PCR-플레이트 딥웰 마이크로플레이트 장치를 이용한 더 큰 박테리아 바이오필름 바이오매스의 생성

이 연구의 목적은 딥 웰 생물막 장치를 사용하여 더 큰 부피, 높은 처리량 (96-well), 정적 생물막 장치 측정을 수행하는 방법을 제공하는 것이 었습니다. 여기서, 우리는 딥 웰 장치로 알려진 딥 웰 마이크로플레이트에 삽입된 자체 조립된 세미 스커트 PCR 플레이트를 정적 바이오필름을 형성하는 그들의 능력을 조사하기 위해 일반적으로 사용되는 표준 바이오필름 고정 뚜껑 장치와 비교하였다. CV-염색된 바이오매스 및 생물막 박멸 분석법(MBEC)을 사용하여 두 장치 모두에 의한 생물막 형성을 평가하였다. 각 장치 상의 상이한 종에 의한 생물막 형성을 비교하기 위해, 생물막 CV 염색 프로토콜17을 사용하여 대장균 BW25113 및 P. aeruginosa PAO1에 의해 형성된 생물막 바이오매스를 평가하였다. CV 염색은 일반적으로 A550nm 값으로 보고되지만, 각 장치의 성장 부피와 사용 가능한 표면적의 차이로 인해 CV 염색 A550nm 값을 용액 중의 몰 CV 농도로 변환했습니다. 몰 CV 농도는 각 장치의 부피 차이를 설명하고, 각 장치로부터 회수된 바이오매스를 나타내는 CV 농도의 비교를 허용하였다. 그 결과, 두 종 모두 표준 생물막 장치에 비해 딥웰 생물막 장치(2.1배 대장균; 4.1배 P. aeruginosa)에서 유의하게 더 많은 바이오매스를 생산한다는 것을 보여주었다(도 3A-B). 이러한 결과는 표준 디바이스 페그 표면적(108.9 mm2)과 비교하여 딥 웰 PCR 페그(320.4 mm2)의 더 큰 표면적을 고려할 때 예상되었다. 이러한 발견은 또한 표준 장치 웰 (200 μL)과 비교하여 딥 웰 생물막 장치에 사용된 증가된 부피 (750 μL)와 일치한다. 따라서 딥 웰 장치는 표준 생물막 장치를 사용하는 더 작은 못과 비교하여 PCR 튜브 페그에서 바이오 필름 바이오 매스 축적을 증가 시켰습니다. 두 생물막 장치 모두 대장균과 P. aeruginosa에 의해 형성된 생물학적으로 복제된 생물막을 비교했을 때 재현 가능한 생물막을 형성하였다(도 3A-B). 딥 웰 디바이스 상에서 성장한 균주에 대한 기술적 복제 CV-염색된 M A550nm 값에서 더 큰 가변성을 관찰했음에도 불구하고, 쌍방향 양방향 분산 분석(ANOVA) 또는 스튜던트 T-검정(둘 다 p > 0.05). 이 발견은 깊은 우물과 표준 장치에 의한 생물막 형성이 재현 가능한 생물막을 형성한다는 것을 보여줍니다. 그러나, CV 염색 결과 또한 각 장치에서 페그 표면적 차이를 고려하였을 때, 대장균과 P. aeruginosa에 의한 생물막 바이오매스 형성은 바이오매스 축적에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다(표 1). 대장균에 대한 평균 CV 염색된 바이오매스(M)당 mm2(CV M/mm2)의 페그 표면적을 계산한 결과, 표준 생물막 장치와 비교했을 때 폴리프로필렌 딥 웰 장치에서 생물막 형성이 1.5배 더 낮았다(표 1). 그러나, P. aeruginosa에 대해서는 반대의 결과가 얻어졌으며, 이는 표준 생물막 장치와 비교했을 때 폴리프로필렌 딥 웰 장치에서 1.4배 더 높은 CV M/mm2를 입증하였다(표 1). 각 장치를 이용한 생물막 바이오매스 축적에서 관찰된 종별 차이에도 불구하고, 딥 웰 장치는 여전히 각 종에 의한 생물막 바이오매스 형성 전체(2-4배 증가)가 더 크다는 것을 입증하였다(도 3). 딥 웰 생물막 장치의 항균 감수성 테스트 응용을 결정하기 위해, 우리는 생물막 박멸 잠재력에 대해 일반적으로 사용되는 두 가지 소독제인 BZK와 표백제를 비교했습니다. 두 화학 물질 모두 임상 및 산업 응용 분야에서 박테리아 생물막을 예방 (BZK) 및 / 또는 근절 (표백)하는 데 일반적으로 사용됩니다.21,22,23. 각 화합물은 표준 및 딥웰 생물막 장치 상에서 대장균 및 P. aeruginosa에 의해 형성된 생물막에 2배 증가된 농도로 첨가되었다22,23 (도 1, 2B). 음성 대조군 웰과 구별할 수 없는 OD600nm 값을 초래한 BZK 또는 표백제의 최저 농도는 MBEC 값으로 정의되었다. 표백제를 사용한 표준 생물막 장치 상에 형성된 생물막의 처리는 대장균 및 P. aeruginosa에 대해 0.625%의 동일한 표백제 MBEC 값을 초래하였다(표 1, 도 4A-B). 깊은 우물 장치 상에서 형성된 대장균 및 P. aeruginosa 생물막에 대해 결정된 표백제 MBEC 값은 두 종 모두에 의해 2-4배 더 낮은 MBEC 값을 나타냈다 (E. coli; 0.156%; P. aeruginosa 0.313%)는 표준 장치와 비교하였을 때(표 1). 종 간 표백제 MBEC 값의 2배 차이는 딥 웰 장치에 대해 주목되었고, 여기서 P. aeruginosa는 대장균과 비교하여 생물막을 근절하기 위해 2배 더 높은 농도의 표백제를 필요로 하였다(도 4A-B, 표 1). 깊은 우물 장치에서 P. aeruginosa와 대장균 사이의 2배 표백제 MBEC 차이는 대장균과 비교하여 P. aeruginosa에 의한 1.5배 증가된 CV 염색된 바이오매스 형성과 반비례하는 상관관계가 있는 것으로 보인다(도 3A-B). 깊은 우물 장치 못 상의 P. aeruginosa에 의해 형성된 더 많은 양의 바이오매스는 또한 깊은 우물 상의 대장균과 비교했을 때 P. aeruginosa 생물막을 근절하기 위해 더 높은 표백제 농도가 요구되었던 이유를 설명할 수 있다(도 3A-B, 표 1). 따라서, 딥 웰 장치 생물막 박멸 분석은 두 종 모두 표백제에 취약하지만 표준 장치에 비해 더 낮은 (2-4 배) 표백제 농도에서 있음을 보여줍니다. 이것은 딥 웰 디바이스 PCR 플레이트 페그의 3배 더 큰 페그 표면적 및 부피와 반비례하여 상관관계가 있다. 이것은 표백제 노출에 대해, 더 큰 바이오매스 표면적이 생물막 박멸에 필요한 표백제 농도를 낮출 수 있음을 시사한다. BZK 생물막 박멸 시험은 표백제 결과와 비교했을 때 각 종별 회수 성장 (OD600nm 값) 및 MBEC 값에서 더 큰 변동성을 보였다 (도 4C-D). 이러한 가변성은 BZK가 잘 확립된 생물막을 근절하는 것보다 생물막 형성을 방지하는 데 더 효과적이었다는 것을 보여주는 이전 연구에 근거하여 예상치 못한 것이 아니다24,25,26. 표준 생물막 장치를 사용하여, BZK로 처리된 P. aeruginosa 생물막만이 딥 웰 장치에서 이 균주에 대해 수득된 MBEC 값(20480 μg/mL)보다 8배 낮은 일관된 MBEC 값(2560 μg/mL)을 나타냈다(표 1, 도 4C). 이러한 결과는 표준 장치 못과 비교했을 때 깊은 웰 페깅된 표면 및 플라스틱 조성물 상에 형성된 P. aeruginosa 바이오매스의 양의 차이를 반영할 수 있다. 깊은 우물과 표준 장치 모두에서 대장균에 의해 형성된 생물막의 BZK 박멸은 똑같이 열악하여 깊은 우물 장치의 경우 2560-40960 μg / mL, 표준 장치의 경우 320-10240 μg / mL의 광범위한 BZK MBEC 값을 초래했습니다 (그림 4D). 대장균의 경우, 이러한 가변성은 1-2 복제 웰이 회복 매질에서 낮지만 통계적으로 유의한 성장을 보였으며, 두 장치 중 하나에서 오차가 증가하고 BZK MBEC 결정 정확도가 감소하는 간헐적 인 사례에 의해 설명되었습니다 (그림 4D, 표 1). 이러한 가변성은 이전에 연구24,25,26에서 언급한 바와 같이 대장균 생물막을 근절하는데 BZK를 사용하는 것의 비효율성을 강조한다. 대조적으로 P. aeruginosa 생물막은 두 장치 모두에서 정의 된 농도에서 BZK에 의해 안정적으로 박멸 될 수 있지만 8 배 BZK 농도 차이 (그림 4C). 요약하면, P. aeruginosa에 의해 형성된 생물막의 BZK 박멸 MBEC 값은 각 장치와 별개의 MBEC 값을 보여주지만, 두 장치 모두 대장균을 구별하는데 있어서 동등하게 불량한 정확한 BZK 박멸 표현형을 나타낸다. 따라서, 본원에 기재된 딥 웰 생물막 장치 방법은 표준 생물막 장치와 비교할 때 재현가능한 생물막을 형성하는데 유사하게 효과적이다. 그림 1. 실험의 개략적인 개요. 냉동 보존 된 주식에서 단일 식민지의 0 일째 격리; 제1일차 성장 배지를 단일 콜로니로 접종; 제2일째 생물막 플레이트의 접종; 제3일 CV 염색 또는 항균성 챌린지; 제4일째 생물막 초음파 처리 회수 매질로; 및 5일째 MBEC 값을 결정하기 위해 회수 플레이트의 OD600nm를 판독한다. Servier Medical Art (smart.servier.com)에서 제공하는 그림의 일부 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2. 프로토콜의 다양한 단계에 대해 표시된 플레이트 레이아웃의 예. A ) 두 개의 박테리아 균주 (E. coli 및 P. aeruginosa)로부터의 제1 박테리아 배양물을 사용하여 초기 24 h 생물막 성장을 위한 최종 플레이트 셋업을, 각각 세 개의 생물학적 반복실험으로 설정한다. 음성 대조군 웰 (회색)은 멸균 대조군으로 사용됩니다 (박테리아가 추가되지 않음). B) 생물막의 항균 도전을 위한 플레이트 설정. 어두워지는 색상은 항균 농도가 증가한다는 것을 나타냅니다. 음성 대조군은 박테리아가 첨가되지 않은 웰 (회색)이며 양성 대조군은 항균 노출이없는 바이오 필름 (오렌지)입니다. 패널 A에서 가져온 생물막 못 뚜껑은 항균 노출을 위해 이 깊은 웰 플레이트로 옮겨집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3. CV 염색된 대장균 BW25113의 몰농도(M)이다. (A) P. aeruginosa PAO1(B) 바이오필름 바이오매스를 표준(원) 및 딥 웰(삼각형) 장치로부터 회수하였다. CV 염색은 550 nm (A550nm)에서 CV의 흡광도를 판독하여 측정하였고, 딥 웰 A550nm 판독값은 장치 간의 부피 차이를 고려하여 3.809 (800 μL/210 μL)의 계수로 조정하였다. CV 몰 농도 (M)는 맥주-램버트 법칙 (CV 농도 = A550nm/εl)에 의해 결정되었다; 여기서 96 웰 편평한 바닥 마이크로타이터 플레이트에서 210 μL의 경로 길이 (l)는 0.56 cm이고 251500 cm-1M-139의 A550nm에서 물에서 CV의 흡광 계수 (ε)로 측정되었다. 결과는 생물막으로서 성장한 각 균주의 세 가지 생물학적 반복실험으로부터 9개의 기술적 반복실험을 나타내며, 각 생물학적 복제물의 중앙값은 각 플롯에서 가로 막대로 표시된다. 장치들 사이의 바이오매스의 통계적으로 유의한 차이는 두 꼬리 쌍을 이룬 t-검정을 사용하여 생물학적 복제 중앙값 사이에서 결정되었다 (대장균 p= 0.008-0.018 (*); P. aeruginosa p= 0.002-0.009 (**))는 별표가 있는 막대로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.  그림 4. 항균성 MBEC 농도의 결정. P. aeruginosa PAO1 (A, C) 및 대장균 BW25113 (B,D)에 대한 표백제 (A, B, D)에 대한 표백제 (A, B) 및 BZK (C,D)에 대한 항 균 성 MBEC 농도의 측정은 표준 (흰색 막대) 및 깊은 우물 (회색 막대) 생물막 고정 장치 상에서 성장하였을 때. 결과는 회수 배지 내로 초음파 처리 및 하룻밤 인큐베이션 후에 회수된 생물막의 OD600nm를 판독함으로써 결정되었다. 딥 웰 OD600nm는 장치들 사이의 부피 차이를 설명하기 위해 3.75 (750 μL/210 μL)의 계수에 의해 조정되었다. 결과는 세 가지 생물학적 반복실험으로 대표되며, 오차 막대는 각 항미생물 농도에서 반복실험 사이의 표준 편차를 보여준다39. 각 막대 플롯 위의 별표(*)는 두 꼬리 스튜던트 T-검정 계산을 사용하여 p-값이 0.05< 빈 대조군에서 OD600nm 값의 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다. 각 막대 플롯 위의 원 기호(o)는 1 또는 2번의 반복실험만이 빈 대조군으로부터 통계적으로 유의한 OD600nm 값을 갖는 측정값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. BZK MBEC (μg/mL) 표백제 MBEC (% v / v) 균주 테스트 깊은 우물 장치 표준 장치 깊은 우물 장치 표준 장치 대장균 BW25113 2560-40960 320-10240 0.156 0.625 P. aeruginosa PAO1 20480 2560 0.313 0.625 깊은 우물 장치 표준 장치 p-값** 폴드 변경(딥 웰/표준) 균주 테스트 평균 CV M * / mm2 ± SD 평균 CV M * / mm2 ± SD 대장균 BW25113 1.99 x 10-8 ± 3.25 x10-9 3.03 x 10-8 ± 3.31 x 10-9 0.0176 -1.52 P. aeruginosa PAO1 8.01 x 10-8 ± 9.42 x 10-9 5.72 x 10-8 ± 9.42 x 10-9 0.034 1.4 표 1. 다양한 장치에서 BZK 및 표백제에 대한 대장균 BW25113 및 P. aeruginosa PAO1 평균 CV-염색된 바이오매스 M/mm2 값 및 생물막 박멸 MBEC 값의 요약이다.*생물학적 복제 CV M 값의 중앙값을 사용하여 계산된 평균 CV M/mm2 값(그림 3).**p-값은 두 꼬리 스튜던트 T-테스트를 사용하여 결정됩니다.