Construcción manual de un microarray de tejido utilizando el método de cinta y un microarrayer de mano

Uno de los componentes más críticos del proceso de construcción de TMA es la revisión patológica de los bloques donantes de FFPE de los que se obtendrán los núcleos de TMA⁴. Durante la revisión, un patólogo certificado por la junta examina una sección representativa de tejido teñido de H&E de cada bloque donante. Es imperativo que el H&E se genere utilizando una sección de tejido recién cortada para que sea la mejor representación de su bloque donante correspondiente. No se recomienda el uso de H&E más antiguos dado que los tejidos FFPE son estructuras de 3 dimensiones cuyo perfil tisular puede cambiar significativamente con la profundidad del bloque y la sección extensa; esto puede haber ocurrido desde que se generó el H&E, lo que podría hacer que su representación del bloque FFPE sea inexacta. El proceso de revisión es esencial para la selección de casos adecuados y la identificación de áreas de tejido de donde se deben obtener los núcleos, así como la identificación de áreas que deben evitarse al recolectar núcleos. En ausencia de revisión patológica, la probabilidad de incluir tejidos inadecuados aumenta significativamente. La inclusión de tales tejidos tiene el potencial de hacer que la TMA construida sea ineficaz e inadecuada para su propósito previsto. Es importante destacar que, sin saberlo, el uso de tales TMA ineficaces tiene un enorme potencial para dar lugar a datos falsos y engañosos. Esto, combinado con el conocimiento de que el perfil de los tejidos FFPE, y por lo tanto sus núcleos derivados, puede cambiar significativamente con una profundidad cada vez mayor, destaca la importancia de la revisión continua de la patología a lo largo de la vida útil de un bloque TMA construido. Idealmente, los H&Es deben generarse utilizando^{cada sección 15 o} 20 para garantizar que se capturen y registren los cambios en los perfiles tisulares de los núcleos. Como mínimo, H&E debe generarse y revisarse al comienzo y al final de un proyecto para monitorear estos cambios potenciales. A la luz de estos puntos y la importancia de la TMA como herramienta de investigación, es imperativo que la revisión patológica esté firmemente arraigada en el proceso de construcción de la TMA y durante toda la vida útil del bloque TMA.

Los bloques FFPE a menudo se seccionan ampliamente durante el procesamiento de diagnóstico de rutina antes de ser liberados con fines de investigación. Como resultado, la profundidad del bloque del donante y, por lo tanto, las longitudes del núcleo del bloque del donante a menudo son menores que el ideal del método receptor de 4 mm. Aquí hemos demostrado cómo construir TMA utilizando el protocolo de construcción del método de cinta, cuya principal ventaja es su compatibilidad con núcleos de bloques de tejido FFPE no ideales. Aunque el método de cinta es de gran valor de investigación y ofrece un método económico, conveniente y accesible para construir bloques TMA, no está exento de desafíos y limitaciones. En comparación con los métodos de receptores automáticos y manuales, que pueden acomodar 100-1,000 núcleos en un solo bloque TMA, se recomienda un máximo de 40 núcleos para los TMA construidos utilizando el método^{de cinta 9}. Otra limitación es con respecto a la facilidad de construcción. En el método receptor, los núcleos perforados simplemente se insertan en un molde prefabricado, que proporciona estabilidad al núcleo al envolver cada núcleo en su propio pozo individual, evitando así la migración del núcleo y promoviendo la colocación y separación del núcleo altamente regular²². Además, el método de destinatario ofrece la comodidad opcional de ser completamente manual, semimanual y totalmente automatizado. Por el contrario, el método de cinta manual requiere una colocación cuidadosa y suave de cada núcleo a mano utilizando una púa de aguja. Aunque la ausencia de un molde prefabricado en el método de cinta impide la colocación y separación altamente regulares experimentadas con el método receptor, esta deficiencia se supera mediante la inclusión de una rejilla a cuadros. Es importante que la rejilla a cuadros se fije en el centro de la bandeja de metal para evitar la colocación del borde del bloque, lo que aumenta el riesgo de pérdida del núcleo si no hay suficiente parafina que mantenga el núcleo en su lugar. También debe tenerse en cuenta que las pequeñas separaciones de núcleos posibles con el método receptor no se pueden lograr con el método de cinta debido a la colocación manual del núcleo y la necesidad de que la selección de la aguja encaje entre los núcleos adyacentes. Los núcleos se colocan de manera erecta independiente con la menor superficie o huella del núcleo que entra en contacto con la rejilla cubierta por DSST. Esta configuración proporciona significativamente menos estabilidad del núcleo que el método receptor y confiere un mayor riesgo de derribo del núcleo y/o migración al verter la parafina fundida. De hecho, uno de los pasos más críticos en el protocolo es verter la parafina fundida. Es esencial que esto se haga rápidamente al retirarla del horno para garantizar que la parafina sea completamente líquida y que el vertido se realice suavemente con una turbulencia mínima. Curiosamente, Chen et al. desarrollaron un dispositivo auxiliar altamente novedoso, similar a una plantilla con orificios de 7 x 11 distribuidos uniformemente de 2 mm de diámetro, que se coloca sobre un bloque de parafina en blanco para guiar las agujas al crear el bloque receptor y al insertar los núcleos del bloque donante²³. Aunque está diseñado para ayudar a la construcción de bloques receptores, dicho dispositivo podría adaptarse fácilmente al método de cinta para guiar la colocación, regular la separación y aumentar la estabilidad del núcleo durante el proceso de construcción.

Uno de los efectores más importantes de la estabilidad del núcleo es el número de núcleos incluidos en un método de cinta TMA. Esto se debe a que a medida que aumenta el número de núcleos, el diámetro del núcleo debe reducirse para acomodar el creciente número de núcleos, lo que a su vez reduce la huella del núcleo que se adhiere al DSST. Se recomienda un diámetro mínimo del núcleo de 1 mm para la construcción de TMA con método de cinta, ya que hemos encontrado que los núcleos con diámetros más pequeños son particularmente inestables y propensos a derrumbarse incluso con un vertido de parafina muy suave. Un estudio reciente que investigó dos métodos internos diferentes que utilizaron agujas de 16 G (diámetro del núcleo de 1,1 mm) y un punzón de 4 mm de diámetro experimentó pérdidas sustanciales de tejido con los 1,1 mm (26,5%) pero no con los núcleos de 4 mm²⁴. Esto parece indicar que los núcleos pequeños pueden ser problemáticos para trabajar y no solo durante la construcción. Además, los diámetros más pequeños pueden no representar el bloque original del donante, así como los núcleos más grandes, lo que dificulta la interpretación patológica y aumenta la probabilidad de una representación inexacta del tejido del donante.

La inclusión y colocación de bloques de orientación es de profunda importancia en la construcción de TMA. Sin embargo, esto es de particular importancia para los TMA construidos por el método de cinta. Esto se debe al hecho de que el método de cinta invierte el proceso de construcción, lo que aumenta el riesgo de desorientación espacial. Aconsejamos incluir hasta tres núcleos de orientación en cada bloque, y que se coloquen lejos de los núcleos de muestra para orientar mejor el bloque. Los núcleos de orientación pueden ser núcleos tomados de bloques de tejido que contienen tejidos claramente diferentes del tema de la TMA construida o herramientas de orientación de color libre de tejido²¹, donde esta última es particularmente útil para los no patólogos. Combinados con la colocación de núcleos con patrones de matriz no regulares, los núcleos de orientación minimizan el riesgo de desorientación.

La pronunciada diferencia en la longitud del núcleo entre los TMA construidos utilizando la cinta y los métodos receptores se deriva de la inclusión de la profundidad del bloque donante en el proceso de toma de decisiones al seleccionar el método de construcción. El protocolo descrito aquí emplea un umbral donde los TMA se construyen utilizando los métodos de cinta y receptor cuando los bloques del donante tienen profundidades de <4 mm y 4 mm, respectivamente. Es importante tener en cuenta que la inclusión de la profundidad del bloque donante en la elección del método de construcción no es universal. Aunque es posible que los TMA se construyan utilizando cualquiera de los métodos, independientemente de la profundidad del bloque donante, los núcleos más altos pueden interferir con, y o ser derribados o inclinados por, la colocación del cassette de plástico durante la construcción de TMA utilizando el método de cinta. La elección de incluir u omitir criterios en el proceso de toma de decisiones depende de las comodidades disponibles para el laboratorio, el costo y el producto final deseado. Bajo los parámetros de este protocolo, el número de secciones TMA montadas en diapositivas que se pueden obtener de un método de cinta construido TMA es significativamente menor que el obtenido de un método receptor construido TMA. Aunque es posible volver a bloquear los tejidos FFPE para aumentar la profundidad del bloque donante y hacerlos compatibles con el método receptor, la probabilidad de lograr la misma orientación tisular dentro del rebloqueo es baja. A su vez, esto puede requerir una extensa cara de bloque para obtener una sección de cara completa, lo que probablemente incluiría una pérdida significativa de tejido. Después de la orientación del bloque, un método de cinta construido TMA produce aproximadamente 50 secciones TMA montadas en diapositivas con todos los núcleos presentes. Sin embargo, el número exacto variará de un bloque a otro y depende de la longitud de los núcleos utilizados para construir el TMA y del grosor de las secciones que se cortan (5 μm frente a 4 μm). Además, también debe tenerse en cuenta que debido a sus diferentes longitudes de núcleo, los núcleos se agotarán en diferentes momentos a medida que el TMA se seccione progresivamente; un atributo que vuelve a enfatizar la necesidad de una revisión patológica continua.

Aunque el método receptor ofrece beneficios y ventajas significativos sobre el método de cinta, incluidos procesos de construcción menos tediosos y más expeditivos, el método de cinta no está dirigido a laboratorios experimentados de alto rendimiento. Está dirigido al laboratorio promedio, particularmente a aquellos en entornos de recursos limitados, con acceso a bloques de donantes de profundidades variables, pero no a los servicios de construcción de TMA. Sin embargo, las aplicaciones futuras podrían ver la automatización de este método para mejorar el grupo de muestras elegibles en laboratorios de alto rendimiento y eliminar la necesidad de volver a bloquear los bloques de donantes. En conclusión, el protocolo de construcción del método de cinta TMA descrito se puede establecer fácilmente en laboratorios no especializados sin la necesidad de equipos costosos. Sin embargo, se aconseja que los nuevos usuarios deben emplear bloques de tejido FFPE sin valor, herramientas de orientación de color libre de tejido²¹ o incluso bloques de parafina de color sin tejido al principio para familiarizarse con la técnica del método de cinta antes de avanzar a la construcción de TMA utilizando tejidos preciosos. Aunque su construcción no está exenta de peligros potenciales, que tanto aquellos que construyen como usan bloques TMA deben tener en cuenta, este método de construcción TMA “casero” aparentemente sin pulir puede producir TMA de alta calidad y biológicamente relevantes para la investigación. De hecho, las secciones de TMA derivadas de TMA construidas con método de cinta se encuentran entre una de las muestras de tejido más solicitadas en el biorepositorio ACSR.