该协议描述了一种带有可更换盖子(R.MIW)的新型乳腺成像窗口。植入R.MIW后的活体显微镜检查允许在不同发育阶段以细胞分辨率对健康和患病的乳腺进行纵向和多日成像。
乳腺的分支结构是高度动态的,出生后经历几个生长和重塑阶段。活体显微镜检查与皮瓣手术或成像窗口植入相结合,已被用于研究不同发育阶段健康乳腺的动力学。大多数乳腺成像技术仅限于数小时至数天的时间范围,而大多数乳腺重塑过程发生在数天至数周的时间范围内。为了研究乳腺重塑,需要允许在更长的时间范围内光学访问感兴趣组织的方法。在这里,描述了带有可更换盖子(R.MIW)的钛乳腺成像窗口的改进版本,该窗口允许以细胞分辨率对乳腺进行高分辨率成像长达数周。重要的是,R.MIW在活体成像实验的整个持续时间内提供组织通路,因此可用于局部组织操作,标记,药物管理或图像引导的显微切割。综上所述,R.MIW能够高分辨率表征乳腺发育,体内平衡和疾病期间的细胞动力学。
乳腺上皮是哺乳动物中存在的独特分泌器官,它产生和分泌乳汁以滋养后代。在整个生命中,乳腺经历多轮的发育和生长,伴随着组织的结构和功能变化1。根据发育阶段,有助于组织重塑的细胞类型以及导管树内的位置是不同的。
多光子活体显微镜(IVM)允许在天然和最小扰动设置2,3,4中研究体内乳腺细胞动力学。为了获得对乳腺的视觉访问,在乳腺发育的不同阶段,已经发表了几种临时的离体或皮瓣成像技术,包括青春期4,5,6,7,成年期2,8,哺乳期9,10,11,12和肿瘤动力学13,14,15.虽然这些技术导致乳腺细胞动力学的高空间和时间分辨成像,但时间范围仅限于数小时,而大多数乳腺重塑过程需要数天至数周。因此,需要允许在更长的时间范围内光学访问感兴趣组织的方法。多年来,已经开发了几种永久性成像窗口用于乳腺肿瘤成像15,16,17,18,包括钛乳腺成像窗口(MIW)2,3,19。虽然对研究乳腺肿瘤生长非常有用,但健康乳腺结构的可视化仍然局限于几天。最近,开发了一种柔性硅成像窗口,可以在20周内可视化耻骨乳腺。然而,乳腺嵌入富含脂肪细胞的脂肪垫中,这导致广泛的光散射,从而导致乳腺导管结构的可见性有限。因此,始终需要更好的成像条件来可视化乳腺中长时间的组织动力学。无论是经典的MIW还是柔性硅窗口都不允许在成像之前进行组织操作或优化物理组织位置,因为窗口在手术和植入后形成一个封闭的系统。因此,在较长的时间内,对下层乳腺组织的最佳光学通路可能会被排除在外。相比之下,皮瓣技术确实允许在成像过程中优化和重新定位组织,并且皮瓣可以重复多次2。然而,只有在手术之间分配足够的时间(至少7天)以允许皮肤恢复时,才有可能通过皮瓣进行重复成像,因此最适合在更长的时间尺度上研究过程。此外,建议不要多次进行此程序,因为它具有侵入性,并且在伤口闭合时感染和疤痕的风险很大。
为了克服这些限制,即确保长时间以高频进行最佳成像条件,同时允许组织操作,设计了一种带有可更换盖子(R.MIW)的改进钛版本MIW,以可视化多天至第2 周的健康病变乳腺(图1A,R.MIW是定制的,以提供最佳的组织通路,在整个IVM实验期间实现直接的组织操作,从而允许在正确的时间和地点长时间内可视化乳腺。当闭合时,R.MIW形成一个与经典MIW相当的气密系统(图1C)。当在无菌条件下打开时,R.MIW允许局部组织操作以改善光学可及性,并且还能够局部施用物质,例如途径抑制剂或激动剂,注射不同感兴趣的细胞类型,例如癌细胞或免疫细胞群,或添加组织标记染料。在成像过程之间的任何时刻都可以打开盖子,而不会对下层组织造成损害。
图 1:带有可更换盖的乳腺成像窗口的设计。(A) 乳腺成像窗口可更换盖子的顶视图和侧视图,将 10 mm 盖玻片粘在环上。(B)乳腺成像窗口的顶视图和侧视图,由外环和内环组成,中间有一个凹槽,用于使用钱包串缝合线将窗口固定在小鼠的皮肤内。外圈有一个小凹槽,适合盖子的四个凸起(臂)。(三)展示盖子开启和关闭机制的卡通和图片。倾斜的投影确保盖子固定在窗框内。此图已从 Messal 等人那里修改而来。
该协议描述了R.MIW的设计和植入程序,以及一种纵向IVM策略,用于以细胞分辨率重新审视相同的乳腺导管及其可视化。R.MIW允许在各种荧光报告小鼠模型中跟踪乳腺不同发育阶段的细胞分裂和形态变化。综上所述,R.MIW有助于在乳腺发育,体内平衡和疾病期间对细胞动力学进行高分辨率表征。
R.MIW允许在其天然和最小破坏环境中对健康和患病的乳腺进行纵向成像,并允许在不同发育阶段重复观察乳腺。R.MIW设计允许在实验过程中的任何时间点打开窗口。对目标组织的长期视觉访问可能受到阻碍,例如,由于盖玻片上细胞碎片的积累。在这种情况下,可以在成像之前或之后立即打开R.MIW,以清洁整个可见组织区域和盖子。可拆卸的盖子还允许操作组织以及物质的局部应用,例如特定的抑制剂和疗法,标记染料或感兴趣的特定细胞类型。
该方法克服了前面描述的乳腺皮瓣程序4,7,8,13的局限性,这些程序仅限于一个成像过程,并且可以可视化诸如分支形态发生(图5),稳态组织更新(图6)或细胞水平上的肿瘤生长等过程(图3B).然而,与此同时,R.MIW允许在成像会话之间对组织进行局部操作,与先前发布的MIW3,18和所有其他成像窗口20,22相比,R.MIW是R.MIW的重要资产。打开R.MIW时,重要的是要始终保持无菌状态,以防止任何感染源。在无菌环境中打开R.MIW的能力允许在每次成像之前优化成像条件,从而大大改善了对感兴趣组织的长期视觉访问。具体而言,在嵌入富含脂肪细胞的基质中的乳腺中,这具有很大的价值。此外,可更换的盖子可以独特地实现治疗剂,不同细胞类型,标记染料,图像引导的显微切割或组织的任何其他局部操作的局部施用,而无需终止IVM实验。例如,为了研究肿瘤的发生,只要可以通过R.MIW环获得该ROI,就可以在确定的IVM时间点和精确的乳腺位置将特定的癌细胞群直接注射到导管树或基质中。为了研究肿瘤进展,可以在IVM会话期间对特定的癌细胞群(在特定位置,特定微环境中或具有特定行为)进行光标记,然后在打开R.MIW后使用荧光解剖显微镜进行微解剖。分离的细胞可以进一步处理用于下游分析,例如(单细胞)mRNA测序。通过使用这种方法,可以将体内细胞行为与分子表达谱相结合。R.MIW实现的局部药物给药的优势允许在治疗前和治疗后直接对组织进行成像。从成像盒中取出小鼠并随后在打开R.MIW盖子后进行局部药物给药所需的间隔可以在几分钟内完成,这允许立即相位捕获速效药物。
我们表明,通过R.MIW的乳腺IVM与许多不同的荧光报告小鼠模型兼容。富含脂肪的环境很难成像,因此建议使用明亮的荧光基团。然而,如图所示,在最佳成像条件下,即使是不太亮的荧光团(如mCFP)也可以通过R.MIW可视化。不可避免地,脂肪垫将排除更深的导管结构的成像,并将成像限制在更浅的导管。在每个IVM实验开始时的低分辨率概述图像将有助于识别感兴趣的导管结构,这些结构对于高分辨率成像来说足够浅。局部组织操作、结缔组织切除或打开 R.MIW 后重新定位脂肪组织可以针对被脂肪组织覆盖的特定 ROI 优化 IVM。与之前的所有窗口设计相比,这是一个重要的优势,以前的窗口设计不允许执行这些操作,并且需要完全删除窗口本身。具体而言,对于腹股沟淋巴结的可视化,建议轻轻地去除上覆的脂肪组织,这减少了光散射并实现了高分辨率成像。在操作组织时,始终保持无菌状态并防止出血或对组织的严重损伤,因为它们可能会影响IVM实验期间正在研究的过程。
R.MIW由钛制成,钛是一种在临床实践中通常用于替代硬组织(如关节或骨板)的材料。钛与钢窗相比有几个优点,包括其轻质和惰性特性21。最近,其他几种材料被用于生成新的成像窗口类型,包括柔性硅窗口20。与R.MIW相比,柔性窗口不需要任何缝合线即可植入,几乎适用于任何解剖位置,特别是在柔软和脆弱组织的情况下。硅窗口对动物运动的影响最小,因为它们具有轻质和可变形的性质,可能更适合研究快速组织扩张和生长的实验20。与钛版本相比的另一个优点是硅窗口与其他成像方式兼容,包括磁共振成像20,27。但是,重要的是要记住,物镜针对0.17毫米玻璃盖玻片进行了优化。此外,乳腺组织容易受到呼吸运动的影响,使用柔性窗口很难限制呼吸运动,尤其是在使用倒置显微镜时。通过R.MIW设计和R.MIW在成像盒嵌体中的固定,可以最大限度地减少呼吸伪影。因此,使用建议的R.MIW设置获取的图像不会因呼吸伪影而失真。然而,可以发生组织定位的轻微漂移,这通常是渐进的,并且可以通过使用采集后运动校正软件28来校正。随着IVM技术2,20的工具箱的增加,每个实验的具体要求最终将确定感兴趣的组织的 体内 可视化的最佳方式。不同的窗口设计具有不同的优缺点,并且根据研究问题,可用的显微镜设置,所需的空间和时间分辨率以及研究过程的总时间跨度,需要确定最佳方法。
总之,R.MIW有助于在多天至几周内对乳腺发育,体内平衡和疾病期间的细胞动力学进行高分辨率表征。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了法兰德斯研究基金会(博士资助基础研究11L7222N给M.C.),勃林格殷格翰基金会(博士奖学金给C.L.G.J.S),EMBO博士后奖学金(授予ALTF 1035-2020给C.L.G.J.S.)和约瑟夫·施泰纳博士奖(授予J.v.R)。支持。
0.9% NaCl | BD | 306573 | Other brands available |
10 mm round coverglass | Fisher scientific | 10696365 | Other brands available |
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Buprenorphine (Vetergesic®) | Ecuphar | NA | |
Cotton tips (sterile) | Fisher scientific | 13113743 | Other brands available |
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