorbido por los especímenes a través de cada método aún debe explorarse mása fondo 18.
Además, el bioensayo de botellas de los CDC, la prueba de tubo de la OMS y el método de contacto se utilizan con mayor frecuencia como ensayos de umbral que prueban solo una concentración predeterminada de insecticida. Este enfoque puede detectar con precisión la presencia de resistencia y es valioso para la vigilancia de la resistencia (especialmente cuando la resistencia se está extendiendo). Sin embargo, los ensayos de umbral no pueden cuantificar la fuerza de la resistencia, lo que podría ser más predictivo de la eficacia de las herramientas de intervención. Si se utilizan múltiples concentraciones de insecticidas con estos métodos, entonces se pueden usar como ensayos de intensidad. Los ensayos de intensidad para el bioensayo de botellas de los CDC y la prueba de tubo de la OMS se han introducido mediante la prueba de 5x y 10 veces las dosis discriminantes predeterminadas para abordar esta brecha en la vigilancia 6,19. Si bien proporciona una mayor capacidad para diferenciar entre poblaciones resistentes, 3-5 dosis (predeterminadas) proporcionan una resolución limitada para calcular las concentraciones letales. Además, los mosquitos de varios tamaños se utilizan en tales ensayos. Sin embargo, es importante medir la masa, ya que los especímenes más grandes podrían necesitar una dosis más alta para ser eliminados, ya que la dosis efectiva por unidad de masa será mucho menor que la de un organismo más pequeño12. Calcular una dosis letal relativizada en masa (cantidad de insecticida por masa de insecto) sería una métrica más útil que la concentración letal más común (por ejemplo, cantidad de insecticida por área de superficie), ya que considera la variación de la masa de insectos entre sexos, poblaciones y genotipos. Tales datos ayudarían a llenar el vacío entre la resistencia genotípica y fenotípica dentro del laboratorio y el campo y también podrían proporcionar una manera fácil de calcular la concentración de aplicación necesaria para tratar una población de insectos de una masa promedio conocida.
El uso de dosis letales relativizadas en masa que matan el 50% de los especímenes (LD50) también incorpora varios otros beneficios. La evaluación de la toxicidad de un compuesto específico en mg/kg (= ng/mg) es estándar en toxicología humana y veterinaria14, y los valores de DL50 se encuentran en las fichas de datos de seguridad de los materiales. Las dosis letales también permiten la comparación directa de la toxicidad entre diferentes productos químicos hacia una especie en particular o el mismo producto químico hacia diferentes especies20, así como la evaluación de alta calidad de nuevos insecticidas y productos químicos13. Además, la DL50 puede proporcionar proporciones de resistencia más significativas y precisas que las derivadas de los resultados de mortalidad por dosis diagnósticas, lo que puede resultar en una sobreestimación del nivel de resistencia presente en una población. Por lo tanto, este ensayo sería adecuado para los programas de vigilancia de rutina al proporcionar un monitoreo de resistencia más riguroso basado en dosis letales relativizadas en masa derivadas de más especímenes de los recomendados para otros bioensayos21.
El método de aplicación tópica se ha utilizado en la vigilancia de la susceptibilidad a insecticidas para mosquitos y moscas como alternativa para los bioensayos estándar de susceptibilidad a insecticidas cuando ya se conoce o sospecha resistencia22,23, así como para la vigilancia en algunos insectos plaga24 para evaluar con mayor precisión los perfiles de resistencia y la toxicidad intrínseca del insecticida21 . En los bioensayos de aplicación tópica, el insecticida se aplica a cada organismo, lo que resulta en una variación mínima en la exposición al insecticida. Este artículo presenta un método ligeramente adaptado y mejorado que permite aplicar la exposición a insecticidas a un gran número de insectos en un corto período de tiempo, al tiempo que controla la masa de insectos22. Este método de mayor rendimiento con buenos niveles de replicabilidad podría ser una herramienta adicional útil para la vigilancia rutinaria de la susceptibilidad a los insecticidas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo presenta un protocolo adaptado para el ensayo de aplicación tópica para mosquitos y moscas de la fruta. Este procedimiento podría adaptarse fácilmente para ser utilizado en el campo y con otros organismos, ya que requiere un equipo especializado mínimo. A continuación se abordan los pasos críticos de este protocolo, las posibles modificaciones, los consejos para la solución de problemas, las limitaciones del método y la importancia de este método.
Pasos críticos en el protocolo: Hay tres pasos críticos en el protocolo que, si se completan incorrectamente, pueden afectar drásticamente los resultados del bioensayo: precisión de la concentración de insecticidas, eliminación de muestras y evaluación de la mortalidad.
Precisión de la concentración de insecticidas:
Es extremadamente importante contar con soluciones insecticidas precisas para obtener curvas dosis-respuesta replicables y resultados significativos. El enfoque volumétrico para la preparación de soluciones insecticidas es más común dentro de la literatura tanto para el bioensayode botellas 7 de los CDC como para las aplicaciones tópicas 13,14,43. Sin embargo, el enfoque gravimétrico descrito aquí es inherentemente más preciso debido a la consideración de la temperatura a través de la inclusión de la densidad (específica de la temperatura), lo que lleva a una preparación de formulación más precisa.
Derribo de muestras:
Derribar las muestras es un componente crítico de este método y permite la administración precisa del insecticida y las mediciones de peso. Sin embargo, derribar organismos inevitablemente conlleva el riesgo de estrés físico y daños, como se demostró anteriormente30. Por lo tanto, tenga cuidado y tenga en cuenta al derribar las muestras para asegurarse de que i) cada muestra se derribe durante una duración similar, ii) la duración de la eliminación se mantenga al mínimo, y iii) el método de derribo se mantenga consistente en todas las muestras. Además, se recomienda probar el método de derribo por separado, antes de la aplicación del insecticida, para garantizar que el método sea exitoso y no induzca una mortalidad de control superior al 10%. La prueba inicial puede tomar más tiempo para un usuario inexperto, lo que lleva a tiempos de derribo más largos. Por lo tanto, tenga cuidado al interpretar los resultados de los primeros ensayos.
Evaluación de la mortalidad:
Evaluar la mortalidad puede ser un desafío, especialmente cuando el insecticida no mata por completo, sino que solo derriba o mutila al mosquito o la mosca. Por lo tanto, es importante ser consciente de cómo el insecticida afecta al organismo objetivo y tener una definición clara de los organismos “muertos” (o derribados) antes de comenzar. Además, se recomienda que la misma persona evalúe la mortalidad entre dosis y réplicas para reducir la variación.
Modificaciones de protocolo: Varias modificaciones descritas a continuación se pueden aplicar a este protocolo para mejorar su versatilidad y accesibilidad.
Adaptación del ensayo a insectos más pequeños o de mayor tamaño:
Cuando se utilizan especímenes más pequeños o más grandes, se recomienda aplicar un volumen de dosis más pequeño o mayor de insecticida, respectivamente. Como ejemplo, adaptamos el protocolo de mosquitos a las moscas de la fruta reduciendo la dosis de 0,5 μL a una dosis de 0,2 μL. Asegúrese de que se elige el tamaño correcto de la jeringa para el volumen de dosis elegido.
Adaptación del ensayo a insectos de campo:
Cuando se usan insectos de campo, puede haber más variación en el tamaño de los insectos. Por lo tanto, se recomendaría pesar los insectos en grupos más pequeños (por ejemplo, por taza) en lugar de como un grupo grande (por ejemplo, todos los insectos utilizados para un experimento). Esto puede ayudar a capturar la variación potencial en la susceptibilidad a los insecticidas asociada con las diferencias en la masa de insectos de campo.
Modificaciones de equipos:
Carpa de manejo de insectos: La dosificación del espécimen se puede completar bajo una carpa de manejo de insectos que simplemente se construye con tubería de PVC y mosquiteras. Esto puede ser una alternativa a una habitación cerrada (por ejemplo, insectaria) y ayudar a eliminar la posible contaminación por insecticidas en áreas donde podría ocurrir la cría de insectos. Esta carpa de manejo de insectos es fácil de construir y de bajo costo (~ $ 70). Alternativamente, se podría comprar una jaula de manejo de insectos (~ $ 425).
Mesa de enfriamiento: Se pueden usar bolsas de hielo o bandejas de hielo para derribar la muestra y / o mantener la muestra derribada.
Incubadora: Se recomiendan incubadoras para criar el espécimen y mantenerlo durante 24 horas después del tratamiento con insecticida. Si no hay una incubadora disponible, se puede construir. El equipo necesario para construir la incubadora incluye un contenedor aislado, humidificador, cables de calor, controlador de humedad y temperatura, y una luz, que debería sumar un costo total de ~ $ 170, siguiendo y ampliando los métodos anteriores44.
Vasos de sujeción: Aunque se utilizan vasos de plástico para clasificar y sostener el espécimen tratado, los vasos de papel forrados con cera o los recipientes de vidrio serían alternativas adecuadas.
Modificación del organismo y de la etapa de la vida:
Este método es muy adaptable para su uso con otros vectores, insectos y / o artrópodos como los mosquitos Culex quinquefasciatus 32, moscas domésticas32 y cucarachas45, así como etapas de vida no adultas, como larvas de mosquitos46.
Modificación de la ubicación de la aplicación tópica:
Este método describe la aplicación del insecticida en el tórax ventral y la región del abdomen para los mosquitos (y el dorso para las moscas de la fruta). Sin embargo, se pueden usar otras ubicaciones de aplicación siempre que el sitio de exposición sea consistente. La consistencia es importante porque la sensibilidad a los insecticidas puede variar según la ubicación de la aplicación32.
Consejos para la solución de problemas: Este método tiene varios pasos que inicialmente son desafiantes. A continuación se describen algunos de los problemas más comunes que uno puede encontrar.
Soluciones insecticidas con fugas/evaporación:
Los insecticidas se disuelven comúnmente en acetona, un compuesto altamente volátil. Esto significa que la acetona se evapora rápidamente a temperatura ambiente, aumentando las concentraciones de insecticidas con el tiempo. Si las soluciones insecticidas parecen tener fugas o evaporarse, rehaga las soluciones, asegúrese de que la tapa del tubo esté bien encendida y verifique que los protocolos de almacenamiento se sigan correctamente (por ejemplo, se está utilizando parafilm y los tubos se almacenan en posición vertical). Si la fuga persiste, intente llenar los tubos con un volumen más bajo para permitir más espacio para el cambio en el volumen que experimenta la acetona a diferentes temperaturas. Además, si usa acetona como disolvente, asegúrese de que los tubos estén clasificados para el almacenamiento de acetona (por ejemplo, plásticos FEP, TFE y PFA). Si usa insecticidas hidrófobos, guarde las soluciones en viales de vidrio (ya que los insecticidas hidrófobos se adhieren al vidrio menos que al plástico). También es una buena práctica marcar el menisco de la solución antes de almacenarla para controlar la evaporación.
Peso a la deriva en microbalanza al pesar organismos:
Si la lectura de peso en la báscula está a la deriva (subiendo o bajando lentamente), esto podría deberse a la estática. La deriva ocurre con mayor frecuencia cuando se pesan organismos en artículos de plástico, ya que el plástico puede mantener fácilmente una carga estática. Para evitar esto, se puede colocar un papel de pesaje debajo del recipiente de plástico que se pesa, o se puede usar un recipiente no plástico como el vidrio.
Resultados de mortalidad anormal:
Hay muchas maneras en que los resultados de mortalidad pueden parecer anormales, como observar una alta mortalidad en los controles o una mortalidad alta / baja en todas las dosis de insecticidas. Revise los siguientes casos para solucionar problemas de cada escenario.
Alta mortalidad de control
Si hay una alta mortalidad en el grupo de control (10% o más), evalúe el método de derribo y el tiempo que se derriban las muestras. Si es posible, acorte el período de tiempo durante el cual los especímenes son derribados. Otros factores potenciales a considerar para una alta mortalidad en los controles incluyen i) verificar si la configuración de la incubadora es correcta: las temperaturas anormales y / o la humedad podrían conducir a un aumento de la mortalidad. La temperatura y la humedad deben verificarse con un registrador de datos independiente. ii) Evaluación del manejo de insectos. El manejo excesivo o excesivo de insectos podría conducir a una alta mortalidad. iii) Comprobar si no hay contaminación por insecticida en la acetona 100% utilizada para tratar al grupo control o en la instrumentación. Reemplace la acetona y limpie todos los instrumentos con acetona o etanol. Evite la contaminación reemplazando con frecuencia los guantes, evitando derrames y limpiando los instrumentos. Tenga en cuenta que en el Archivo Suplementario 3, un máximo de dos mosquitos murieron dentro de las tazas de control (solo acetona). Este nivel de mortalidad no se considera alto (es inferior al 10%), y por lo tanto, no había motivo de preocupación.
Alta mortalidad en todos los grupos expuestos (pero no en los grupos de control)
Use concentraciones más bajas de insecticida o volúmenes de dosis más pequeños para las pruebas. Las dosis utilizadas pueden estar por encima de la dosis mínima que no inducirá la mortalidad. Use varias diluciones de 10 veces para identificar el rango de dosis correcto y descartar la contaminación. Para evitar la contaminación, comience a dosificar con la concentración más baja y trabaje hacia la concentración más alta. Además, asegúrese de que todo el equipo utilizado se limpie regularmente con acetona y / o etanol, las dosis aplicadas a la muestra son muy pequeñas e incluso la más mínima contaminación cruzada podría afectar los resultados.
Baja mortalidad en todos los grupos expuestos
Use concentraciones más altas de insecticidas. Las dosis utilizadas pueden ser demasiado bajas para causar mortalidad en la población. Para identificar el rango de dosis correcto, exponga las muestras a varias dosis concentradas más de 10 veces. Asegúrese de que las soluciones insecticidas no hayan caducado o degradado (potencialmente debido a la alta temperatura o la exposición a la luz). Si las soluciones han caducado o se sospecha que se han degradado, vuelva a crear las soluciones y asegúrese de que se sigan las condiciones de almacenamiento adecuadas.
Mortalidad inconsistente entre réplicas/días
La hora del día en que los insectos están expuestos al insecticida podría afectar el nivel de resistencia expresado, especialmente para la resistencia metabólica34. Repita este protocolo durante la misma ventana de tiempo cada día para evitar la hora del día como una variable potencial que contribuye a los cambios en la mortalidad. Otros factores potenciales que contribuyen a la mortalidad inconsistente entre réplicas incluyen i) especímenes que se crían diferencialmente entre experimentos. Asegúrese de que todos los especímenes sean del mismo rango de edad, criados a la misma temperatura y densidades y disponibilidad de alimentos similares. ii) concentraciones de insecticidas que se degradan con el tiempo o se vuelven más concentradas debido a la evaporación de la acetona. Rehaga las soluciones y garantice las condiciones de almacenamiento adecuadas. iii) Puntuación de mortalidad inconsistente. Asegúrese de que la misma persona califique la mortalidad o desarrolle un protocolo claro para ser utilizado de manera consistente en todo el equipo. Use la puntuación ciega para reducir el sesgo en la puntuación de mortalidad.
Insectos que se adhieren a la superficie de la bandeja de clasificación:
La acetona reacciona a los plásticos utilizados en este protocolo, como las placas de Petri. Es probable que la muestra se adhiera a la superficie si usa acetona en placas de Petri o superficies plásticas similares. Esta adhesión se puede evitar forrando la bandeja de clasificación con papel de pesaje o utilizando una bandeja de clasificación no plástica. Además, la condensación en la superficie del plástico en la bandeja de clasificación o en los vasos de retención puede provocar que los insectos se adhieran a la condensación, o la muestra puede estar demasiado fría y potencialmente congelarse en la superficie. Ajuste el método de derribo para reducir la condensación y evitar que las muestras se enfríen demasiado o se congelen (por ejemplo, coloque papel de pesaje entre las muestras y la bandeja de clasificación de plástico).
Errores de análisis R:
Una vez que se recopilan los datos de mortalidad, pueden ocurrir una variedad de complicaciones durante el análisis. La razón más común por la que un código R no puede completar las acciones para el archivo de datos es que el formato de datos no coincide con el código (por ejemplo, encabezados de columna y / o celdas vacías). Si surgen complicaciones más graves, consulte las páginas de ayuda de R integradas en Rstudio35.
Limitaciones del método de aplicación tópica descrito anteriormente:
La absorción de insecticidas a través del método de aplicación tópica no imita la exposición natural:
La aplicación tópica en el cuerpo primario no es la forma natural de absorción de insecticidas. En el campo, los insectos absorben principalmente insecticidas a través de sus patas durante el tiempo que están en contacto con la superficie tratada con insecticida o en sus alas a través de pequeñas partículasde aerosol 47,48, en lugar de una exposición rápida en la superficie ventral. Sin embargo, la aplicación directa de una dosis conocida de insecticida establecerá con precisión una respuesta fenotípica a los insecticidas, necesaria para estudios genéticos y evolutivos o comparaciones de susceptibilidad a insecticidas a través del espacio o el tiempo. Por lo tanto, este enfoque es beneficioso para probar la resistencia técnica, pero no medirá directamente la resistencia práctica (la eficacia de la herramienta de intervención real en un entorno de campo15). Sin embargo, es importante tener en cuenta que los métodos estándar actuales (por ejemplo, las pruebas de tubo de la OMS y los bioensayos de botellas de los CDC) tampoco pueden capturar o imitar la exposición a insecticidas en aerosol (es decir, empañando) en el campo.
Los ensayos de aplicación tópica solo pueden evaluar los insecticidas de absorción de contacto:
Este método está destinado a insecticidas que funcionan a través del contacto y la absorción del insecticida y no para su uso con insecticidas orales, como el ácido bórico comúnmente utilizado en cebos de azúcar tóxicos atractivos49.
Importancia del método:
El método de aplicación tópica amplía las normas bien establecidas para los bioensayos de insecticidas calculando la dosis letal (no la concentración) y midiendo la resistencia técnica (no práctica)15. A continuación se presentan las ventajas y desventajas de este método sobre los ensayos de susceptibilidad a insecticidas existentes.
Cálculo de la dosis letal:
Este método determina la dosis letal del insecticida, en lugar de la concentración letal que los bioensayos de los CDC y la OMS utilizan para establecer la dosis discriminante11. La dosis letal es más significativa porque es una cantidad cuantificada de insecticida que se sabe que provoca mortalidad. En contraste, la concentración letal no considera cuánto insecticida adquiere realmente el organismo. Cuando se utiliza el cálculo de la dosis letal, las diferencias entre los perfiles de susceptibilidad dependientes del sexo o el tamaño se pueden observar y cuantificar con mayor precisión, lo que hace que esta medición sea aún más versátil.
Resistencia técnica:
Este método evalúa la resistencia técnica, que es la resistencia medida en entornos estandarizados y controlados. Tales mediciones son adecuadas para la vigilancia de la propagación de la resistencia a los insecticidas y la vinculación de la resistencia fenotípica con marcadores potenciales15. Debido a la disminución de la variación en la mortalidad resultante del bioensayo de aplicación tópica, permite una mejor identificación de nuevos marcadores de resistencia. Sin embargo, debido a la exposición no natural de insecticidas al mosquito, este ensayo no es adecuado para la estimación de la eficacia de una intervención específica en una población específica. Se necesitan otros ensayos para medir dicha resistencia práctica15.
Adaptabilidad de la muestra:
Este método se puede practicar en otros artrópodos importantes, como plagas de cultivos (por ejemplo, escarabajo de la patata de Colorado), plagas domésticas (por ejemplo, cucarachas y chinches) o polinizadores (por ejemplo, abejas) con cambios simples en el enfoque de derribo y / o dosis, volumen y / o concentración de insecticida (como se describió anteriormente). La facilidad de adaptabilidad puede ayudar a analogizar la investigación de la resistencia a los insecticidas en diferentes campos de investigación. El uso de un valor de LD50 en lugar de una concentración letal que mata al 50% de los especímenes (LC50) permite una comparación precisa entre especies.
Costar:
Al igual que en los bioensayos de botellas de los CDC y las pruebas de tubos de la OMS, los costos para ejecutar el ensayo de aplicación tópica son mínimos (consulte la Tabla de materiales). Las piezas esenciales del equipo son la jeringa (aproximadamente $ 70) y el dispensador (aproximadamente $ 100), que son reutilizables en todos los ensayos.
Número de especímenes necesarios:
Se debe utilizar un mínimo de 20-25 especímenes por taza de ensayo de aplicación tópica. Se recomienda probar un mínimo de cinco concentraciones de insecticidas por experimento, con un mínimo de tres réplicas recomendadas para el procedimiento. En general, esto da como resultado un mínimo de 300-375 muestras necesarias para una prueba completa, comparable al número de muestras necesarias para realizar pruebas de intensidad de resistencia utilizando pruebas de tubos de la OMS o bioensayos de botellas de los CDC. Sin embargo, si se logra una variabilidad reducida con el bioensayo de aplicación tópica, el mismo número de especímenes puede conducir a un mayor poder estadístico para comparar los datos de susceptibilidad en el espacio o el tiempo.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por un premio CAREER de la Fundación Nacional de Ciencias a SH bajo el premio número 2047572. Agradecemos a Damien Rivera por su asistencia en la cría de moscas de la fruta y la preparación para el ensayo de aplicación tópica, al Dr. Ganetzky de la Universidad de Wisconsin-Madison por compartir su cepa de mosca de la fruta Canton-S, a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades por compartir la cepa Rockefeller y al Centro de Entomología Médica Agrícola y Veterinaria del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos por compartir la cepa isolina IICC. La Figura 1 se creó con BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
| 1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
| 15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
| 20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
| 25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
| Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
| Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
| Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
| Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
| Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
| Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
| Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
| Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
| Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
| Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
| Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
| Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
| Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
| Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
| Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
| Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
| Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
| Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
| Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
| Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
| Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
| PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
| Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
| Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
| Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |
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