Cuantificación de la motilidad del enjambre de la superficie bacteriana en placas de gradiente inductoras
Summary
Aquí, describimos el uso de placas de gradiente inductoras para evaluar la motilidad del enjambre bacteriano y, al mismo tiempo, obtener múltiples respuestas de concentración.
Abstract
La motilidad del enjambre bacteriano es un fenotipo microbiológico común que las comunidades bacterianas utilizan para migrar sobre superficies semisólidas. En las investigaciones de la motilidad del enjambre inducido, la concentración específica de un inductor puede no ser capaz de informar eventos que ocurren dentro del rango de concentración óptimo para provocar las respuestas deseadas de una especie. Las placas semisólidas que contienen múltiples concentraciones se usan comúnmente para investigar la respuesta dentro de un rango de concentración del inductor. Sin embargo, las placas semisólidas separadas aumentan las variaciones en la viscosidad media y el contenido de humedad dentro de cada placa debido al tiempo de solidificación no uniforme.
Este artículo describe un método de un solo paso para probar simultáneamente la motilidad del enjambre de superficie en una sola placa de gradiente, donde los pozos de prueba dispuestos isométricamente permiten la adquisición simultánea de respuestas de multiconcentración. En el presente trabajo, se evaluó el enjambre superficial de Escherichia coli K12 y Pseudomonas aeruginosa PAO1 en respuesta a un gradiente de concentración de inductores como el resveratrol y la arabinosa. Periódicamente, las morfologías del enjambre se fotografiaban utilizando un sistema de imágenes para capturar todo el proceso de enjambre de superficie.
La medición cuantitativa de las morfologías del enjambre se adquirió utilizando el software ImageJ, proporcionando información analizable del área del enjambre. Este artículo presenta un método simple de placa de enjambre de gradiente que proporciona información cualitativa y cuantitativa sobre los efectos de los inductores en el enjambre de superficie, que puede ampliarse para estudiar los efectos de otros inductores en una gama más amplia de especies bacterianas móviles.
Introduction
La motilidad del enjambre bacteriano se refiere a la migración colectiva de células bacterianas a través de la superficie de una sustancia. Además de las placas de agar semisólido especialmente preparadas en el laboratorio1, este fenotipo también se observa en algunos sustratos blandos como tejidos animales2, superficies hidratadas3 y raíces de plantas4. Si bien una superficie semisólida se considera una de las condiciones fundamentales para el enjambre bacteriano, algunas especies también requieren un medio rico en energía para soportar su motilidad de enjambre5. La rotación de flagelos potencia tanto para nadar como para enjambre: la natación describe la motilidad unicelular dentro de un ambiente líquido, mientras que el enjambre es el movimiento sincrónico de una población microbiana a través de superficies semisólidas.
La viscosidad del sustrato influye en la motilidad bacteriana; los estudios de microbios patógenos, como Helicobacter pylori, han demostrado que la motilidad del patógeno cambia en función de la viscosidad de la capa de mucina, que está influenciada por la acidificación ambiental en el huésped humano6. Para replicar estos entornos, estudios anteriores que utilizaron una concentración de agar superior al 0,3% (p/v) restringen la motilidad bacteriana de la natación para efectuar un cambio gradual hacia el enjambre superficial. El uso de concentraciones de agar por encima del 1% (p/v) previene la motilidad del enjambre de muchas especies7. Los patrones de colonia formados en la superficie son diversos, incluyendo mat8 sin rasgos, ojo de buey9, dendritas10 y vórtice11.
Aunque la relevancia de tales patrones sigue sin estar clara, esos patrones parecen depender de señales ambientales y químicas12. Las señales ambientales cubren diferentes aspectos, incluida la temperatura, la salinidad, la luz y el pH, mientras que las señales químicas incluyen la presencia de moléculas de detección de quórum microbiano, subproductos bioquímicos y nutrientes. Las moléculas de señalización de detección de quórum autoinductoras como AHL (N-hexanoyl-L homoserine lactone) pueden afectar el enjambre superficial al regular la producción de surfactante13,14. El resveratrol, un compuesto fitoalexina, podría restringir la motilidad del enjambre bacteriano15.
En el presente trabajo, investigamos el efecto de las concentraciones de gradiente de resveratrol en la cepa K12 de Escherichia coli de tipo silvestre e investigamos la motilidad de enjambre inducible por arabinosa de las especies de E. coli K12-YdeH y Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. La producción de la enzima YdeH es inducida por la arabinosa a través del promotor araBAD, resultando en perturbación celular c-di-GMP y afectando la motilidad del enjambre bacteriano16,17. Este comportamiento de enjambre inducible se estudia utilizando placas de enjambre de gradiente de arabinosa con cepas de E. coli K12-YdeH y P. aeruginosa PAO1-YdeH.
Las placas de enjambre de gradiente se preparan solidificando sucesivamente el medio de doble capa (Figura 1B). La capa inferior comprende el medio agregado con el inductor, vertido en un lado de una placa de Petri apoyada. Tras la solidificación de la capa inferior, la placa de Petri se devuelve a una superficie plana, donde la capa superior que contiene el medio sin el inductor se agrega desde el otro lado de la placa. Después de que las placas de enjambre están completamente solidificadas, los pozos de retención dispuestos isométricamente se producen perforando agujeros en las placas de enjambre siguiendo un diseño fijo (Figura 1C) o imprimiendo los pozos utilizando un modelo impreso en 3D de la cubierta de la placa que contiene clavijas durante el proceso de curado del medio (Figura suplementaria S1). Se utiliza un sistema de imágenes en gel para capturar las morfologías del enjambre en diferentes puntos temporales (Figura 2). El análisis del enjambre de superficies utilizando el software ImageJ (Figura suplementaria S2) proporciona resultados cuantitativos del proceso de enjambre de superficies (Figura 3).
Por lo tanto, proponemos un método simple para probar la motilidad del enjambre de superficie dentro de un rango de concentración de inductores. Este método se puede utilizar para probar múltiples respuestas de concentración de otros inductores mezclando el inductor en el medio de la capa inferior y se puede aplicar a otras especies móviles (por ejemplo, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Este enfoque podría proporcionar resultados cualitativos y cuantitativos confiables para la detección de un solo inductor químico, y se pueden emplear placas separadas para evaluar más inductores químicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La investigación de la motilidad del enjambre bacteriano en placas de gradiente semisólido puede ser una tarea desafiante18,19,20, ya que involucra múltiples factores como la viscosidad del sustrato, la humedad y los componentes medios. Entre estos factores, la concentración de agar juega un papel decisivo en la determinación de la reversión microbiana a la motilidad de natación o enjambre. A medida que la concentración …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El desarrollo de esta técnica fue apoyado por los fondos del plan nacional clave de I + D del Ministerio de Ciencia y Tecnología (2018YF0902604), el Fondo de Investigación para Jóvenes Científicos Internacionales (22050410270) de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China y los Fondos Externos de los Institutos de Tecnología Avanzada de Shenzhen (DWKF20190001). Nos gustaría ofrecer nuestro sincero agradecimiento a la señorita Chen Xinyi por su ayuda en la revisión del documento y la gestión del laboratorio.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
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