Визуализация цитоскелет-зависимого трафика липидсодержащих органелл в эмбрионах дрозофилы
Summary
У раннего эмбриона дрозофилы многие органеллы подвижны. В принципе, они могут быть изображены вживую с помощью специальных флуоресцентных зондов, но яичная скорлупа предотвращает прямое нанесение на эмбрион. Этот протокол описывает, как вводить такие зонды с помощью микроинъекции, а затем анализировать объемное движение органелл с помощью велоциметрии изображения частиц.
Abstract
Ранние эмбрионы дрозофилы представляют собой большие клетки, содержащие широкий спектр обычных и специфических для эмбрионов органелл. В течение первых трех часов эмбриогенеза эти органеллы подвергаются драматическим движениям, приводимым в действие цитоплазматическому потоку на основе актина и моторному трафику вдоль микротрубочек. Разработка множества небольших органелл-специфических флуоресцентных зондов (FP) позволяет визуализировать широкий спектр различных липидсодержащих структур в любом генотипе, что позволяет получать живую визуализацию без необходимости генетически закодированного флуорофора. Этот протокол показывает, как вводить жизненно важные красители и молекулярные зонды в эмбрионы дрозофилы для мониторинга трафика конкретных органелл с помощью живой визуализации. Этот подход демонстрируется маркировкой липидных капель (ЛД) и отслеживанием их объемного движения с помощью велоциметрии изображения частиц (PIV). Этот протокол обеспечивает стратегию, поддающуюся изучению других органелл, включая лизосомы, митохондрии, везикулы желтка и ER, а также для отслеживания движения отдельных ЛД вдоль микротрубочек. Использование коммерчески доступных красителей приносит преимущества разделения на фиолетовые/синие и дальние красные области спектра. Путем мультиплексной совместной маркировки органелл и/или цитоскелетных элементов с помощью микроинъекции все генетические ресурсы дрозофилы доступны для исследований незаконного оборота без необходимости введения флуоресцентно меченых белков. В отличие от генетически закодированных флуорофоров, которые имеют низкий квантовый выход и легко отбеливаются, многие из доступных красителей позволяют быстро и одновременно захватывать несколько каналов с высоким выходом фотонов.
Introduction
Жизненно важные красители и молекулярные зонды являются мощными инструментами для изображения конкретных клеточных структур и живых органелл. У эмбриона дрозофилы многие различные органеллы демонстрируют цитоскелетную локализацию 1,2,3,4, но применение этих небольших молекул является сложной задачей, потому что яичная скорлупа непроницаема для многих из них. Этот протокол описывает метод использования флуоресцентных зондов (FP) в живых эмбрионах с помощью микроинъекции с целью обнаружения крупномасштабного трафика органелл. Процедура включает в себя приготовление инъекционного раствора, сбор яйцеклеток и подготовку эмбрионов, микроинъекцию, визуализацию и анализ изображений.
Драматические пространственные перестройки органелл распространены во многих ооцитах животных, яйцеклетках и эмбрионах, отчасти из-за большого размера этих клеток. Например, в эмбрионе дрозофилы липидные капли (ЛД) и везикулы желтка движутся к центру эмбриона непосредственно перед клеточной протоклетизацией5. Это движение зависит от микротрубочек и оставляет область ~ 40 мкм по всей периферии эмбриона, истощенного двумя органеллами. На более ранних стадиях расщепления многие органеллы транспортируются цитоплазматическими потоками, которые управляются сокращениями на основе актин-миозина на поверхности эмбриона6. Хотя эмбрионы многих видов демонстрируют сходные перегруппировки, эмбрион дрозофилы особенно подходит для наблюдения за этими процессами путем визуализации, потому что он развивается внешне при стандартной лабораторной «комнатной температуре», относительно прозрачен, достаточно мал, чтобы поместиться на большинстве микроскопов, и им можно манипулировать с помощью мощных генетических инструментов.
Для некоторых органелл доступны флуоресцентно помеченные белки, которые специально маркируют эти структуры. Например, ЛСД-2 (также известный как dPLIN2) представляет собой белок, который в эмбрионах специфически нацелен на ЛД7. Доступны линии мух, которые несут либо индуцируемые трансгены, кодирующие слияние между зеленым флуоресцентным белком (GFP) и LSD-28, либо генную ловушку, в которую желтый флуоресцентный белок (YFP) вставляется в кодирующую область эндогенного гена LSD-2 9,10. Однако этот подход имеет ограничения, в том числе то, что эти синтезированные белки имеют низкий квантовый выход и имеют тенденцию легко отбеливаться. Кроме того, маркировка нескольких различных структур одновременно может быть сложной задачей: для многих органелл в настоящее время доступен только один тип флуоресцентной метки (часто GFP или mCherry), поэтому визуализация двух органелл одновременно может потребовать новых трансгенов или вставок; кроме того, даже если доступны совместимые метки, введение их в один штамм может потребовать трудоемких крестов. Это также делает использование многих мощных генетических ресурсов менее удобным, например, если два маркера органелл, драйвер Gal4 и индуцируемая конструкция РНКI должны присутствовать в одной матери.
В принципе, эти ограничения могут быть преодолены с использованием FP, включая жизненно важные красители (например, LysoTracker для маркировки лизосом), молекулярные зонды (например, SiR-тубулин для маркировки микротрубочек) и флуоресцентно меченые биологические молекулы (например, C12 BODIPY для зондирования метаболизма жирных кислот11). От использования в культивируемых клетках они, как правило, хорошо проверены как мощные инструменты для исследования клеточной биологии. FP универсальны, обладают превосходными фотоспособностями и совместимы с флуоресцентными белками. Несколько красителей могут быть смешаны и применены одновременно, часто с преимуществами разделения на фиолетовые / синие и дальние красные области спектра и небольшие сдвиги Стокса, предотвращая кровотечение канала. Небольшие сдвиги Стокса позволяют одновременно захватывать несколько каналов визуализации, что позволяет отслеживать сразу несколько органелл. Наконец, они в равной степени могут быть применены для маркировки органелл в эмбрионах других видов дрозофил или даже других насекомых, где не могут быть доступны флуоресцентно помеченные белки.
Тем не менее, большинство из этих FP не могут пересекать сложную яичную скорлупу эмбриона Drosophila . Он состоит из пяти слоев: трех внешних хорионических слоев (хориона), которые предотвращают механическое повреждение, плюс восковой слой, окружающий вителлиновую мембрану, который создает химический барьер12. Для простоты комбинация воскового слоя и вителлиновой мембраны будет называться «вителлиновой мембраной» ниже. Чтобы обойти яичную скорлупу, этот протокол адаптирует установленный подход к микроинъекции эмбриона для введения FP в эмбрион дрозофилы . Протокол описывает, как контролировать цитоплазматический поток ЛД в эмбрионах стадии расщепления. Он включает в себя подготовку инъекционных игл и клеток для сбора яйцеклеток, процесс сбора яйцеклеток и механическое удаление хориона. В нем рассматривается, как микроинъектировать и изображать эмбрионы и как анализировать объемный поток ЛД с использованием велоциметрии изображения частиц (PIV, адаптированный из6). Он предоставляет рекомендации по устранению неполадок для обеспечения выживания эмбрионов и создания лучшей системы для визуализации. Также обсуждается вопрос о том, как протокол может быть модифицирован для одновременного изображения ЛД и микротрубочек или для применения его для изучения других органелл, включая лизосомы, митохондрии, желтковые везикулы и эндоплазматический ретикулум (ER).
Protocol
Representative Results
Discussion
Эмбрион дрозофилы является мощной и удобной моделью для изучения фундаментальных вопросов клеточной и организменной биологии. Его относительная простота, мощная генетика и небольшие размеры делают его отличной системой для визуализации как клеточных процессов, так и развития. Здесь стандартный протокол микроинъекции адаптирован для обеспечения использования FP у эмбрионов. Этот подход позволяет флуоресцентную визуализацию конкретных клеточных структур без необходимости в генетически закодированных флуорофорах, открывая многие генетические фоны для визуализации. Сочетание нескольких красителей и стратегически выбранных флуоресцентно помеченных белков может открыть многоканальную живую визуализацию, охватывающую весь спектр видимого света.
Критические шаги в протоколе:
Этот протокол использует BODIPY 493/503 для маркировки ЛД. Этот подход может быть легко адаптирован для маркировки других клеточных структур. Для последующего анализа изображения одним из наиболее важных факторов является отношение сигнал/шум, т.е. яркость красителя по сравнению с фоновым сигналом. Лизосомы были успешно сфотографированы (LysoTracker Red, 1 мМ), а также митохондрии (Mitoview 633, 200 мкМ), ER (ER tracker Green, 10 мкМ) и микротрубочки (SiR тубулин, 200 нМ в DMSO), как показано на рисунке 2, рисунок 3, рисунок 4, рисунок 5. Кроме того, везикулы желтка являются автофлуоресцентными и выделяют синий свет при УФ-возбуждении (изображение с использованием 405 нм в качестве длины волны возбуждения (рисунок 6)). Для других красителей стремитесь к тому, чтобы концентрация красителя составляла 100-1000x от того, что было бы необходимо для окрашивания культивируемых живых клеток; это аналогично концентрации исходного раствора, который будет разбавлен в клеточных культуральных средах. Поскольку этот протокол требует инъекции 100 fL, а эмбрион Drosophila составляет примерно 9 nL в объеме18, эти концентрации красителя будут усредняться до внутренней эмбриональной концентрации менее 1/100 от того, что присутствует в клеточной культуральной среде. Временно местная концентрация будет выше в месте инъекции, что наиболее актуально для FP, которые плохо диффундируют (т.е. митохондриальные красители и SiR-тубулин). Для этих FP начните с рекомендуемых высоких концентраций; если наблюдается неожиданная смерть, последовательно разбавляйте в два раза до тех пор, пока не будет достигнут приемлемый компромисс между выживаемостью и силой сигнала.
При совместном введении нескольких красителей оба красителя должны либо находиться в одном растворителе, либо и растворители, и красители должны быть совместимы со смесью (концентрации спирта, превышающие ~10%, не рекомендуются).
Качество игл имеет важное значение для успеха этой процедуры, так как наконечник должен быть как можно тоньше. В противном случае повреждение от инъекционной раны может поставить под угрозу последующее развитие эмбриона. Поскольку коммерческие съемники игл различаются, важно следовать рекомендациям производителя и опробовать несколько параметров вытягивания, пока не будет достигнута желаемая форма. Крайне важно выполнить этап контроля качества 1.1.3, так как работа с треснувшим, зазубренным или большим отверстием наконечника иглы сделает успешную инъекцию более сложной или даже невозможной.
Эмбрион должен быть частично высушен, чтобы во время инъекции можно было добавить дополнительные объемы жидкости. Если эмбрион недостаточно высушен, игла не войдет легко, и цитоплазма будет выплескиваться при проникновении иглы или при введении раствора. Если эмбрион чрезмерно высушен, он будет выглядеть сдутым и не будет развиваться должным образом. Точное время сушки зависит от местных условий, например, влажности воздуха, и может меняться изо дня в день. Он должен определяться эмпирически для каждой сессии.
Способность эмбриона выживать после микроинъекции критически зависит от качества иглы, правильного высыхания и ограничения объема инъекции менее чем 1 пл (в идеале 100 л). До тех пор, пока эти параметры оптимизированы, при введении описанных красителей в рекомендуемых концентрациях не проявляется значительной токсичности. Если эмбрионы выживают на этапах высыхания и инъекции, они, как правило, успешно развиваются в расширение зародышевой полосы, исключением являются микротрубочки и зонды ER, которые вызвали дефекты клеточности на высоких уровнях (инъекция 100 fL концентрации запаса каждого). Тестирование не выявило явных дефектов развития, когда ДМСО, вода и смеси этих двух веществ вводились в рекомендуемых объемах, с выживаемостью эмбриона через расширение микробной полосы ~ 75% или более. Объемы инъекций более 1 пЛ вызывали дефекты, и эмбрионы, введенные с объемами ~ 4 пЛ, развивались менее чем за 1 ч. Поэтому объемы инъекций должны быть низкими, а это означает, что концентрации красителя должны быть высокими.
Как правило, инъекции вдоль бокового края эмбриона рекомендуются, поскольку они приводят к наименьшему повреждению. Тем не менее, место инъекции, возможно, потребуется скорректировать в зависимости от диффузионных свойств используемых FP. BODIPY 493/503 и LysoTracker диффундируют быстрее по всему эмбриону, чем Lipid Spot 610 (еще один краситель для маркировки ЛД), в то время как SiR-тубулин и Mitoview 633 никогда полностью не диффундируют по эмбриону (визуализация уже через 7 ч после инъекции). Таким образом, может потребоваться инъекция в интересующее место или рядом с ним. При инъекции в переднюю или заднюю область рекомендуется особенно тонкая игла.
Получение изображений опирается на конфокальную микроскопию для оптического сечения и разрешения малых органелл и всех компонентов цитоскелета. Методы, требующие анализа многих изображений (например, STORM или PALM), не будут работать, потому что эмбриональное содержимое находится в движении, а флуорофоры не оптимизированы для переключения фотографий. Эпифлуоресцентной микроскопии не хватает бокового и осевого разрешения, чтобы разглядеть большинство органелл и более мелких клеточных структур. По этим причинам настоятельно рекомендуется использовать конфокальный микроскоп или использовать технологию световых листов.
Воспроизводимость анализа изображений в значительной степени зависит от последовательных данных изображения. Для получения наибольших шансов на успех требуется оптимизация техники впрыска и получения изображения. Создание и практика техники, в которой краситель (красители), представляющий интерес, место инъекции, возраст эмбриона, объем инъекции и установка приобретения являются согласованными, будет генерировать наиболее надежные данные для анализа изображений.
Модификации и устранение неполадок метода
Этот протокол демонстрирует метод анализа объемного потока ЛД в эмбрионах стадии расщепления с использованием велоциметрии изображения частиц. Тот же подход может быть использован для других органелл, других стадий развития и других методов анализа. Например, на рисунке 2 показан анализ ЛД и кислых органелл, протекающих на синцитиальных стадиях эмбриогенеза, визуализируемых путем совместного введения BODIPY 493/503 и LysoTracker Red. Достигнута дальнейшая успешная визуализация движения ЛД у эмбрионов до 7 ч после оплодотворения; эти эмбрионы сохраняют инъекционную рану, но способны развиваться в течение нескольких часов.
Данные, собранные с использованием этого протокола, использовались для велоциметрии изображений частиц, но доступно много других методов анализа. Например, программы отслеживания частиц, подобные тем, которые находятся в ImageJ, Imaris или ручном отслеживании, могут использоваться для получения скоростей и направленности движущихся структур. Обратите внимание, что большинство таких программ для отслеживания созданы для работы с данными из систем плоских клеточных культур и не всегда хорошо адаптируются к 3D-структурам, таким как эмбрион дрозофилы . Кроме того, для получения данных отслеживания частиц наилучшего качества необходимо будет визуализировать несколько плоскостей Z; это должно быть осуществимо, если время получения стека изображений составляет менее ~2 с. Этот критерий должен быть достигнут на конфокальных вращающихся дисках, решетчатых световых листах и последних лазерных сканирующих конфокальных системах. Однако возможность отслеживания частиц для обильных органелл, таких как ЛД, митохондрии и лизосомы, низка, поскольку количество положительного сигнала в поле зрения слишком велико для современных методов отслеживания. Отслеживание менее обильных структур, таких как ядра или желточные пузырьки, может быть возможным. PIV для анализа потока хорошо работает для ЛД и кислых органелл на стадиях расщепления, потому что обе органеллы движутся свободно. Органеллы, такие как ядра, ER и митохондрии, привязаны к другим клеточным структурам и, таким образом, не движутся свободно и не подходят для программного анализа, который предполагает свободное движение. Исследователь должен выбрать методы, наиболее подходящие для интересующей органеллы.
Во время синцитиальной и клеточной стадий бластодермы ЛД (а также некоторые другие органеллы) движутся по радиально ориентированным микротрубочкам5. Таким образом, можно найти поперечные виды (как на рисунке 5), где одиночные микротрубочки находятся в фокусе на больших расстояниях, что позволяет отслеживать частицы в 2D. Поскольку эти оптические плоскости находятся глубоко внутри эмбриона, общая сила сигнала уменьшается, а отношение сигнал/шум уменьшается.
Для анализа отслеживания визуализация как можно быстрее может выявить важные детали движения и, следовательно, подвижного механизма. Например, липидно-капельное движение представляет собой смесь двух подвижных состояний: медленно-короткого движения (~200 нм/с; среднее расстояние перемещения ~100 нм) и быстрого-длинного движения (~450 нм/с; среднее расстояние перемещения ~1000 нм)19; таким образом, если снимки делаются каждую секунду или даже реже, медленно-короткое состояние становится незаметным. Однако частая визуализация также вызывает отбеливание флуорофоров и фототоксичность. Поэтому условия визуализации должны быть скорректированы в зависимости от конкретного вопроса, который необходимо решить.
Ограничения метода
В зависимости от желаемого красителя способ может быть ограничен совместимостью между растворимостью красителя и токсичностью инъекционного раствора. Спирты, такие как изопропанол и этанол, трудно обрабатывать внутри иглы из-за их более низкой вязкости и, по-видимому, повреждают клеточные компоненты и убивают эмбрион.
Метод также не очень хорошо подходит для визуализации самых ранних этапов эмбриогенеза, потому что для подготовки эмбрионов к инъекции требуется более 30 минут. При комнатной температуре начальные клеточные циклы эмбриона длятся всего ~10 мин каждый; Таким образом, даже если бы кто-то выбрал недавно оплодотворенную яйцеклетку на этапе 5.2.3, первые несколько клеточных циклов уже были бы завершены к тому времени, когда эмбрион будет готов к визуализации.
Освещение светом в УФ/синем диапазоне значительно более фототоксично, чем для более длинных волн. В таких условиях (например, следовать автофлуоресцентным желтку везикулами; Рисунок 6), необходимо ограничить время визуализации (что приводит к более коротким временным рядам) или использовать более низкую мощность лазера (что приводит к снижению отношения сигнал/шум).
После клеточности красители, вводимые в определенное место, имеют тенденцию плохо диффундировать, так как они должны пересекать многие клеточные мембраны. Это ограничивает область наблюдения на более поздних стадиях развития.
Значение метода по отношению к существующим/альтернативным методам
Движение ЛД и других липидсодержащих органелл у ранних эмбрионов может быть визуализировано с помощью генетически закодированных флуорофоров, методов без меток и путем введения FP. Последнее может быть достигнуто путем пермеабилизации вителлиновой мембраны12 или микроинъекционного подхода, обсуждаемого здесь.
Генетически закодированные флуорофоры являются универсальными маркерами, уровни которых обычно хорошо воспроизводимы от эмбриона к эмбриону. Тем не менее, они имеют более низкий квантовый выход и отбеливаются легче, чем FP. Как правило, они доступны только в одной или двух помеченных версиях (например, GFP или mCherry), ограничивая выбор того, какие структуры могут быть изображены одновременно. FP, с другой стороны, часто существуют в большом разнообразии; например, различные липидно-капельные специфические красители доступны с спектрами излучения от Autodot в УФ/синем спектре до Lipidtox и LipidSpot 610 в дальне-красном спектре. FP также могут быть непосредственно применены к любому интересующему штамму и, таким образом, не требуют конструирования штамма, чтобы, например, ввести желаемый маркер органеллы в интересующий мутантный штамм. Это преимущество особенно ярко выражено, когда несколько структур должны быть обозначены одновременно; вместо трудоемких крестов, охватывающих несколько поколений, это может быть достигнуто за один день путем смешивания соответствующих красителей и одновременного введения их. Наконец, если клеточные процессы должны быть исследованы с фармакологическим ингибированием, лекарства и красители могут быть введены вместе.
Методы без меток являются очень мощными подходами для обнаружения конкретных клеточных структур. Например, ЛД могут быть специфически обнаружены у ранних эмбрионов с помощью микроскопии третьей гармонической генерации20 или фемтосекундной микроскопии21 с стимуляцией рамановской потери. Как и FP, эти подходы могут применяться в любом генетическом фоне, и, поскольку они не вызывают обесцвечивания, они потенциально позволяют быстрее получать изображения. Однако они, как правило, ограничены конкретными органеллами и, таким образом, сами по себе не поддерживают мультиплексную визуализацию; они также требуют специализированных микроскопов.
Существует две общие стратегии введения малых молекул в эмбрионы. Одним из них является используемый здесь подход к микроинъекции; другая – химическая (терпеновая) обработка для пермеабилизации вителлиновой мембраны. Последний подход12 менее вовлечен, чем микроинъекция, но также более изменчив от эмбриона к эмбриону. Кроме того, после пермеабилизации защита, обеспечиваемая вителлиновой мембраной, скомпрометирована, и собственно эмбрион доступен для внешней среды, что затрудняет его поддержание в живых. Микроинъекция гораздо реже срывает эмбриональное развитие, чем пермеабилизация. Тем не менее, пермеабилизация рекомендуется, если необходимо одновременно контролировать много эмбрионов, например, для целей скрининга лекарств. Чтобы проследить за движением клеточных структур и получить воспроизводимые ряды изображений, пригодные для анализа изображений, микроинъекция является методом выбора.
Важность и потенциал применения метода в конкретных областях исследований
Эмбрион дрозофилы является важной модельной системой для изучения многих клеточно-биологических процессов и процессов развития 1,5,6. Маркировка органелл флуоресцентными белками внесла большой вклад в понимание того, как развивается ранний эмбрион, как движутся различные органеллы и как такой трафик модулируется в развитии и генетически. Однако их склонность к отбеливанию и проблемы генерации штаммов, в которых несколько органелл помечены разными цветами, ограничивают применение этого подхода. Использование FP, введенных микроинъекцией, решает многие из этих проблем и даже может сочетаться с флуоресцентно помеченными белками. Этот метод позволяет визуализировать множественные органеллы, клеточные структуры и компоненты цитоскелета в любом генетическом фоне. В результате несколько генотипов могут быть сопоставлены с помощью живой визуализации, что позволяет определить влияние мутаций на трафик множественных органелл.
Этот протокол демонстрирует подход к инъекциям FP для эмбрионов Drosophila melanogaster, но в принципе этот подход применяется к любым яйцам насекомых, для которых были установлены методы микроинъекции, включая другие виды Drosophila, сверчков22 и тли23.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Пакини Фромсири, Брайана Дженчика, Цзинхонга (Джеймса) Танга и Роджера Уайта за их комментарии к рукописи. Мы благодарим Патрика Оукса, Стефано Ди Талию и Викторию Денеке за то, что они поделились своим опытом проведения анализа PIV. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения F31 HD100127 (до M.D.K.) и R01 GM102155 (до M.A.W.).
Materials
| AUTODO | abcepta | SM1000a | Stains lipid droplets in violet/blue |
| BODIPY 493/503 | ThermoFisher | D3922 | Stains lipid droplets in green |
| Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite | W.A. Hammond Drierite Company | 21001 | |
| Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base | Zeiss | 4350030000000000 | |
| Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape | Scotch (3M) | – | Sold by many vendors |
| ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide) | ThermoFisher | E34251 | Stains the ER/nuclear envelope |
| Femptotip II | Eppendorf | H129354N | Ready to use |
| Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in | World Precision Instruments | TW100F-4 | Must be pulled |
| Glass coverslip | – | – | Buy the appropriate refractive index for your objective lens |
| Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned | FisherBrand | 12-550-343 | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | |
| Heptane greener alternative anhydrous, 99% |
Sigma-Aldrich | 246654-1L | Heptane is considered toxic by the USA's OSHA |
| Confocal microscope | Leica | Sp5 | Many different types of confocal microscopes will work. |
| LipidSpot 610 | Biotium | #70069 | Stains lipid droplets in far red |
| LysoTracker Red | ThermoFisher | L7528 | Stains lysosomes in red |
| MitoView 633 | Biotium | #70055 | Stains mitochondria |
| Needle loading pipette tips – 20uL microloader tips | Eppendorf | # 5242956.003 | |
| P-1000, Next Generation Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1×1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip. |
| SiR-Tubulin | Cytosketon Inc | CY-SC014 | Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red |
| TransferMan | Eppendorf | 5178 NK | |
| ViaFluor 405 | Biotium | #70064 | Stains microtubules in violet/blue |
References
- Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo. Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).
- Mavor, L. M., et al. Rab8 directs furrow ingression and membrane addition during epithelial formation in Drosophila melanogaster. Development. 143 (5), 892-903 (2016).
- Riggs, B., et al. Actin cytoskeleton remodeling during early Drosophila furrow formation requires recycling endosomal components Nuclear-fallout and Rab11. Journal of Cell Biology. 163 (1), 143-154 (2003).
- Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics. Cell. 92 (4), 547-557 (1998).
- Welte, M. A. As the fat flies: The dynamic lipid droplets of Drosophila embryos. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (9), 1156-1185 (2015).
- Deneke, V. E., et al. Self-organized nuclear positioning synchronizes the cell cycle in Drosophila embryos. Cell. 177 (4), 925-941 (2019).
- Welte, M. A., et al. Regulation of lipid-droplet transport by the perilipin homolog LSD2. Current Biology. 15 (14), 1266-1275 (2005).
- Bailey, A. P., et al. Antioxidant role for lipid droplets in a stem cell niche of Drosophila. Cell. 163 (2), 340-353 (2015).
- Johnson, M. R., et al. H2Av buffering via dynamic sequestration to lipid droplets in Drosophila embryos. Elife. 7, 36021 (2018).
- Lowe, N., et al. Analysis of the expression patterns, subcellular localisations and interaction partners of Drosophila proteins using a pigP protein trap library. Development. 141 (20), 3994-4005 (2014).
- Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. Fatty acid trafficking in starved cells: regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics. Developmental Cell. 32 (6), 678-692 (2015).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Tran, S. L., Welte, M. A. In-vivo centrifugation of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo collection. CSH Protocols. 2007, (2007).
- Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Roberts, D. B. . Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).
- . The Interactive Fly: Stages of Development and Mitotic Domains Available from: https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm (1999)
- Liberzon, A., et al. . OpenPIV/openpiv-python: OpenPIV – Python (v0.22.2) with a new extended search PIV grid option. , (2020).
- Markow, T. A., Beall, S., Matzkin, L. M. Egg size, embryonic development time and ovoviviparity in Drosophila species. Journal of Evolutionary Biology. 22 (2), 430-434 (2009).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Dynein-mediated cargo transport in vivo. A switch controls travel distance. Journal of Cell Biology. 148 (5), 945-956 (2000).
- Debarre, D., et al. Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy. Nature Methods. 3 (1), 47-53 (2006).
- Dou, W., Zhang, D., Jung, Y., Cheng, J. X., Umulis, D. M. Label-free imaging of lipid-droplet intracellular motion in early Drosophila embryos using femtosecond-stimulated Raman loss microscopy. Biophysical Journal. 102 (7), 1666-1675 (2012).
- Barry, S. K., et al. Injecting Gryllus bimaculatus Eggs. Journal of Visualized Experiments. (150), (2019).
- Le Trionnaire, G., et al. An integrated protocol for targeted mutagenesis with CRISPR-Cas9 system in the pea aphid. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 110, 34-44 (2019).
