Summary

Diferenciación robusta de iPSCs humanas en una población pura de adipocitos para estudiar trastornos asociados a adipocitos

Published: February 09, 2022
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Summary

El protocolo permite la generación de una población de adipocitos puros a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). El ácido retinoico se utiliza para diferenciar las iPSC en células madre mesenquimales (MSC) que se utilizan para producir adipocitos. Luego, se utiliza un enfoque de clasificación basado en la tinción de rojo del Nilo para obtener adipocitos puros.

Abstract

Los avances recientes en la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) han permitido la generación de diferentes tipos de células, incluidos los adipocitos. Sin embargo, los métodos de diferenciación actuales tienen baja eficiencia y no producen una población homogénea de adipocitos. Aquí, evitamos este problema mediante el uso de un método basado en retinoico totalmente trans para producir células madre mesenquimales (MSC) en alto rendimiento. Al regular las vías que gobiernan la proliferación, supervivencia y adhesión celular, nuestra estrategia de diferenciación permite la generación eficiente de cuerpos embrionarios (EB) que se diferencian en una población pura de MSC multipotentes. El alto número de MSCs generadas por este método proporciona una fuente ideal para generar adipocitos. Sin embargo, la heterogeneidad de la muestra resultante de la diferenciación de los adipocitos sigue siendo un desafío. Por lo tanto, utilizamos un método basado en rojo del Nilo para purificar los adipocitos maduros que contienen lípidos mediante FACS. Esta estrategia de clasificación nos permitió establecer una forma confiable de modelar los trastornos metabólicos asociados a los adipocitos utilizando un grupo de adipocitos con heterogeneidad reducida de la muestra y funcionalidad celular mejorada.

Introduction

Las células madre mesenquimales (MSC) actúan como un recurso transitorio eficaz para producir células de origen mesodérmico como adipocitos, osteocitos y condrocitos, que podrían usarse para modelar sus respectivos trastornos genéticos. Sin embargo, los enfoques anteriores se basaron en la obtención de estas MSC a partir de tejidos adultos 1, lo que impuso el desafío de obtenerlas en grandes cantidades de los donantes, y la limitación de mantenerlas funcionalmente viables en condiciones de cultivo in vitro subóptimas 1,2. Estos obstáculos han producido una gran demanda de contar con un protocolo para generar MSCs in vitro. Las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) pueden ser utilizadas como una valiosa fuente de MSCs, exhibiendo características MSC 3,4,5. Las MSC derivadas de iPSCs se pueden utilizar como una opción terapéutica en varias enfermedades. Además, la capacidad de las MSC derivadas de iPSCs para generar adipocitos, las convierte en un valioso modelo humano in vitro para estudiar la adipogénesis humana, la obesidad y los trastornos asociados a los adipocitos.

Los protocolos actuales de diferenciación de los adipocitos se pueden clasificar en dos grupos, uno que implica la diferenciación de los adipocitos utilizando cócteles químicos o basados en proteínas que dan un rendimiento resultante de 30%-60%6,7,8,9, mientras que el otro implica la manipulación genética para la inducción robusta de factores de transcripción clave que rigen el desarrollo de los adipocitos para dar un rendimiento del 80%-90%10, 11. Sin embargo, la manipulación genética no recapitula el proceso natural de diferenciación de los adipocitos, y a menudo enmascara los paradigmas sutiles que llegan durante la adipogénesis, haciéndola ineficaz para fines de modelado de enfermedades12,13. Por lo tanto, presentamos una forma de clasificar los adipocitos maduros derivados químicamente de los inmaduros marcando fluorescentemente los adipocitos que contienen lípidos utilizando rojo del Nilo.

Aquí presentamos un protocolo que involucra la incubación transitoria de cuerpos embrioides (EB) derivados de iPSCs con ácido todo-trans retinoico para producir un alto número de MSCs de rápida proliferación, que podrían ser utilizados para generar adipocitos14. También presentamos una forma de clasificar los adipocitos maduros derivados químicamente del grupo de diferenciación heterogénea marcando fluorescentemente sus gotas de lípidos utilizando un colorante lipofílico; Rojo del Nilo. Esto permitiría la generación de una población pura de adipocitos maduros con funcionalidad mejorada para modelar con precisión los trastornos metabólicos asociados a los adipocitos.

Protocol

El estudio ha sido aprobado por el comité ético de investigación institucional apropiado y realizado siguiendo los estándares éticos establecidos en la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores o estándares éticos comparables. El protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de HMC (no. 16260/16) y QBRI (no. 2016-003). Este trabajo también está optimizado para hESCs como H1 y H9. Se obtuvieron muestras de sangre de individuos sanos con pleno consentimiento informado. Las…

Representative Results

Esquema y morfología de las células durante la diferenciación mesenquimal: La diferenciación de iPSCs en MSCs implica varias etapas de desarrollo que abarcan la formación de EB, la diferenciación de MSC y la expansión de MSC (Figura 1). Durante estas etapas de desarrollo, las células adquieren una morfología diversa debido a los diferentes productos químicos estimulantes a los que están sometidas. Al iniciar la diferenciación, las células están en suspensión y se espera que se…

Discussion

Este protocolo tiene una importancia primordial debido a su capacidad para proporcionar MSC en alto rendimiento y eficiencia. Esta producción a gran escala de MSC fue posible gracias a la incubación transitoria de EB derivadas de iPSCs con 10 μM de RA14,15. El tratamiento transitorio con 10 μM de AR mejoró el rendimiento de MSC de 11,2 a 1542 veces14,15, siendo este protocolo aplicable tanto en iPSCs…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por una subvención del Fondo Nacional de Investigación de Qatar (QNRF) (Subvención No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi fue apoyada por la beca GSRA del Fondo Nacional de Investigación de Qatar (QNRF).

Materials

Adiponectin Abcam ab22554 Adipocyte maturation marker
anti-CD105 BD Pharmingen 560839 MSC differentiation marker
anti-CD14 BD Pharmingen 561712 MSC differentiation marker
anti-CD19 BD Pharmingen 555415 MSC differentiation marker
anti-CD34 BD Pharmingen 555824 MSC differentiation marker
anti-CD44 abcam ab93758 MSC differentiation marker
anti-CD45 BD Pharmingen
560975
MSC differentiation marker
anti-CD73 BD Pharmingen 550256 MSC differentiation marker
anti-CD90 BD Pharmingen 555596 MSC differentiation marker
bFGF R&D 233-FP MSC culture media supplement
C/EBPA Abcam ab40761 Adipocyte maturation marker
Dexamethasone Torics 1126 Adipocyte differentiation media supplement
FABP4 Abcam ab93945 Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum ThermoFisher 10082147 MSC culture media supplement
Glutamax ThermoFisher 35050-061 MSC culture media supplement
IBMX Sigma Aldrich I5879 Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin Sigma Aldrich I7378 Adipocyte differentiation media supplement
Insulin Sigma Aldrich 91077C Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM ThermoFisher 12660012 Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM ThermoFisher 11885084 MSC culturing media
Matrigel Corning 354230 Coating matrix
MEM-alpha ThermoFisher 12561056 Adipocyte differentiation media
Nilered Sigma Aldrich 19123 Sorting marker for adipocyte
Penicillin ThermoFisher 15140122 MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline ThermoFisher 14190144 wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer Thermo Fisher 28358 wash buffer
PPARG Cell Signaling Technology 2443 Adipocyte maturation marker
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Dissociation reagent
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625 MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor Tocris 1254/10 hPSC culture media supplement
Roziglitazone Sigma Aldrich R2408 Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex ThermoFisher A334901 hPSC culture media
Triton Thermo Fisher 28314 Permebealization reagent
Trypsin ThermoFisher 25200072 Dissociation reagent
Tween 20 Sigma Aldrich P7942 Wash buffer

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Citer Cet Article
Aghadi, M., Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders. J. Vis. Exp. (180), e63311, doi:10.3791/63311 (2022).

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