卡利内克特氏菌中神经肽的多方面质谱研究

神经系统是复杂的，需要一个神经元网络来传递整个生物体的信号。神经系统协调感觉信息和生物反应。信号传输中涉及的复杂和复杂的相互作用需要许多不同的信号分子，如神经递质，类固醇和神经肽。由于神经肽是最多样化和最有效的信号分子，在激活对压力和其他刺激的生理反应中起关键作用，因此确定它们在这些生理过程中的特定作用是有趣的。神经肽功能与其氨基酸结构有关，这决定了迁移性，受体相互作用和亲和力¹。诸如组织化学之类的技术很重要，因为神经肽可以在组织的不同区域合成，储存和释放，并且电生理学已被用于研究神经肽结构和功能^2，3，4，但这些方法受到通量和特异性的限制，以解决神经肽的巨大序列多样性。

质谱（MS）能够对神经肽结构和丰度进行高通量分析。这可以通过不同的MS技术进行，最常见的是液相色谱 – 电喷雾电离MS（LC-ESI-MS）⁵ 和基质辅助激光解吸/电离MS（MALDI-MS）⁶。利用高精度的质量测量和MS片段化，MS提供了在没有 先验 知识的情况下将氨基酸序列和翻译后修饰（PTM）状态分配给复杂混合物中的神经肽的能力，以帮助确定其功能^7，8。除定性信息外，MS还通过无标记定量（LFQ）或基于标记的方法（如同位素或等压标记）实现神经肽的定量信息⁹。LFQ的主要优点包括其简单性，分析成本低，样品制备步骤减少，可以最大限度地减少样品损失。然而，LFQ的缺点包括仪器时间成本增加，因为它需要多次技术重复来解决运行间变异性的定量误差。这也导致准确量化微小变异的能力下降。基于标记的方法受到的系统变化较小，因为可以使用各种稳定同位素对多个样品进行差异标记，组合成一个样品，并同时通过质谱分析。这也增加了通量，尽管同位素标记可能非常耗时且成本高昂，用于合成或购买。全扫描质谱（MS1）光谱复杂性也随着多重检测的增加而增加，这减少了能够被分割并因此被鉴定的独特神经肽的数量。相反，等压标记不会增加MS1水平的光谱复杂性，尽管它为低丰度分析物（如神经肽）带来了挑战。由于等压定量是在片段离子质谱（MS2）水平上进行的，因此低丰度神经肽可能无法定量，因为可以选择更丰富的基质成分进行片段化，并且选择的那些可能没有足够高的丰度来量化。通过同位素标记，可以对每个鉴定的肽进行定量。

除了鉴定和定量外，MS还可以通过MALDI-MS成像（MALDI-MSI）¹⁰获得定位信息。通过在样品表面上对激光进行光栅，可以将MS光谱编译为每个 m / z 值的热图图像。绘制不同区域不同条件下瞬时神经肽信号强度的图谱可以为功能测定¹¹提供有价值的信息。神经肽的定位尤其重要，因为神经肽功能可能因位置¹²而异。

神经肽在 体内 的丰度低于其它信号分子，例如神经递质，因此需要灵敏的检测方法¹³。这可以通过去除更高丰度的基质成分来实现，例如脂质^11，14。与常见的蛋白质组学工作流程相比，需要对神经肽分析进行其他考虑，主要是因为大多数神经肽组学分析忽略了酶消化。这限制了神经肽数据分析的软件选项，因为大多数都是使用基于蛋白质组学数据和肽检测通知的蛋白质匹配的算法构建的。然而，许多软件如PEAKS¹⁵ 由于其 从头 测序功能而更适合神经肽分析。从提取方法到MS数据分析，神经肽的分析需要考虑几个因素。

这里描述的方案包括用于样品制备和二甲基同位素标记，数据采集以及通过LC-ESI-MS，MALDI-MS和MALDI-MSI对神经肽进行数据分析的方法。通过来自几个实验的代表性结果，证明了这些方法鉴定，定量和定位来自蓝蟹 Callinectes sapidus的神经肽的效用和能力。为了更好地理解神经系统，通常使用模型系统。许多生物体没有完全测序的基因组，这阻碍了肽水平的全面神经肽发现。为了减轻这一挑战，包括一种用于鉴定新型神经肽和转录组挖掘的协议，以生成没有完整基因组信息的生物体的数据库。这里介绍的所有方案都可以针对任何物种的神经肽样品进行优化，并应用于任何内源性肽的分析。