Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

Mitochondriën zijn essentiële organellen die in bijna alle eukaryote cellen aanwezig zijn. Mitochondriën zijn verantwoordelijk voor de energievoorziening door adenosinetrifosfaat (ATP) te produceren via oxidatieve fosforylering en fungeren als metabole intermediairs voor biosynthese en metabolisme. Mitochondriën zijn nauw betrokken bij vele andere belangrijke cellulaire processen, zoals ROS-generatie, celdood en intracellulaire Ca^{2 + -}regulatie. Mitochondriale disfunctie is in verband gebracht met verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Huntington (HD), Friedreich's ataxie (FRDA) en amyotrofische laterale sclerose (ALS)¹. Verhoogde mitochondriale disfunctie en mtDNA-afwijking worden ook verondersteld bij te dragen aan de veroudering van de mens ^2,3.

Verschillende soorten mitochondriale disfunctie komen voor bij neurodegeneratieve ziekten, en veranderingen in mitochondriaal volume, MMP-depolarisatie, productie van ROS en veranderingen in mtDNA-kopienummer komen vaak voor 4,5,6,7. Daarom is het vermogen om deze en andere mitochondriale functies te meten van groot belang bij het bestuderen van ziektemechanismen en het testen van potentiële therapeutische middelen. Bovendien, gezien het gebrek aan diermodellen die menselijke neurodegeneratieve ziekten getrouw repliceren, is het opzetten van geschikte in vitro modelsystemen die de menselijke ziekte in hersencellen samenvatten een belangrijke stap in de richting van een beter begrip van deze ziekten en de ontwikkeling van nieuwe therapieën 2,3,8,9.

Menselijke iPSC's kunnen worden gebruikt om verschillende hersencellen te genereren, waaronder neuronale en niet-neuronale cellen (d.w.z. gliacellen), en mitochondriale schade geassocieerd met neurodegeneratieve ziekte is gevonden in beide celtypen 3,10,11,12,13. Geschikte methoden voor iPSC-differentiatie in neurale en gliale afstammingslijnen zijn beschikbaar 14,15,16. Deze cellen bieden een uniek platform voor mens/patiënt voor in vitro ziektemodellering en geneesmiddelenscreening. Verder, omdat deze zijn afgeleid van patiënten, bieden iPSC-afgeleide neuronen en gliacellen ziektemodellen die nauwkeuriger weergeven wat er bij mensen gebeurt.

Tot op heden zijn er weinig handige en betrouwbare methoden beschikbaar voor het meten van meerdere mitochondriale functionele parameters in iPSC's, met name levende neuronen en gliacellen. Het gebruik van flowcytometrie biedt de wetenschapper een krachtig hulpmiddel voor het meten van biologische parameters, waaronder mitochondriale functie, in afzonderlijke cellen. Dit protocol biedt details voor het genereren van verschillende soorten hersencellen, waaronder neurale stamcellen (NSC's), neuronen en glia-astrocyten van iPSC's, evenals nieuwe op flowcytometrie gebaseerde benaderingen om meerdere mitochondriale parameters in verschillende celtypen te meten, waaronder iPSC's en iPSC-afgeleide neurale en gliacellen. Het protocol biedt ook een co-kleuringsstrategie voor het gebruik van flowcytometrie om mitochondriaal volume, MMP, mitochondriaal ROS-niveau, MRC-complexen en TFAM te meten. Door metingen van mitochondriaal volume of massa op te nemen, maken deze protocollen ook de meting van zowel het totale niveau als het specifieke niveau per mitochondriale eenheid mogelijk.

OPMERKING: Zie de tabel met materialen en de aanvullende tabel S1 voor recepten van alle media en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.

1. Differentiatie van menselijke iPSC's in NCS'en, dopaminerge (DA) neuronen en astrocyten

1. Bereid matrix-gecoate platen voor.
   1. Ontdooi een flacon met 5 ml matrix op ijs een nacht. Verdun 1 ml matrix met 99 ml koude Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (1% eindconcentratie). Maak 1 ml aliquots en bewaar ze bij -20 °C.
   2. Ontdooi de matrixoplossing bij 4 °C (houd het koud) en bestrijk 6 putten (1 ml per putje in een 6-wells plaat).
   3. Plaats de matrixgecoate plaat in een bevochtigde 5% CO₂/95% luchtincubator bij 37 °C gedurende 1 uur. Haal het bord uit de incubator en laat het in evenwicht brengen tot kamertemperatuur (RT).
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de plaat binnen 3 dagen na het coaten te gebruiken. De gecoate plaat kan echter tot 2 weken bij 4 °C worden bewaard. Vergeet niet om het eruit te halen en het voor gebruik op te warmen tot RT. Voeg voor langdurige opslag 1 ml iPSC-kweekmedium toe aan de gecoate plaat om uitdroging van de matrix te voorkomen.
2. IPSC's ontdooien
   1. Verwarm de met matrix beklede platen gedurende 20-30 minuten voor op RT of in de incubator bij 37 °C. Prewarm de benodigde hoeveelheid iPSC-kweekmedium bij RT.
   2. Meng 6 ml voorgewarmd iPSC-kweekmedium met 12 μL Y-27632 ROCK-remmer om een eindconcentratie van 10 μM te verkrijgen.
   3. Ontdooi de bevroren injectieflacon met iPSC's bij 37 °C gedeeltelijk in een waterbad totdat er een klein stukje ijs overblijft.
   4. Voeg langzaam 1 ml voorgewarmd iPSC-kweekmedium met 12 μL ROCK-remmer druppelsgewijs toe aan de cellen. Breng de vloeistofinhoud van de injectieflacon met iPSC's druppelsgewijs over in één putje van een 6-well voorgecoate plaat met behulp van een pipet van 5 ml.
   5. Verplaats de plaat in loodrechte richtingen om de putinhoud te mengen en breng de plaat terug naar de incubator. Vervang het iPSC-kweekmedium na 24 uur na het wassen met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) (1x) (Ca²⁺/Mg²⁺-vrij) (4 ml per putje in een 6-well plaat).
      OPMERKING: Voeg geen ROCK-remmer toe aan volgende voedingen. Verander het iPSC-cultuurmedium dagelijks.
3. Subculturatie van iPSC's
   1. Verwarm de met matrix beklede platen gedurende 20-30 minuten voor op RT of in de incubator bij 37 °C. Prewarm de benodigde hoeveelheid iPSC-kweekmedium bij RT.
   2. Aspirateer het kweekmedium uit de platen die de cellen bevatten. Spoel de iPSC's af met DPBS (1x) (Ca²⁺/Mg²⁺-vrij) (4 ml per putje in een 6-wells plaat).
   3. Voeg EDTA (0,5 mM) (1 ml per put toe in een 6-well plaat). Incubeer de platen bij 37 °C totdat de randen van de kolonies uit de put beginnen op te tillen (meestal 3-5 min). Aspirateer de EDTA.
   4. Voeg voorgewarmd iPSC-kweekmedium toe (4 ml per put in een 6-wellsplaat) en maak de iPSC-kolonies eenmaal krachtig los met een steriele pipet van 10 ml. Pipetteer niet op en neer, omdat dit celklonters in afzonderlijke cellen kan breken.
   5. Breng de inhoud van elke put over in twee afzonderlijke putten in een matrixgecoate 6-well plaat (2 ml per put in een 6-well plaat) en incubeer bij 37 °C. Genereer geen bubbels in de suspensie tijdens het pipetteren.
      OPMERKING: Schud de plaat voorzichtig voordat u deze in de couveuse bewaart. De split ratio kan 1:2 zijn (één put in 2 nieuwe putten) tot 1:4 (één put in 4 nieuwe putten).
   6. Vervang het medium dagelijks totdat de kolonies 60% samenvloeiing bereiken met een goede grootte en verbindingen.
4. Neurale inductie en neurale voorlopergeneratie
   1. Bereid 500 ml chemisch gedefinieerd medium (CDM), 500 ml neuraal inductiemedium (NIM) en 500 ml neuraal stamcelserumvrij (NSC SF) medium voor.
   2. Spoel de cellen af met DPBS (1x) (Ca²⁺/Mg²⁺-vrij) (4 ml per putje in een 6-well plaat) en voeg NIM (3 ml per put toe in een 6-well plaat). Ingesteld als Dag 0.
   3. Vervang de NIM (3 ml per put in een 6-well plaat) op dag 1, dag 3 en dag 4 en observeer dagelijks onder de microscopie.
   4. Maak op dag 5 de neurale rozetten los in suspensiecultuur zoals hieronder beschreven.
      1. Was eens voorzichtig met DPBS (1x) (Ca²⁺/Mg²⁺-vrij) (4 ml per putje in een 6-well plaat). Voeg collagenase IV toe (1 ml per putje in een 6-wellsplaat) en bewaar 1 min in een couveuse. Aspirateer het collagenase IV en was het eenmaal met DPBS (1x) (4 ml per putje in een 6-wells plaat) voorzichtig.
      2. Voeg 2 ml NSC SF Medium per put toe aan een 6-well plaat. Maak de cellen los door de bodems van de putten te schrapen door roosters te tekenen met behulp van een pipetpunt van 200 μL.
      3. Verzamel de celsuspensie van de 6-well plaat in een 10 cm niet-hechtende schaal. Vul het volume aan tot 12 ml met NSC SF Medium.
      4. Schud de niet-aanhangende schotel bij 65-85 tpm op een orbitale shaker in een incubator om aggregatie te voorkomen.
5. DA neuron differentiatie
   1. Voeg op dag 7 12 ml CDM toe, aangevuld met 100 ng / ml fibroblastgroeifactor-8b (FGF-8b) en plaats de schotel op de orbitale shaker in de incubator.
   2. Op dag 8-13, verander het medium om de 2 dagen en observeer dagelijks onder de microscopie.
   3. Voeg op dag 14 12 ml CDM toe, aangevuld met 100 ng / ml FGF-8b en 1 μM purmorphamine (PM). Plaats de schaal op de orbitale shaker in de incubator.
   4. Op dag 15-20 verwisselt u het medium om de 2 dagen en observeert u de cellen dagelijks onder de microscopie.
   5. Laat de bollen mechanisch passeren door 1000 μL tips te gebruiken om de grotere bollen op te breken.
      OPMERKING: De verhouding kan 1:2 zijn (één gerecht in 2 nieuwe gerechten).
6. Beëindiging van de differentiatie
   1. Bekleed een 6-wells plaat of coverslips met Poly-L-Ornithine (PLO) en laminine zoals hieronder beschreven.
      1. Bestrijk een 6-wells plaat met 1 ml PLO per put en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 20 min. Aspirateer de PLO-oplossing.
      2. Steriliseer de plaat onder UV gedurende 20 min. Spoel de putjes twee keer af met DPBS (1x) (4 ml per putje in een 6-wells plaat).
      3. Voeg 5 μg/ml laminineoplossing (1 ml per putje in een 6-wellsplaat) toe aan de put en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur. Aspirateer het laminine en was de putjes kort met DPBS (1x) (4 ml per putje in een 6-well plaat) eenmaal voor het plateren.
   2. Verzamel alle bollen (vanaf stap 1.5.5) in buizen van 50 ml en vul bij met DPBS (1x). Draai op 300 × g gedurende 5 min. Aspirateer het supernatant.
   3. Incubeer met 2 ml celdissociatiereagens (zie de tabel met materialen) gedurende 10 minuten bij 37 °C in een waterbad, gevolgd door zachte trituratie met een pipet van 200 μL (20-50 keer afhankelijk van de grootte van de bollen, waardoor bellenvorming wordt vermeden).
   4. Neutraliseer het celdissociatiereagens met 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en centrifugeer de conische buis van 50 ml met de cellen op 300 × g gedurende 5 minuten bij RT. Aspirateer het supernatant.
   5. Voeg 1 ml CDM toe, aangevuld met 10 ng / ml Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) en 10 ng / ml Gliacellijn-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) om de celpellets te resuspenderen door voorzichtig op en neer te pipetteren om eencellige suspensies te verkrijgen.
   6. Aspirateer de laminineoplossing uit de plaat (stap 1.6.1.3), was kort met DPBS (1x) (4 ml per put in een 6-well plaat) en zaai de cellen (vanaf stap 1.6.5) in de voorgecoate platen of coverslips in 3 ml CDM aangevuld met 10 ng/ml BDNF en 10 ng/ml GDNF. Voer de cellen om de 4 dagen.
      OPMERKING: Differentiërende culturen kunnen gedurende vele weken tot 3 maanden worden gehandhaafd. De neurale morfologie verschijnt meestal na 2 weken van beëindiging en kan vanaf dat moment worden gebruikt voor downstream-analyses. BDNF en GDNF zijn niet nodig voor het kweken voor langer onderhoud (tot 2 maanden).
7. NSC generatie
   1. Laag matrixplaten.
   2. Verzamel alle neurale bollen (gegenereerd vanaf stap 1.4) in buizen van 50 ml en vul bij met DPBS (1x) (Ca^{2 +}/ Mg^{2 +}-vrij). Draai op 300 × g gedurende 5 min. Aspirateer de supernatanten.
   3. Incubeer de pellets met 2 ml celdissociatiereagens gedurende 10 minuten bij 37 °C in een waterbad, gevolgd door zachte trituratie met een pipet van 200 μL (20-50 keer afhankelijk van de grootte van de bollen, waardoor bellenvorming wordt vermeden).
   4. Neutraliseer met 2 ml DMEM met 10% FBS en centrifugeer de 50 ml conische buizen met de cellen op 300 × g gedurende 5 minuten bij RT. Aspirateer de supernatanten. Resuspendeer de celpellets door voorzichtig op en neer te pipetteren om eencellige suspensies te verkrijgen.
   5. Aspirateer de matrixoplossing uit een voorgecoate plaat en zaai de cellen in de voorgecoate platen in NSC SF Medium (3 ml per put in een 6-well plaat). Voed de cellen om de 2-3 dagen en splits de cellen wanneer ze samenvloeien.
      OPMERKING: Vanaf deze fase kunnen NSC's worden uitgebreid en bevroren.
8. Glia astrocyten differentiatie
   1. Astrocyten differentiatie van NSC's
      1. Bereid 500 ml astrocytendifferentiatiemedium voor.
      2. Zaad NSC's op Poly-D-Lysine (PDL)-gecoate platen/coverslips met NSC SF Medium.
      3. Spoel de volgende dag de cellen af met DPBS (1x) (Ca²⁺/Mg²⁺-vrij) (4 ml per putje in een 6-well plaat) en voeg Astrocyte Differentiation Medium (3 ml per put toe in een 6-well plaat). Ingesteld als Dag 0.
      4. Observeer de NSC's dagelijks onder de microscoop en vervang het Astrocyte Differentiation Medium (3 ml per put in een 6-well plaat) elke 2 dagen van dag 1 tot 27.
   2. Astrocytenrijping
      1. Bereid Astrocyten Maturation Medium voor.
      2. Spoel op dag 28 de cellen af met DPBS (1x) (4 ml per put in een 6-putplaat) en voeg Astrocyte Maturation Medium (3 ml per put toe in een 6-well plaat).
      3. Observeer op dag 29 en later dagelijks de cellen onder de microscoop en vervang het Astrocyte Maturation Medium (3 ml per put in een 6-well plaat) om de 2 dagen.
      4. Na een maand rijping, breid de cellen uit en cryoprereserveer ze vanaf dit stadium.
         OPMERKING: Tijdens deze fase zal het aantal cellen toenemen. Bij het splitsen van de cellen zijn PDL-gecoate coverslips niet nodig voor het kweken.

2. Celkarakterisering door immunocytochemie en immunofluorescentiekleuring

1. Breng aan het einde van de kweekperiode de coverslips met de cellen over naar een 12-wells plaat.
   Spoel de cellen twee keer af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (1x) en incubeer gedurende 10 minuten in 4% paraformaldehyde (PFA) (0,5 ml per put in een 12-well plaat) op RT.
   OPMERKING: Het vaste monster kan worden bedekt met 2 ml PBS (1x) en worden bewaard bij 4 °C totdat het nodig is voor immunostaining. PFA is giftig en wordt verdacht van het veroorzaken van kanker. Voorkom blootstelling van de huid en de ogen en werk onder een chemische zuurkast.
2. Blok en permeabiliseer de cellen en incubeer met blokkerende buffer met PBS (1x), 0,3% Triton X-100 en 10% normaal geitenserum gedurende 1 uur bij RT.
3. Incubeer met primaire antilichamen in blokkerende buffer 's nachts bij 4 °C: vlek-iPSC's met anti-octameerbindende transcriptiefactor 4 (oct4) en anti-stadiumspecifiek embryonaal antigeen-4 (SSEA4), NSC's met anti-geslachtsbepalend gebied Y box-2 (Sox2) en anti-Nestin, neurale bollen met anti-paired box-6 (Pax6) en anti-Nestin, astrocyten met anti-glial fibrillair zuur eiwit (GFAP) en anti-S100 calciumbindend eiwit β (S100β), en DA-neuronen met anti-tyrosinehydroxylase (TH), anti-β III Tubulin (Tuj 1), anti-Synaptophysin en anti-PSD-95 (0,5 ml primaire antilichaamoplossing per put in een 12-well plaat; zie de Tabel met materialen voor details).
4. Was de monsters met PBS (1x) drie keer gedurende 10 minuten elk met zacht schommelen.
5. Incubeer met secundaire antilichaamoplossing (1:800 in blokkerende buffer, 0,5 ml Alexa Fluor secundaire antilichaamoplossing per put in een 12-well plaat) gedurende 1 uur bij RT met zacht schommelen.
6. Incubeer de cellen met Hoechst 33342 (1:5.000, 0,5 ml per put in een 12-well plaat) in PBS (1x) gedurende 15 minuten bij RT om de kernen te labelen.
7. Monteer de cellen met montagemedium en droog 's nachts bij RT voor beeldvorming onder een fluorescentiemicroscoop in het donker. Zie aanvullende figuur S1 voor de microscoopinstellingen en parameters.

3. Flowcytometriemeting van mitochondriaal volume, MMP en mitochondriale ROS in levende cellen

1. Zaai de cellen afzonderlijk in 4 putten in een 6-wells plaat totdat de cellen 50% -60% samenvloeiing bereiken. Label deze vier putten als # 1, # 2, # 3 en # 4.
2. Bereid aan het einde van de kweekperiode 5 individuele kleuringsoplossingen (500 μL per put in een 6-wellsplaat) als volgt: # 1 alleen kweekmedium (tot goed # 1 met alleen cellen voor controle); #2-1 met FCCP (100 μM); #2-2 met FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) in kweekmedium; #3 met TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) in kweekmedium; #4 met MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) in PBS (1x) met 10% FBS. Zie figuur 1A, aanvullende tabel S2 en de tabel met materialen voor details over deze verbindingen en flowcytometrie-instellingen.
   OPMERKING: Gebruik het kweekmedium om de kleuringsoplossing te bereiden. Warm het medium en PBS (1x) op RT op voor gebruik. FCCP is giftig; voorkomen van huid- en oogblootstelling en werken onder een chemische zuurkast.
3. Aspirateer het medium uit de #2 put en voeg #2-1 oplossing toe (alleen FCCP). Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 10 min.
4. Aspirateer het medium van #2 en #3 putten en voeg #2-2 oplossing (FCCP + TMRE + MTG) toe in de #2 put en #3 oplossing (TMRE + MTG) in #3. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 45 min.
5. Aspirateer het medium uit de #4 put en voeg #4 oplossing (MitoSox Red + MTG) toe. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 15 min.
6. Aspirateer het medium uit alle putten. Wassen met PBS (1x) (4 ml per put in een 6-well plaat). Maak de cellen los met behulp van 1 ml celdissociatiereagens (1 ml per putje in een 6-wellsplaat) bij 37 °C gedurende 5 min. Neutraliseer het celdissociatiereagens in 1 ml DMEM met 10% FBS (2 ml per put in een 6-well plaat).
7. Verzamel de inhoud van alle putten in conische buizen van 15 ml. Centrifugeer de buizen op 300 × g gedurende 5 min. Was de pellets een of twee keer met PBS (1x).
8. Adem de supernatanten op, maar laat ongeveer 100 μL achter in de buizen. Resuspendeer de celpellets in 300 μL PBS (1x). Breng de cellen over naar 1,5 ml microcentrifugebuizen. Houd de buizen in het donker bij RT.
9. Analyseer de cellen met behulp van een flowcytometer (met een 3 blauwe en 1 rode laserconfiguratie). Detecteer MTG in filter 1 (FL1) met een 530/30 bandpass filter, TMRE in filter 2 (FL2) met het bandpass filter 585/40 en MitoSox Red in filter 3 (FL3) met een 510/580 bandpass filter.

4. Flowcytometriemeting van MRC-complexe subeenheden en TFAM in vaste cellen

1. Maak aan het einde van de kweekperiode de cellen los (~10⁶) door het celdissociatiereagens toe te voegen; pelleteer vervolgens en verzamel de cellen in een buis van 15 ml. Was de cellen door centrifugatie met PBS (1x) tweemaal door centrifugeren op 300 × g gedurende 5 minuten.
2. Fixeer de cellen in 1,6% PFA (1 ml van 1,6% PFA in een buis van 15 ml) op RT gedurende 10 minuten. Was de cellen door centrifugatie met PBS (1x) tweemaal door centrifugeren op 300 × g gedurende 5 minuten.
3. Permeabiliseer de cellen met ijskoude 90% methanol (1 ml 90% methanol in een buis van 15 ml) bij -20 °C gedurende 20 minuten.
4. Blokkeer de monsters in een blokkerende buffer met 0,3 M glycine, 5% geitenserum en 1% runderserumalbumine (BSA) - Fractie V in PBS (1x) (1 ml blokkerende buffer in een buis van 15 ml). Was de cellen tweemaal door centrifugatie met PBS (1x) (zoals in stap 3.7).
5. Incubeer de cellen met de volgende primaire antilichamen gedurende 30 minuten: anti-NDUFB10 (1:1.000) voor meting van complexe I-subeenheid, anti-succinaatdehydrogenasecomplex flavoproteïnesubeenheid A (SDHA, 1:1.000) voor meting van complexe II-subeenheid en anti-COX IV (1:1.000) voor meting van complexe IV-subeenheid, en anti-TFAM-antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (1:400). Kleur hetzelfde aantal cellen afzonderlijk met anti-TOMM20-antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (1:400) gedurende 30 minuten (1 ml primaire antilichaamoplossing in een buis van 15 ml; zie de tabel met materialen voor details over de antilichamen).
6. Was de cellen met PBS (1x) eenmaal met centrifugatie op 300 × g gedurende 5 min. Voeg secundair antilichaam (1:400) toe aan buizen van NDUFB10, SDHA en COX IV en incubeer de cellen met deze oplossingen gedurende 30 minuten.
7. Was de cellen eenmaal met PBS (1x) door gedurende 5 minuten te centrifugeren op 300 × g . Zuig de supernatanten aan en laat ongeveer 100 μL achter in de buizen. Resuspendeer de celpellets in 300 μL PBS (1x). Breng de cellen over naar 1,5 ml microcentrifugebuizen die in het donker op ijs worden bewaard.
8. Analyseer de cellen op de flowcytometer (met een 3 blauwe en 1 rode laserconfiguratie). Detecteer signalen in filter 1 (FL1) met behulp van een 530/30 bandpass filter. Zie aanvullende figuur S2 voor de microscoopinstellingen en parameters.

5. Verwerving en analyse van flowcytometrie

1. Gebruik de niet-gekleurde controlebuis om het voorwaartse spreidingsgebied (FSC-A) en het zijverstrooiingsgebied (SSC-A) spreidingsdiagrammen in te stellen op basis van de grootte en complexiteit van de geanalyseerde celpopulatie. Zie aanvullende figuur S2 voor de microscoopinstellingen en parameters.
   OPMERKING: Stel niet-gekleurde besturingselementen in voor afzonderlijke celtypen.
2. Gebruik de niet-vlekcontrolebuizen om de positieve poorten te selecteren en gebruik eenkleurige controlebuizen om te compenseren voor de spectrale overlapping van fluorescentie tussen MTG (fluorofoor-1 [FL-1]) en TMRE (FL-2) in meerkleurige flowcytometrie. Gebruik isotypecontrole voor negatieve controle om achtergrondkleuring in MRC- en TFAM-monsters te controleren. Gebruik de FCCP-buis als depolarisatiecontrole voor TMRE-kleuring.
3. Sluit vreemd puin af om levende cellen en de hoofdgating van de voorwaartse en zijwaartse spreidingsplot te selecteren (figuur 2A). Sluit doubletten af met behulp van een voorwaartse strooihoogte (FSC-H) versus (vs.) FSC-A-dichtheidsdiagram om doubletten uit te sluiten en construeer ook een zijverstrooiingshoogte (SSC-H) versus SSC-A-plot (figuur 2A).
4. Data-acquisitie (flowcytometer)
   1. Gebruik de niet-gekleurde of isotypemonsters als een negatieve controle en creëer een poort boven de hoofdpopulatie van de gebeurtenissen met één cel terwijl u SSC-A en de verschillende filters (FL1, FL2, FL3, FL4) bekijkt (figuur 1B en figuur 2B).
5. Data-analyse (CFlow software)
   1. Kopieer de positie van de poorten op de gekleurde celmonsters en noteer de hoeveelheid positief gekleurde cellen voor de positieve kleuring.
   2. Selecteer voor elke celsubpopulatie een histogramplot en analyseer de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) van de verschillende filterkanalen (FL1, FL2, FL3, FL4) (x-as).
      1. Bereken de TMRE-niveaus door de MFI van FL2 van #2 fccp-behandelde cellen af te trekken van de MFI van FL2 van #3 TMRE-gekleurde monsters in een histogram, zoals in Eq (1) hieronder.
         TMRE-niveaus = MFI van FL2 uit #3 TMRE-gekleurde monsters - MFI van FL2 van #2 FCCP-behandelde cellen (1)
      2. Bereken de specifieke waarden voor MMP en mitochondriale ROS door MFI in TMRE of MitoSox Red, waarbij de mitochondriale volume-indicator MTG wordt gedeeld.
      3. Bereken de specifieke waarde voor complexe subeenheid en TFAM met behulp van MFI in complexe expressie of TFAM, waarbij de mitochondriale volume-indicator TOMM20 wordt gedeeld.

Een schematische beschrijving van de differentiatiemethode en flowcytometrische strategieën is weergegeven in figuur 3. Menselijke iPSC's worden gedifferentieerd in neurale rozetten en vervolgens opgetild in suspensiecultuur voor differentiatie in neurale sferen. Neurale bollen worden verder gedifferentieerd en gerijpt tot DA-neuronen. Neurale bollen worden gedissocieerd in afzonderlijke cellen om glia-astrocyten te genereren, opnieuw geplateerd in monolagen als NSC's en vervolgens gedifferentieerd tot astrocyten. Dit protocol biedt de strategieën die nodig zijn voor het verwerven en analyseren van de monsters door flowcytometrie voor de meting van MMP, mitochondriaal volume, mitochondriale ROS-niveaus, expressieniveaus van MRC-complexe subeenheden en TFAM (een indirecte meting van het relatieve mtDNA-kopienummer). In het bijzonder werd co-kleuring met fluorescerende melders, TMRE en MTG, gebruikt om veranderingen in MMP en mitochondriaal volume te detecteren en te kwantificeren. Co-kleuring met MitoSox Red en MTG maakt het mogelijk om de mitochondriale ROS-productie in levende cellen te meten. Kleuring met antilichamen tegen MRC-complexe subeenheden samen met TOMM20 maakt de beoordeling van de MRC en kleuring van TFAM en TOMM20 mogelijk voor indirecte beoordeling van het mtDNA-kopienummer. Belangrijk is dat MTG en TOMM20 de meting per mitochondriaal volume mogelijk maken, waardoor de invloed van mitochondriaal volume op deze parameters wordt tegengegaan.

DA-neuronen worden gegenereerd uit iPSC's door middel van dubbele SMAD-remming en blootgesteld aan FGF-8b en de Sonic hedgehog (SHH) agonist PM, zoals weergegeven in figuur 4A. Menselijke iPSC's worden gezaaid in iPSC-kweekmedium op matrix-gecoate platen. Wanneer de cellen 50% -80% confluentie bereiken, wordt het medium gedurende 5 dagen veranderd in NIM met behulp van een CDM aangevuld met SB431542, AMPK-remmer, compound C en N-acetylcysteïne. Na 5 dagen evolueren de iPSC's (figuur 4B, a) naar een neuraal epitheelstadium met duidelijke neurale rozetstructuren (figuur 4B, b). Op dag 5 worden neurale bollen gegenereerd door het neurale epitheel in de suspensiecultuur te tillen en ze in NSC SF-medium te kweken op een orbitale shaker in de incubator. Ronde, goed gedefinieerde bollen zijn weergegeven in figuur 4B, c. Op dag 7 wordt het medium veranderd in CDM aangevuld met 100 ng/ml FGF-8b. Op dag 14 wordt het medium veranderd in het CDM aangevuld met 100 ng/ml FGF-8b en 1 μM PM. Op dag 21 worden de bolletjes gedissocieerd in DA-neuronen in een monolaag door ze te dissociëren in enkele cellen en ze te kweken in CDM aangevuld met 10 ng / ml BDNF en 10 ng / ml GDNF in PLO en laminine-gecoate platen / coverslips. Neuronen (figuur 4B, e) gerijpt gedurende 15-30 dagen worden verder gebruikt voor mitochondriale functionele metingen.

NSC's worden geproduceerd door neurale bollen in afzonderlijke cellen te dissociëren en ze vervolgens in monolagen te hervormen om astrocyten te genereren. Deze NSC's vertonen een klassiek uiterlijk van neurale voorlopers (figuur 4B, d). NSC's kunnen in dit stadium gemakkelijk worden uitgebreid en opgeslagen voor verder gebruik. Om de astrocytendifferentiatie te initiëren, worden NSC's verguld op PDL-gecoate coverslips in NSC SF-medium. De volgende dag wordt het medium gedurende 28 dagen veranderd in astrocytendifferentiatiemedium. Na 28 dagen worden de gedifferentieerde astrocyten verder gerijpt in astrocytenrijpingsmedium. In dit stadium moeten astrocyten stervormige morfologie vertonen (figuur 4B, f), en deze cellen kunnen worden uitgebreid en opgeslagen voor verder gebruik, inclusief mitochondriale functionele beoordeling.

Tijdens differentiatie wordt de celidentiteit bevestigd met behulp van immunofluorescentiekleuring. In figuur 5A laat immunostaining zien dat de iPSC's de specifieke pluripotente markers, SSEA4 en Oct4, tot expressie brengen. Figuur 5B laat zien dat neurale bollen een positieve kleuring van Nestin en Pax6 vertonen, terwijl figuur 5C laat zien dat iPSC-afgeleide NSC's in monolagen een positieve kleuring van Nestin en Sox2 vertonen. Om DA-neuronen te identificeren, worden cellen gekleurd met de neurale marker β III Tubulin (Tuj 1) en de DA neuronale marker tyrosinehydroxylase (TH) (figuur 6B). Bovendien vertonen DA-neuronen kleuring voor de synaptische markers, synaptophysine en PSD-95, wat hun functionele synaptische verbindingen bevestigt (figuur 5B). Immunostaining van iPSC-afgeleide astrocyten toont de expressie van de astrocytenmarkers, glial fibrillary acidic protein (GFAP) en S100 calciumbindend eiwit β (S100β).

Het onderzoek naar de mitochondriale functie in gedifferentieerde neuronen en astrocyten met behulp van flowcytometrie wordt uitgevoerd zoals hierboven beschreven in protocolsecties 3 en 4. Een flowcytometer werd gebruikt voor data-acquisitie en CFlow Sampler voor data-analyse, zoals weergegeven in figuur 1B.

Figuur 2 toont de methode voor het gating van levende enkele cellen. Dode cellen en celresten worden uitgesloten met behulp van een FSC vs. SSC-plot (figuur 2A, a). Cel doubletten worden uitgesloten met behulp van een FSC-H vs. FSC-A plot (Figuur 2A, b) gevolgd door een SSC-H vs. SSC-A plot (Figuur 2A, c). Achtergrondfluorescentie wordt goed beoordeeld als de negatieve populatie van een bepaald celtype wordt vergeleken met de positieve populatie binnen datzelfde celtype (figuur 2B, a). Voor MMP-monsters elimineert de behandeling van de cellen met FCCP interferentie van mitochondriale membraanpotentiaal en TMRE-kleuring (figuur 2B, b).

Deze flowcytometrische benaderingen zijn gebruikt om DA-neuronen te bestuderen die zijn gegenereerd uit de menselijke iPSC's die mutatie (s) dragen in de katalytische subeenheid van mitochondriaal DNA-polymerase, POLG (W748S), en deze te vergelijken met ziektevrije monsters gegenereerd uit Detroit 551 fibroblasten. Zoals eerder gemeld⁴, toonde deze studie ook verminderde MMP en verhoogde specifieke mitochondriale ROS-niveaus in POLG DA-neuronen (figuur 7). Het mitochondriale volume, het totale MMP en het totale mitochondriale ROS-niveau waren echter onveranderd. In figuur 8 tonen de resultaten een afname van de specifieke complexe I-niveaus, lagere totale en specifieke TFAM-niveaus, maar vergelijkbare specifieke complexe II-niveaus in mutante DA-neuronen in vergelijking met controles.

Deze benadering werd ook gebruikt om astrocyten te bestuderen die uit dezelfde iPSC-lijnen werden gegenereerd. Zoals eerder gemeld⁷ en getoond in figuur 9, tonen de resultaten aan dat POLG-gemuteerde astrocyten een lager totaal en specifiek MMP hadden, maar vergelijkbaar mitochondriaal volume en mitochondriale ROS in vergelijking met controles, evenals verlaagde niveaus van specifieke complexen I en IV (figuur 10). Er waren echter geen veranderingen in de totale niveaus van complexen I en IV en geen verandering in de totale en specifieke niveaus van complex II in POLG-astrocyten. Over het algemeen suggereren deze gegevens dat flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters een benadering van de eerste stap biedt die waardevol is bij het evalueren van de mitochondriale functie in cellen zoals iPSC's en hun neurale en gliaderivaten.

Figuur 1: Opstelling voor flowcytometrie. (A) MMP, mitochondriaal volume en mitochondriale ROS-kleuring; (B) een voorbeeld van data-acquisitie in een C6-flowcytometer. Afkortingen: MMP = mitochondriale membraanpotentiaal; ROS = reactieve zuurstofsoorten; FCCP = carbonylcyanide p-trifluoromethoxyfenylhydrazon; TMRE = tetramethylrhodamine-ethylester; MTG = MitoTracker Groen. Zie ook aanvullende tabel S2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Gatingstrategieën. (A) Data-acquisitie; B) de histogrammen van de fluorescentie met MTG- en TMRE-kleuring in levende cellen. Afkortingen: SSC-A = zijstrooiingsgebied; FSC-A = voorwaarts strooigebied; SSC-H = zijverstrooiingshoogte; FSC-H = voorwaartse strooihoogte; FL#-A = fluorofoor # gebied; MTG = MitoTracker Groen; FCCP = carbonylcyanide p-trifluoromethoxyfenylhydrazon; TMRE = tetramethylrhodamine ethylester. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Schematische weergave van de protocolworkflow. Afkortingen: DA = dopaminergic; MMP = mitochondriaal membraanpotentiaal; ROS = reactieve zuurstofsoorten; NDUFB 10 = NADH: Ubiquinonoxidoreductase subeenheid 10; SDHA = succinaatdehydrogenase complex flavoproteïne subeenheid A; COX IV = cytochroom c-oxidasecomplex IV; mtDNA = mitochondriaal DNA; TFAM = mitochondriale transcriptiefactor A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: iPSC-differentiatie. (A) Stroomdiagram en (B) representatieve beelden voor de cellen uit verschillende stadia tijdens de differentiatie, waaronder iPSC's (a), neurale rozet (b), neurale bollen (c), NSC's (d), DA-neuronen (e) en astrocyten (f). Schaalstaven = 25 μm. Afkortingen: iPSC = geïnduceerde pluripotente stamcel; NSC = neurale stamcel; DA = dopaminerge; SFM = serumvrij medium; CDM = chemisch gedefinieerd medium; FGF-8b = fibroblast groeifactor-8b; PM = purmorphamine; BDNF = van de hersenen afgeleide neurotrofe factor; GDNF = van gliacellijn afgeleide neurotrofe factor; PLO = poly-L-ornithine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Representatieve confocale beelden van iPSC's en hun neurale derivaten. (A) Immunostaining van SSEA4 (rood) en Oct4 (groen) in iPSC's. (B) Immunostaining van Nestin (rood) en Pax6 (groen) in van iPSC afgeleide neuronbollen. (C) Immunostaining van Nestin (rood) en Sox2 (groen) in van iPSC afgeleide NSC's. Kernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). Schaalstaven = 50 μm. Afkortingen: iPSC's = geïnduceerde pluripotente stamcellen; NSC's = neurale stamcellen; SSEA4 = stadiumspecifiek embryonaal antigeen-4; Oct4 = octameerbindende transcriptiefactor 4; Pax6 = gepaarde box-6; Sox2 = geslachtsbepalend gebied Y box-2; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Representatieve confocale beelden van de van iPSC afgeleide astrocyten en DA-neuronen. (A) Immunostaining van GFAP (rood) en S100β (groen) in van iPSC afgeleide astrocyten. (B) Immunostaining van neurale afstammingsmarker TH (groen), Tuj 1 (rood) en neurale functionele marker Synaptophysin (groen) en PSD-95 (rood) in iPSC-afgeleide DA-neuronen. Kernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). Schaalstaven = 25 μm. Afkortingen: iPSC's = geïnduceerde pluripotente stamcellen; GFAP = glial fibrillary acidic protein; S100β = S100 calciumbindend eiwit β; Tuj 1 = β III Tubuline; PSD-95 = postsynaptische dichtheid eiwit 95; DA = dopaminerge; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Flowcytometrische analyse voor DA-neuronen afgeleid van één kloon van POLG-patiënt-iPSC's en één kloon van Detroit 551-controle-iPSC's. (A) Mitochondriaal volume gemeten door MTG, (B) totaal MMP gemeten door TMRE, (C) specifiek MMP-niveau berekend door totaal TMRE / MTG, (D) totale mitochondriale ROS gemeten door MitoSox Red en (E) ) specifieke mitochondriale ROS-waarde berekend met het totale aantal MitoSox Red/MTG. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) voor het aantal monsters (n ≥ 3 per kloon). Gegevens geanalyseerd en geproduceerd met GraphPad Prism-software. Mann-Whitney U-test werd gebruikt om statistische significantie voor variabelen te beoordelen. Significantie wordt aangegeven voor P < 0,05. *P < 0,05; ns, niet significant. Afkortingen: DA = dopaminergic; POLG = DNA polymerase subunit gamma; iPSC's = geïnduceerde pluripotente stamcellen; MMP = mitochondriaal membraanpotentiaal; ROS = reactieve zuurstofsoorten; MTG = MitoTracker Groen; TMRE = tetramethylrhodamine ethylester. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Flowcytometrische analyse voor astrocyten afgeleid van één kloon van POLG-patiënt-iPSC's en één kloon van Detroit 551-controle-iPSC's. (A) Mitochondriaal volume gemeten door MTG, (B) totaal MMP gemeten met TMRE, (C) specifiek MMP-niveau berekend door totaal TMRE / MTG, (D) totaal Rmitochondrial ROS S gemeten door MitoSox Red, en (E ) specifieke mitochondriale ROS-waarde berekend met het totale aantal MitoSox Red/MTG. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) voor het aantal monsters (n ≥ 3 per kloon). Gegevens geanalyseerd en geproduceerd met GraphPad Prism-software. Mann-Whitney U-test werd gebruikt om statistische significantie voor variabelen te beoordelen. Significantie wordt aangegeven voor P < 0,05. *P < 0,05; ns, niet significant. Afkortingen: POLG = DNA polymerase subunit gamma; iPSC = geïnduceerde pluripotente stamcel; MMP = mitochondriaal membraanpotentiaal; ROS = reactieve zuurstofsoorten; MTG = MitoTracker Groen; TMRE = tetramethylrhodamine ethylester. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Flowcytometrische analyse voor DA-neuronen afgeleid van één kloon van POLG-patiënt-iPSC's en één kloon van Detroit 551-controle-iPSC's. (A) Totaal complex I gemeten met NDUFB10, (B) specifiek complex I-niveau berekend met totaal NDUFB10/TOMM20, (C) totaal complex II gemeten door SDHA, (D) specifiek complex II-niveau berekend met totaal SDHA/TOMM20, (E) totaal TFAM gemeten door TFAM, en (F) specifiek TFAM-niveau berekend met totaal TFAM/TOMM20. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) voor het aantal monsters (n ≥ 3 per kloon). Gegevens geanalyseerd en geproduceerd met GraphPad Prism-software. Mann-Whitney U-test gebruikt om statistische significantie voor variabelen te beoordelen. Significantie wordt aangegeven voor P < 0,05. *P < 0,05; ns, niet significant. Afkortingen: DA = dopaminergic; POLG = DNA polymerase subunit gamma; iPSC = geïnduceerde pluripotente stamcel; NDUFB10 = NADH: Ubiquinonoxidoreductase subeenheid 10; TOMM20 = translocase van het buitenste mitochondriale membraan 20; SDHA = succinaatdehydrogenase complex flavoproteïne subeenheid A; TFAM = mitochondriale transcriptiefactor A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Flowcytometrische analyse voor astrocyten afgeleid van één kloon van POLG-patiënt-iPSC's en één kloon van Detroit 551-controle-iPSC's. (A) Totaal complex I gemeten door NDUFB10, (B) specifiek complex I-niveau berekend door totaal NDUFB10 / TOMM20, (C) totaal complex II gemeten door SDHA, (D) specifiek complex II-niveau berekend door totaal SDHA / TOMM20, (E) totaal complex IV gemeten met COX IV, (F) specifiek complex IV-niveau berekend met COX IV / TOMM20, (G) totaal TFAM gemeten door TFAM, en (H) specifiek TFAM-niveau berekend met totaal TFAM / TOMM20. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) voor het aantal monsters (n ≥ 3 per kloon). Gegevens geanalyseerd en geproduceerd met GraphPad Prism-software. Mann-Whitney U-test werd gebruikt om statistische significantie voor variabelen te beoordelen. Significantie wordt aangegeven voor P < 0,05. *P < 0,05; ** P < 0,01; ns, niet significant. Afkortingen: POLG = DNA polymerase subunit gamma; iPSC = geïnduceerde pluripotente stamcel; NDUFB10 = NADH: Ubiquinonoxidoreductase subeenheid 10; TOMM20 = translocase van het buitenste mitochondriale membraan 20; SDHA = succinaatdehydrogenase complex flavoproteïne subeenheid A; TFAM = mitochondriale transcriptiefactor A; COX IV = cytochroom c-oxidasecomplex IV. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Instellingen van de confocale laserscan fluorescentiemicroscoop en stappen voor het maken van foto's. (A) Kies het configuratiegereedschap en selecteer het juiste lasertype uit De huidige beschikbare laser en stel het vermogen in. (B) Kies Acquire-Acquisition Mode-SEQ en selecteer de bijbehorende fluorescentiegolflengte fotomodus in de database. (C) Kies Sequential Scan-Load en importeer de bijbehorende modus. (D) Kies een lens met 40x objectief en voeg dropwise toe. (E) Specifieke instellingsparameters voor het maken van foto's op verschillende golflengten. (F) Stel fotoparameters in, bekijk een voorbeeld en sla de foto op. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Stappen en instellingen voor flowcytometrie. (A) Open Cflow-software, kies het gereedschap Bestand en selecteer CFlow-bestand of -sjabloon openen. (B) Stel 40000-gebeurtenissen in en selecteer de poort met alleen de live afzonderlijke cellen in het deelvenster Limieten uitvoeren. Kies Gemiddelde snelheid in het deelvenster Fluidics . (C) Kies FSC-A vs. FSC-A plot (a) voor het opzetten van de hoofdgating. Kies FSC-A vs. FSC-H plot (b) en SSC-A vs. SSC-H plot (c) om doubletten uit te sluiten. Kies de bijbehorende filters, zoals FL1 of FL2, en gebruik FL1-A vs. FSC-A plot (d) of FL2-A vs. FSC-A plot om de positieve gebeurtenissen te tekenen bij het uitvoeren van de niet-gekleurde cellen. (D) Stel dezelfde parameters in, bekijk een voorbeeld, voer de gekleurde voorbeelden uit en sla de foto op. Zie ook aanvullende tabel S2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S1: Media- en oplossingsrecepten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S2: Opstelling voor flowcytometrische kleuring. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Hierin zijn protocollen voor het genereren van iPSC-afgeleide neuronen en astrocyten en het evalueren van meerdere aspecten van mitochondriale functie met behulp van flowcytometrie. Deze protocollen maken een efficiënte omzetting van menselijke iPSC's in zowel neuronen als glia-astrocyten mogelijk en de gedetailleerde karakterisering van mitochondriale functie, meestal in levende cellen. De protocollen bieden ook een co-staining flowcytometrie-gebaseerde strategie voor het verwerven en analyseren van meerdere mitochondriale functies, waaronder volume-, MMP- en mitochondriale ROS-niveaus in levende cellen en MRC-complexen en TFAM in vaste cellen. In het bijzonder maken deze protocollen de schatting van zowel totale als specifieke niveaus per mitochondriaal volume mogelijk. Hoewel deze strategie mitochondriale disfunctie detecteert in een bekende mitochondriale ziekte (POLG) in DA-neuronen en astrocyten, zijn deze technieken van toepassing op elk type cel en ziekte. Bovendien is het protocol robuust en reproduceerbaar. Verschillende eerdere studies hebben dit protocol met succes toegepast om de mitochondriale veranderingen in fibroblasten, iPSC's, NSC's, DA-neuronen en astrocyten 2,3,13,17 te analyseren.

Er zijn enkele kritieke punten waarmee u rekening moet houden bij het uitvoeren van dit protocol. Om een consistente en zeer efficiënte differentiatie te garanderen, is het van cruciaal belang om de conversie te starten met hoogwaardige iPSC's (cellen die <5% gedifferentieerde cellen bevatten). Hoewel andere commercieel beschikbare gedefinieerde media geldige alternatieven kunnen zijn, ging deze studie niet in op de alternatieven. Aangezien mediumsamenstelling en klonale verschillen van iPSC-lijnen zowel de proliferatie van de startende celpopulatie als de differentiatie-efficiëntie kunnen beïnvloeden, zal het aanpassen van dit protocol aan andere onderhoudsmedia waarschijnlijk optimalisatie vereisen.

De relatie tussen MTG en MMP fluorescentie is eerder bestudeerd³. Dit is belangrijk omdat MTG-fluorescentie naar verluidt zowel onafhankelijk is van¹⁸ als gevoelig voor MMP^19,20. In eerdere studies waarin iPSC's werden getitreerd met verschillende concentraties TMRE en gelijktijdig werden gekleurd met 150 nM MTG, bleef het MTG-niveau hetzelfde bij lagere concentraties TMRE (5-100 nM), terwijl een verlaagd MTG-signaal werd waargenomen voor hogere TMRE-concentraties (meer dan 100 nM). Daarom werd gekozen voor 100 nM TMRE en 150 nM MTG om het specifieke MMP te meten. Aangezien deze relatie celspecifiek kan zijn, moet de correlatie tussen MTG- en MMP-fluorescentie worden beoordeeld voordat MTG- en TMRE-dubbele kleuring wordt gebruikt om MMP te meten.

Celdichtheid kan ook de mitochondriale functie en het celmetabolisme beïnvloeden. In deze studie werden celdichtheidsafhankelijke veranderingen in MMP waargenomen, wat ook in andere studies is aangetoond²¹. Daarom is het belangrijk om een vergelijkbare celdichtheid in alle monsters te kiezen - niet te hoog of te laag - om variatie te minimaliseren bij het vaststellen van het co-kleuringprotocol voor verschillende celtypen. In vergelijking met andere op microscopie gebaseerde assays heeft flowcytometrie de voordelen van snelheid en reproduceerbaarheid bij het analyseren van grote aantallen cellen. Bij de analyse van microscopische beelden zal de bias van onderzoekers de resultaten tot op zekere hoogte vervormen, wat geen probleem is bij het gebruik van flowcytometrie. Bovendien vereist flowcytometrie-analyse minder dan een miljoen cellen en duurt de analyse van één monster slechts enkele minuten, wat betekent dat tientallen monsters in 1-2 uur kunnen worden geanalyseerd. Deze techniek kan ook worden toegepast op een breed scala aan celtypen, waaronder die van andere neurodegeneratieve ziekten, en zou daarom nuttig moeten zijn voor het begrijpen van mechanismen en het testen van potentiële therapieën bij verschillende neurodegeneratieve ziekten.