Мы предоставляем масштабируемые протоколы, охватывающие конструкцию конструкции, транзиторную трансфекцию, а также экспрессию и очистку полноразмерных вариантов белка гентингтина человека в клетках HEK293.
Полноразмерный гентингтин (FL HTT) представляет собой крупный (aa 1-3,144), везде выраженный, полиглутамин (polyQ)-содержащий белок массой примерно 350 кДа. Хотя клеточная функция FL HTT не совсем понятна, мутантное расширение тракта polyQ выше ~ 36 повторов связано с болезнью Гентингтона (HD), причем длина polyQ коррелирует примерно с возрастом начала. Чтобы лучше понять влияние структуры на функцию мутантного HTT (mHTT), требуется большое количество белка. Субмиллиграммная продукция FL HTT в клетках млекопитающих была достигнута с использованием доксициклин-индуцируемой стабильной экспрессии клеточной линии. Тем не менее, производство белка из стабильных клеточных линий имеет ограничения, которые могут быть преодолены с помощью методов транзиторной трансфекции.
В данной работе представлен надежный метод получения низкомиллиграммового количества FL HTT и его вариантов из кодон-оптимизированных плазмид путем транзиторной трансфекции с использованием полиэтиленимина (PEI). Метод является масштабируемым (>10 мг) и последовательно дает 1-2 мг/л клеточной культуры высокоочищенного FL HTT. В соответствии с предыдущими докладами было установлено, что состояние очищенного раствора FL HTT является высокодинамичным; белок имеет склонность к образованию димеров и олигомеров высокого порядка. Ключом к замедлению образования олигомеров является быстрая работа по выделению мономерных фракций из димерных и олигомерных фракций высокого порядка во время эксклюзионной хроматографии размеров.
Эксклюзионная хроматография с многоугольным рассеянием света (SEC-MALS) использовалась для анализа димерного и олигомерного содержания более высокого порядка очищенного HTT. Корреляции между длиной полиQ FL HTT (Q23, Q48 и Q73) и содержанием олигомера не наблюдалось. Конструкция exon1-deleted (aa 91-3,144) показала сопоставимую склонность к олигомеризации к FL HTT (aa 1-3,144). В настоящем описаны способы производства, очистки и характеризации по SEC/MALS-рефракционному индексу (RI), электрофорезу додецилсульфат-полиакриламидного геля натрия (SDS-PAGE), вестерн-блоттингу, native PAGE и Blue Native PAGE.
Болезнь Гентингтона (БГ) является редким нейродегенеративным заболеванием, в первую очередь характеризующимся неустойчивым и непроизвольным двигательным движением, а также когнитивными и психиатрическими изменениями, такими как изменения личности и апатия 1,2. БГ связана с расширением CAG-речевого тракта, расположенного в экзоне 1 гена гентингтина (HTT), до более чем 35 повторов, причем большее количество ЦАГ-повторов коррелирует с более ранним началом заболевания 3,4. Поступательный продукт HTT, белок гентингтина (HTT), участвует в жизнеспособности нейронов и развитии мозга 5,6,7,8,9.
HTT представляет собой каркасный белок, который, как сообщается, участвует в широком спектре клеточных процессов, транспорте пузырьков, делении клеток, цилиогенезе и аутофагии10,11. Однако молекулярный патогенез БГ не совсем ясен, а идентификация ключевых белковых интеракторов, опосредующих патологическое воздействие полиQ-вспененного мНТТ, отсутствует. Некоторые исследования показывают усиление токсической функции от mHTT, обусловленное склонностью к олигомеризации расширенного белка HTT, поскольку агрегаты HTT были идентифицированы в нейронах и глии у пациентов с БГ и животных моделей заболевания 12,13,14,15,16,17 . Чтобы стимулировать исследование функции и структуры вариантов FL HTT и mHTT и снабжать исследователей высококачественными стандартами белка для разработки анализов, необходим надежный и масштабируемый запас однородного рекомбинантного белка.
Из-за своего размера (aa 1-3,144, нумерация основана на длине polyQ Q23), протеолитической нестабильности и склонности к агрегации, FL HTT оказалось трудно экспрессировать и изолировать как растворимый белок. Ранее область экзона 1 (aa 2-90) HTT была экспрессирована и очищена в больших масштабах с использованием различных меток, которые могут увеличить растворимость белка в Escherichia coli 18,19,20. FL HTT был впервые экспрессирован и очищен в системе экспрессии клеток насекомых с использованием бакуловируса21,22, а структуры электронной микроскопии с низким разрешением 30 Å (EM) химически сшитых FL Q23-HTT и Q78-HTT были зарегистрированы23. Исследование структуры HTT получило дальнейшее развитие, когда производство FL Q17, Q46 и Q128-HTT с нативными посттрансляционными модификациями (PTM) было достигнуто в клетках человека с использованием стабильных клеточных линий или систем экспрессии аденовируса24. Эти исследования показывают, что, хотя очищенный HTT в основном существует в мономерном состоянии, он также имеет тенденцию образовывать олигомеры и агрегаты высокого порядка.
Аналитическое ультрацентрифугирование FL Q128-HTT с высокорасширенной областью polyQ дало больше олигомерных и агрегатных фракций, чем белок с нерасширенной областьюpolyQ 24. Используя стабильную клеточную линию, стратегия была успешно адаптирована для стабилизации FL HTT путем совместной экспрессии с партнером по взаимодействию HAP40. Крио-ЭМ-структура комплекса FL HTT и HAP40 была решена со средним разрешением 4 Å с использованием очищенного белкового комплекса (PDB:6EZ8)25. Эта стратегия совместной экспрессии была успешно адаптирована к системе бакуловируса, и ряд высококачественных вариантов HTT с различной длиной polyQ были экспрессированы и очищены от клеток насекомых26. С тех пор в Базу данных белка27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O) было решено и депонировано больше крио-ЭМ структур комплекса HTT с переменными длинами polyQ и структурами HAP40 и более высокого разрешения.
Мы оптимизировали метод трансфекции и экспрессии в клетках HEK293, используя полиэтиленимин (PEI), для быстрой транзиторной экспрессии FL HTT. В качестве доказательства принципа варианты FL HTT, содержащие 23 глутамина (FL Q23-HTT), были сначала очищены и охарактеризованы с использованием модификации способа очистки, описанного ранее24. Этот метод транзиторной трансфекции удобен, высокоэффективный и масштабируемый; он может продуцировать очищенный HTT с выходом 1-2 мг/л, сопоставимый со стабильным методом клеточной линии, о котором сообщается24. Поскольку белок продуцируется в клеточной линии человека, продуцируемый HTT с большей вероятностью будет иметь нативные ПТМ человека при проведении масс-спектрометрического протеомического анализа 11,29,30,31. Были получены миллиграммовые количества вариантов FL Q48-HTT, FL Q73-HTT и exon1-deleted (ΔExon1-HTT), демонстрирующие, что метод переходной экспрессии особенно полезен для быстрого получения альтернативных вариантов HTT без зависимости от трудоемких усилий, необходимых для создания стабильных клеточных линий для производства.
Следующий протокол иллюстрирует стандартный метод, используемый в лаборатории этих авторов для клеточной культуры, трансфекции, очистки белка и характеристики белка после очистки для получения FL Q23-HTT из культуры клеток 2 L. Протокол может быть расширен до более крупных культур или адаптирован для очистки других вариантов HTT. До 10 L клеточных культур FL HTT и различные мутации сайта или усечения гомологов HTT и HTT были успешно выполнены в лаборатории с использованием того же протокола. Очищенный FL HTT содержит высокий процент мономеров наряду с димерами и олигомерами более высокого порядка. Такой же совокупный профиль наблюдается среди выпускаемых вариантов (Q23, Q48, Q73 и исключенный Exon1). Поскольку агрегация может произойти, когда не принимается надлежащий уход, было проведено исследование стабильности состава и замораживания-оттаивания для определения наилучших условий для обработки белка. Также описаны такие методы, как Blue Native PAGE и SEC/MALS-RI, для анализа содержания олигомеров HTT в рамках процесса контроля качества. Чтобы принести пользу исследовательскому сообществу БГ, плазмиды и белки HTT, описанные в этом исследовании, также депонируются в репозитории сообщества БГ в Институте Кориелла (www.coriell.org/1/CHDI).
Здесь мы описываем метод транзиторной трансфекции, экспрессии и очистки для генерации нескольких белков FL HTT с подходящей чистотой и однородностью для использования в качестве стандартов для иммуноанализа и разработки анализа РС, контроля для анализа вестерн-блот и для исследований структурно-функциональных исследований. Этот метод переходной экспрессии является масштабируемым и универсальным и позволяет пользователю генерировать низкомиллиграммовые количества вариантов FL HTT более эффективно, чем использование стабильных клеточных линий или методов на основе вирусов, описанных ранее 21,22,23,24. Как правило, 2-5 мг высокоочищенного FL HTT могут быть получены из 2-литрового продуцирования белка менее чем за неделю с использованием метода переходной экспрессии после построения плазмиды с типичным выходом 1-2,5 мг FL HTT на литр клеточной культуры.
Метод переходной экспрессии, описанный здесь, преодолевает многие препятствия в экспрессии стабильных клеточных линий, такие как длительное время, необходимое для установления клеточных линий, и трудности в хранении и поддержании стабильных клеточных линий. PEI также относительно недорог по сравнению с другими трансфекционными реагентами на рынке, что делает крупномасштабную трансфекцию экономически жизнеспособной. Существуют также ограничения в протоколе: эффективность трансфекции во многом зависит от качества плазмид, оптимального роста клеток и того, насколько хорошо хранится и готовится PEI. Операторы должны проявлять особую осторожность и выполнять контроль качества на этих критических этапах, чтобы избежать резкого падения выходов белка. Смола Anti-FLAG, используемая в протоколе, также относительно дорога и показывает уменьшенный захват FL HTT после нескольких чисток и регенераций. Некоторые исследователи могут счесть более практичным переключиться на другую метку, чтобы обеспечить более надежную регенерацию аффинной смолы.
Различные клеточные линии и условия экспрессии были протестированы для оптимизации уровней экспрессии FL HTT. Клетки HEK293 были выбраны для экспрессии FL HTT из-за высокой экспрессии белка и простоты обработки в формате культуры суспензии, что делает метод пригодным для крупномасштабной экспрессии в шейкерах или биореакторах. Более высокий уровень экспрессии белка FL HTT может быть достигнут при более низких температурах культивирования, таких как 32 ° C, а не при обычной температуре 37 ° C. Возможно, что более низкая температура может замедлить синтез белка и способствовать правильному сворачиванию FL HTT40. Однако это явление не является специфическим для FL HTT или тестируемых клеточных линий. Пониженная температура послетрансфекции широко используется в фармацевтической экспрессии белка в клетках CHO. Хотя механизм не полностью понят, считается, что низкие температуры останавливают клеточный цикл в фазе G1 и отвлекают клеточную энергию на выработку белка41.
Полноразмерный HTT, очищенный от клеток млекопитающих, со-элюируется с шапероном Hsp7024, а этапы промывки Mg-ATP могут удалить белок Hsp70. Интересно, что коэлюированный Hsp70 не наблюдается в FL HTT, очищенном от системы экспрессии клеток насекомых 21,22,23. Это может отражать разницу в PTM FL HTT или реакции белка теплового шока на сверхэкспрессию FL HTT в клетках млекопитающих и насекомых. После того, как рекомбинантный белок был лишен Hsp70, для стабилизации мономерной формы FL HTT требуются неионные моющие средства, такие как CHAPS или DDM.
Состояния олигомеризации вариантов FL HTT были проанализированы с использованием Blue Native PAGE и SEC-MALS. Небольшая доля димерного и олигомерного HTT более высокого порядка присутствовала при анализе либо Blue Native PAGE, либо SEC-MALS. Следует отметить, что олигомеры более высокого порядка, образованные FL HTT, по-видимому, не коррелируют с длиной polyQ, и даже мутант делеции Exon1 демонстрирует аналогичное соотношение олигомер-димер-мономер. Фактические различия в содержании олигомеров среди этих конструкций, вероятно, обусловлены незначительными различиями в производстве и обработке каждой партии. В отличие от агрегатов и фибрилл, образованных HTT Exon1 40,41, олигомеры более высокого порядка FL HTT оставались растворимыми и могли быть проанализированы SEC и Native PAGE.
Очищенный мономерный FL HTT только относительно стабилен. Длительное хранение при 4 °C, короткие инкубации при комнатной температуре или концентрации > 1 мг/мл преобразуют мономерный FL HTT в димерные и более высокоупорядоченные олигомерные формы, даже если в этих условиях не наблюдается видимых осадков. Очищенный мономерный FL HTT, поддерживаемый при ≤1 мг/мл, оставался относительно стабильным при -80 °C в буфере хранения (50 мМ Tris, pH 8,0, 500 мМ NaCl, 5% v/v глицерина, 0,5% мас./об CHAPS и 5 мМ DTT), как описано ранее24. До 6 циклов замораживания-оттаивания FL HTT, приготовленных и хранимых таким образом, не вызывали видимого осаждения белка, хотя небольшой сдвиг в более высокое олигомерное состояние наблюдался SEC-MALS (дополнительный рисунок S2). Образцы также были проанализированы SDS PAGE после повторных циклов замораживания-оттаивания. Видимых осадков не наблюдалось; SDS-PAGE не видел агрегатов или дополнительных продуктов деградации (дополнительный рисунок S3). Долгосрочная стабильность очищенного FL HTT все еще находится в стадии изучения. При отсутствии убедительных долгосрочных данных мы рекомендуем хранить очищенный FL HTT при -80 °C не более 6 месяцев.
Высококачественные, рекомбинантные варианты белка FL HTT и методы их получения пользуются большим спросом у исследовательского сообщества HD. Эти белки используются в качестве иммуноанализа и аналитических стандартов MS, в структурных исследованиях и для разработки новых FL HTT-специфических анализов. Крупномасштабные методы экспрессии переходных процессов, описанные здесь, последовательно производили миллиграммовые количества вариантов FL HTT с чистотой >95%, обеспечивая необходимые инструменты для исследований HTT. Производство десятков миллиграммов высокоочищенных вариантов FL HTT polyQ и других мутантов в поддержку исследований HD стало рутиной.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Департамент фармацевтических наук Государственного университета Нью-Йорка в Буффало за проведение анализа РС HTT. Эта работа была результатом совместных усилий с Фондом CHDI. Мы особенно благодарим Элизабет М. Доэрти; Игнасио Муньос-Санхуан; Дуглас Макдональд, Фонд CHDI; и Рори Кертис, Курия, за их неоценимый вклад в подготовку этой рукописи. Мы также благодарны Мишель Луче, Митре Махмуди и Стефани Фокс за поддержку этих исследований.
100 kDa concentrator-Amicon | Millipore | UFC910096 | Protocol Section Number-6.2.4 |
20x blue native PAGE running buffer | Invitrogen | BN2001 | Protocol Section Number-8.1 |
20x TBS | Thermo Fisher | PI28358 | Protocol Section Number-5.1 |
4x blue native PAGE sample buffer | Invitrogen | BN2003 | Protocol Section Number-8.3 |
4x LDS loading buffer | Invitrogen | NP0007 | Protocol Section Number-5.3 |
5 L Erlenmeyer flasks | Corning | 431685 | Protocol Section Number-4.2 |
Agarose gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Protocol Section Number-2.2 |
Anti-clumping agent | Thermo Fisher | 0010057AE | Protocol Section Number-4.8 |
anti-FLAG M2 affinity gel | Sigma | A2220 | Protocol Section Number-6.1.1 |
anti-FLAG M2 | Sigma | F3165 | Protocol Section Number-5.7 |
Anti foam-Excell anti foam | Sigma | 59920C-1B | Protocol Section Number-4.8 |
ATP | Sigma | A6419 | Protocol Section Number-6.1.4.4 |
BEH 450 SEC | Waters | 186006851 | 2.5 µm x 4.6 mm x 150 mm Protocol Section Number-7.3 |
blue native PAGE 5% G-250 sample additive | Invitrogen | BN2004 | Protocol Section Number-8.3 |
carbenicillin | Thermo Fisher | 10177012 | Protocol Section Number-2.5 |
centrifuge – Sorvall Lynx 6000 | Thermo Fisher | 75006590 | Protocol Section Number-6.1.3 |
Cell Counter – ViCELL | BECKMAN COULTER | Protocol Section Number-4.3 | |
CHAPS | Anatrace | C316S | Protocol Section Number-6.1.4.6 |
Competent E. coli cells-TOP10 | Invitrogen | C404010 | Protocol Section Number-2.4 |
digitonin | Sigma | D141 | Protocol Section Number-5.1 |
differential refractive index detector | Wyatt | Protocol Section Number-7.1 | |
DYKDDDDK peptide | Genscript | Peptide synthesis service Protocol Section Number-6.1.4.6 |
|
EDTA | Sigma | EDS | Protocol Section Number-5.1 |
EndoFree Plasmid Giga Kit | Qiagen | 12391 | Protocol Section Number-3.3 |
Endotoxin free water | Cytiva | SH30529.03 | Protocol Section Number-4.1 |
endotoxin quantification kit-CRL Endosafe Nexgen-PTS detection system | Charles River | PTS150K | Protocol Section Number-3.4 |
fixed angle rotor A23-6×100 rotor | Thermo Fisher | 75003006 | Protocol Section Number-6.1.3 |
FPLC software- Unicorn 6.2 | Cytiva | Protocol Section Number-6.1.4 | |
Gene synthesis | Genscript | Gene synthesis service Protocol Section Number-1.2 |
|
Glycerol | Honeywell | 60-048-023 | Protocol Section Number-5.6 |
Growth Medium-Expi293 expression medium | Thermo Fisher | A1435102 | Protocol Section Number-4.2 |
HEK293 cells | Thermo Fisher | R79007 | Protocol Section Number-4 |
high shear homogenizer-Microfluidizer | MicroFluidics | LM10 | Protocol Section Number-6.1.3 |
HPLC – 1260 infinity II Bio-Insert HPLC | Agilent | Protocol Section Number-7.1 | |
Image Studio | LiCor | Image analysis software Protocol Section Number-5.1 |
|
MAB2166 | Sigma | MAB2166 | Protocol Section Number-5.7 |
MAB2168 | EMD | MAB2168 | Protocol Section Number-5.7 |
MAB3E10 | Santa Cruz | SC-47757 | Protocol Section Number-5.7 |
MAB4E10 | Santa Cruz | SC-7757 | Protocol Section Number-5.7 |
MAB5490 | Sigma | MAB5490 | Protocol Section Number-5.7 |
MAB5492 | Sigma | MAB5492 | Protocol Section Number-5.7 |
MAB8A4 | Santa Cruz | SC-47759 | Protocol Section Number-5.7 |
multi-angle light scattering detector | Wyatt | Protocol Section Number-7.1 | |
NativeMark Unstained Protein Standard | Invitrogen | LC0725 | Protocol Section Number-8.4 |
NaCl | Sigma | S9888 | Protocol Section Number-5.6 |
NheI | New England Biolab | R0131S | Hi-Fi version available Protocol Section Number-2.2 |
NuPAGE 3–8% Tris acetate gels | Thermo Fisher | EA0375PK2 | Protocol Section Number-5.4 |
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running buffer | Invitrogen | LA0041 | Protocol Section Number-5.4 |
PEI 25K | Polysciences | 23966-1 | Protocol Section Number-4.1 |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | Protocol Section Number-4.2 |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cytiva | SH30256.02 | Protocol Section Number-4.5 |
plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | Protocol Section Number-2.6 |
PmeI | New England Biolab | R0560S | Protocol Section Number-2.2 |
precast Bis-tris gel- 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris Gel | Invitrogen | BN1003BOX | Protocol Section Number-8.4 |
protease inhibitor cocktail | GoldBio | GB-331-1 | Protocol Section Number-5.1 |
SEC-MALS analysis software – Astra 7 | Wyatt Technology | Protocol Section Number-7.6 | |
secondary antibody -IRdye 800 CW goat anti-mouse IgG | LiCor | 926-32210 | Protocol Section Number-5.9 |
Superose 6 pg XK 16/70 | Cytiva | 90100042 | Protocol Section Number-6.2 |
Tris base | Fisher | BP152 | Protocol Section Number-5.6 |
Tween-20 | Thermo Fisher | AAJ20605AP | Protocol Section Number-6.1.1 |
UV spectrometer – Nanodrop 8000 | Thermo Fisher | ND-8000-GL | Protocol Section Number-2.2 |
XK26/100 | Cytiva | 28988951 | Protocol Section Number-6.1.1 |