DetectSyn: um método fluorescente rápido e imparcial para detectar alterações na densidade da sinapse

As sinapses são a unidade fundamental de comunicação entre os neurônios¹. Muitas sinapses entre neurônios dentro das mesmas regiões dão origem a circuitos que mediam o comportamento². As sinapses consistem em um terminal pré-sináptico de um neurônio que libera neurotransmissores ou neuropeptídeos que retransmitem informações para receptores postsináspicos de outro neurônio. A soma dos sinais pré-sinápticos determina se o neurônio postsinásptico disparará um potencial de ação e propagará a mensagem para outros neurônios.

A sinaptopatologia, a quebra das sinapses, surge em doenças e distúrbios marcados pela diminuição do volume neural, como a doença de Alzheimer e o transtorno depressivo grave, resultando em circuitos que não funcionam mais^de forma ideal ^3,4,5. Restaurar a densidade da sinapse provavelmente está por trás da eficácia de tratamentos potenciais para esses distúrbios. Por exemplo, foi recentemente demonstrado que o aumento das sinapses está por trás da eficácia comportamental dos antidepressivos rápidos⁶. Para testar rapidamente possíveis tratamentos de sinaptopatologia, os pesquisadores exigem técnicas que identifiquem rapidamente mudanças nos números da sinapse.

As metodologias atuais são demoradas e caras (microscopia eletrônica, tomografia de matriz), ou examinam apenas alterações postsináspticas sem incorporar engajamento pré-sináptico (análises da coluna vertebral, imunofluorescência/colocalização). Corantes como dii ou proteínas fluorescentes como gfp ajudam a visualizar neurônios e caracterizam espinhas pós-sinápticas. No entanto, a análise da coluna vertebral utiliza razões definidas pelo pesquisador para determinar a morfologia, o que pode diminuir a reprodutibilidade⁷. Além disso, como as diferentes classes de coluna vertebral se relacionam com sinapses funcionais ainda está sendo descoberto⁸. A formação da coluna vertebral pode ser transitória e pode refletir plasticidade post-sináptica, mas essas espinhas podem ser eliminadas antes de estabilizar em uma sinapse com um neurônio pré-sináptico⁹.

A colocalização fornece um proxy melhor para sinapses do que a análise da coluna vertebral, porque pode-se imunossuer proteínas pré-sinápticas e pós-sinápticas. No entanto, as proteínas sinápticas podem produzir baixos valores de colocalização porque as proteínas são justapostas e podem não se sobrepor consistentemente. Assim, como as proteínas não são totalmente sobrepostas, as técnicas de colocação podem não medir com precisão as alterações na formação de sinapse devido a essa informação perdida. Finalmente, embora tanto a microscopia eletrônica (EM) quanto a tomografia de matriz forneçam imagens de alta resolução de sinapses, elas são demoradas. A EM requer ainda equipamentos especializados, e os pesquisadores estão limitados a pequenos volumes de tecido para qualquer experimento. Embora a tomografia de array forneça elegantemente a capacidade de tela para muitas proteínas em seções ultrathin e possa ser combinada com o EM¹⁰, essa técnica pode ser muito trabalhosa e além do escopo de experimentos que precisam digitalizar rapidamente para mudanças na formação de sinapsia.

DetectSyn é uma aplicação específica do Ensaio de Ligadura de Proximidade duolink. O ensaio PLA permite a detecção geral de interações proteína-proteína. Detecta as pontes proxy medidas pós-sinápticas amplificando um sinal fluorescente emitido por proteínas pré e pós-sináptica marcadas dentro de 40 nm uma da outra. Se as proteínas sinápticas estiverem dentro de 40 nm, como dentro de uma fenda sináptica, então os anticorpos secundários, que contêm sondas de DNA, hibridizarão em DNA circular. Este DNA circular hibridizado expressa uma sonda fluorescente, que é então amplificada e detectada com técnicas padrão de microscopia fluorescente (ver Figura 1). Crucialmente, ao contrário da em e tomografia de matriz, esta técnica não requer equipamento especializado e leva cerca da mesma quantidade de tempo que a imunohistoquímica padrão. A acessibilidade dessa técnica, assim, permite que pesquisadores fora de instituições intensivas em pesquisa participem de pesquisas sinaptopológicas. Além disso, essa técnica pode examinar alterações na densidade sináptica em múltiplas regiões cerebrais dentro de um único experimento, oferecendo uma representação mais holística de mudanças sinápticas devido a doenças ou tratamento.