インデューサーグラジエントプレート上の細菌表面群動運動性の定量化

細菌群動性は、物質の表面を横切る細菌細胞の集団的移動を指す。実験室で特別に準備された半固体寒天プレート¹に加えて、この表現型は動物組織²、水和表面³、植物の根⁴などのいくつかの柔らかい基質にも観察されます。半固体表面は細菌群がる基本的な条件の1つと考えられていますが、いくつかの種はまた、それらの群動性をサポートするためにエネルギーに富んだ培地を必要とします⁵。鞭毛の回転は、水泳と群がる運動性の両方を動かします – 水泳は、液体環境内の単細胞運動性を表しますが、群れは半固体表面を横切る微生物集団の同期運動です。

基質粘度は細菌の運動性に影響を及ぼす。 ヘリコバクター・ピロリなどの病原性微生物の研究では、病原体の運動性はムチン層の粘度によって変化し、ヒト宿主の環境酸性化の影響を受けることが示されています⁶。これらの環境を再現するために、0.3%(w / v)を超える寒天濃度を使用した以前の研究では、細菌の遊泳運動性が制限され、表面群動への漸進的なシフトがもたらされた。1%(w / v)を超える寒天濃度の使用は、多くの種の群れ運動性を防ぎます⁷。表面に形成されるコロニーパターンは、特徴のない^mat8、雄牛の目⁹、樹状突起¹⁰、渦¹¹など、多様です。

このようなパターンの関連性は不明のままですが、これらのパターンは環境的および化学的手がかりに依存しているようです¹²。環境の手がかりは、温度、塩分濃度、光、pHなどのさまざまな側面をカバーしていますが、化学的手がかりには、微生物クォーラムセンシング分子、生化学的副産物、栄養素の存在が含まれます。AHL(N-ヘキサノイル-Lホモセリンラクトン)などの自己誘導物質クォーラムセンシングシグナル伝達分子は、界面活性剤の産生を調節することによって表面群動に影響を与えることができる^13,14。フィトアレキシン化合物であるレスベラトロールは、細菌の群れ運動性を制限する可能性があります¹⁵。

本研究では、野生型大腸菌K12株に対するレスベラトロールの勾配濃度の影響を調査し、操作された大腸菌K12-YdeHおよび緑膿菌PAO1-YdeH種のアラビノース誘導性群動性を調べる。YdeH酵素の産生はaraBADプロモーターを介してアラビノースによって誘導され、細胞のc-di-GMP摂動をもたらし、細菌群動性に影響を与える^16,17。この誘導性群動は、大腸菌K12-YdeHおよび緑膿菌PAO1-YdeH株を用いたアラビノース勾配群プレートを用いて研究される。

この勾配温板は、二層媒体を順次固化させることにより調製される(図1B)。最下層は、インデューサーと共に添加された培地を含み、支柱状のペトリ皿の片面に注がれる。最下層の固化に際し、シャーレは平坦な表面に戻り、そこでインデューサを含まない媒体を含む上層がプレートの反対側から添加される。スウォームプレートが完全に固化した後、固定レイアウトに従ってウォームプレートに穴を開けることによって(図1C)、または媒体硬化プロセス中にペグを含むプレートカバーの3Dプリントモデルを使用してウェルをインプリントすることによって(補足図S1)、等尺的に配列された保持ウェルが生成される。ゲルイメージングシステムは、異なる時点での群れ形態をキャプチャするために使用されます(図2)。ImageJソフトウェアを使用した表面スウォーミングの解析(補足図S2)は、表面スウォーミングプロセスの定量的結果を提供します(図3)。

したがって、我々は、誘導物質の濃度範囲内で表面群動運動性を試験する簡単な方法を提案する。この方法は、誘導物質を最下層培地に混合することによって他の誘導物質の複数の濃度応答を試験するために使用することができ、他の運動性種(例えば、 枯草菌、 サルモネラ・エンテリカ、 プロテウス・ミラビリス、 エルシニア・エンテロコリチカ)に適用することができる。このアプローチは、単一の化学誘導物質をスクリーニングするための信頼できる定性的および定量的結果を提供することができ、より多くの化学誘導物質を評価するために別々のプレートを使用することができる。