Celvrije geschaalde productie en adjuvante toevoeging aan een recombinant belangrijk buitenmembraaneiwit van Chlamydia muridarum voor vaccinontwikkeling

Alle dierstudies werden uitgevoerd aan de Universiteit van Californië, Irvine, in public health service (PHS) -verzekerde faciliteiten in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Glaswerk voorbereiding OPMERKING: Alle materialen die worden gebruikt bij het produceren van vaccinformuleringen voor dieren zijn endotoxinevrij. Om vervuilende endotoxine te vernietigen, bakt u gereinigd glaswerk dat buffers in een oven op 180 °C gedurende 4 uur vasthoudt. 2. Buffervoorbereiding Bereid 250 ml van de Ni-affiniteitszuiveringsbuffers in tabel 1. Bewaar ze bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden. 3. Reactie voorbereiding Weeg 20 mg 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC) af in een endotoxinevrije centrifugebuis van 1,5 ml. Los het op in 1 ml endotoxinevrij water, sonde-soniceer minstens vier keer bij 6 A gedurende 1 minuut, met pauzes van 1 minuut ertussen, totdat het helder is. Verwijder alle verontreinigingsmetalen uit de sonde door centrifugeren bij 13.000 × g gedurende 2 minuten bij 22 °C en breng het opgeloste lipide vervolgens over in een nieuwe endotoxinevrije buis van 1,5 ml. Weeg 1 mg PEG5k-CA8 telodendrimer af in een endotoxinevrije buis van 1,5 ml. Los op in endotoxinevrij water tot een concentratie van 20 mg / ml. Vortex totdat het volledig is opgelost en verdund tot 2 mg / ml. Combineer in een nieuwe endotoxinevrije buis 210 μL 20 mg/ml DMPC-oplossing met 210 μL 2 mg/ml telodendrimer-oplossing. 4. Celvrije productie van MOMP-tNLP’s voor subunitvaccinformuleringen Bereid MOMP-tNLP’s voor met behulp van celvrije methoden die zijn aangepast op basis van een eerder gepubliceerd protocol5.Twee uur voor het opzetten van de celvrije reactie, opent u de prokaryote celvrije eiwitexpressiekit en ontdooit u een van de reconstitutiebuffers. Voeg eenmaal ontdooid een tablet EDTA-vrije proteaseremmercocktail toe en laat deze volledig oplossen. Volg dit protocol met behulp van een kit die is ontworpen om 5 x 1 ml reacties uit te voeren.OPMERKING: Een typische opschalingsproductie is 3 x 1 ml.Voeg voor elke reactie van 1 ml 525 μL reconstitutiebuffer toe aan de E. coli-lysaatfles en rol voorzichtig om op te lossen . Voeg 250 μL reconstitutiebuffer toe aan de fles met reactieadditieven (bijv. ATP, GTP) en rol voorzichtig om op te lossen. Voeg 8,1 ml reconstitutiebuffer toe aan de reactietoevoerfles, sluit af met een rubberen stop (zorg ervoor dat u de binnenkant van de rubberen stop niet raakt) en keer / rol voorzichtig om op te lossen. Voeg 3 ml reconstitutiebuffer toe aan de fles met het aminozuurmengsel, sluit af met een rubberen stop en keer / rol voorzichtig om om op te lossen.OPMERKING: Zorg ervoor dat u de binnenkant van de rubberen stop niet aanraakt, omdat dit tot verontreiniging kan leiden. Voeg 1,8 ml reconstitutiebuffer toe aan de methioninefles, rol voorzichtig om op te lossen en bewaar vervolgens op ijs tot gebruik. Bereid de reactieoplossing voor.Voeg aan de E. coli-lysaatfles 225 μl gereconstitueerde reactiemix, 270 μl gereconstitueerd aminozuurmengsel zonder methionine en 30 μl gereconstitueerde methionine toe . Voeg daarnaast 400 μL van het DMPC/telodendrimer-mengsel, 15 μg MOMP-plasmide en 0,6 μg Δ49ApoA1-plasmide toe. Rol/schud zachtjes om te mengen.OPMERKING: Zorg ervoor dat beide plasmiden zijn opgebouwd uit dezelfde plasmide-ruggengraat. Niet vortexen. Neem 20 μL van de totale oplossing en zet deze opzij in een buis van 1,5 ml voor de GFP-expresserende controlereactie (zie hieronder). Bereid de voedingsoplossing voor. Voeg aan de fles van de voedermix 2,65 ml gereconstitueerd aminozuurmengsel zonder methionine en 300 μl gereconstitueerde methionine toe. Rol/schud zachtjes om op te lossen.OPMERKING: Op dit moment kunnen de ongebruikte reconstitutiebuffer en methionine worden teruggebracht naar de vriezer voor opslag. Breng 1 ml van de reactieoplossing over naar de binnenste reactiekamer in de celvrije reactiekit en sluit deze af wanneer deze is gevuld. Breng 10 ml van de voedingsoplossing over naar de buitenste kamer van het reactievat en de afdichting.LET OP: Vul de kamers niet te vol! De aanwezigheid van luchtbellen aan de bovenkant van zowel de binnenste reactiekamer als de binnenste toevoerkamer zal de reactie nadelig beïnvloeden. Elke resterende reactieoplossing kan in een buis van 1,5 ml worden geplaatst en naast het hoofdvat worden gemengd. Voeg 0,5 μL van het GFP-controleplasmide (0,5 mg/ml) toe aan het eerder geciteerde reactiemengsel van 20 μL.OPMERKING: Veel kits worden geleverd met een controleplasmide voor kwaliteitscontroledoeleinden. De meeste GFP-expressieplasmide met een T7-promotor en E.coli-ribosoombindingsplaats (RBS) kunnen ook worden gebruikt als controleplasmide. Plaats de reactie in een schudder bij 300 tpm, 30 °C gedurende maximaal 18 uur. Om te controleren of de reactie succesvol was, gebruikt u een UV-lichtbron om te controleren op fluorescentie als gevolg van de synthese van de controle-GFP (figuur 1A) na slechts 15 minuten incubatie.OPMERKING: Deze omstandigheden, met name temperatuur, moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor expressie van andere membraaneiwitten. 5. MOMP-tNLP zuivering Gebruik geïmmobiliseerde nikkelaffiniteitschromatografie om het MOMP-tNLP nanodeeltjescomplex uit het celvrije reactiemengsel te zuiveren met behulp van de His-tag op het Δ49ApoA1-eiwit.Breng 1 ml van een 50% slurry van His-Tag Purification Resin over naar een wegwerpchromatografiekolom van 10 ml en breng deze in evenwicht met 3 ml bindingsbuffer. Laat de buffer leeglopen, sluit de uitlaat af en voeg 250 μL bindingsbuffer toe aan de hars. Voordat u de celvrije reactie aan de kolom toevoegt, slaat u 20 μL op voor latere analyse door SDS-PAGE. Meng de celvrije reactie met de gebalanceerde hars en incubeer deze op een laboratoriumwip bij 4 °C gedurende 1 uur. Maak de kolom los, was de dop met 500 μL extra bindingsbuffer en voeg deze vloeistof toe aan de rest van de kolom. Verzamel de vloeistofdoorstroming uit de kolom voor latere analyse door SDS-PAGE. Was de kolom zes keer met 1 ml wasbuffer met 20 mM imidazool en verzamel fracties. Zorg ervoor dat u de hars niet laat uitdrogen tussen de wasbeurten door. Roer bij de tweede wasbeurt de hars krachtig door op en neer te pipetteren met een pipet van 1 ml. Elueer de MOMP-tNLPs in zes 300 μL fracties van Elution buffer 1 (met 250 mM imidazool), gevolgd door een laatste elutie met 300 μL Elution buffer 2 (met 500 mM imidazool). Bij de tweede elutie roert u de hars krachtig door op en neer te pipetteren met behulp van een pipet van 1 ml. 6. Analyse door SDS-PAGE OPMERKING: Alle elutiefracties moeten worden geanalyseerd door SDS-PAGE om te screenen op hoeveelheid en zuiverheid van het eiwit van belang. Belast 1 μL elk van het totale lysaat en de doorstroom en vervolgens 5 μL voor alle verzamelde wasbeurten en elutiefracties.Meng aliquots van de geëlueerde MOMP-tNLPs, wasbeurten, doorstroming en totaal lysaat met 4x SDS-PAGE sample loading buffer. Meng en denatureer de monsters met 10x monsterreductiemiddel, tenzij anders aangegeven. Analyseer de fracties door gelelektroforese met behulp van 1,0 mm, 4 tot 12%, Bis-Tris SDS-PAGE-gels met 1x MES-SDS-loopbuffer, samen met een geschikte molecuulgewichtsstandaard. Laat de gels 35 minuten draaien op 200 V. Bevlek de gels volgens de instructies van de fabrikant.Verwijder de gel uit de cassette en plaats deze in 60 ml gelvlek. Magnetron de gel in de gelvlek gedurende 30 s en schommel de container voorzichtig gedurende 30 s om de warmte gelijkmatig te verdelen. Magnetron de gel in de vlek tot 80-85 °C gedurende nog eens 30 s en plaats de gel op een orbitale shaker om gedurende 5 minuten te schommelen. Magnetron de gel een derde keer gedurende 30 s en keer dan terug naar de orbitale shaker om nog eens 23 minuten te schommelen. Breng de gel over in een schone container en was gedurende 30 minuten in 100 ml wasoplossing (10% methanol, 7% azijnzuur).OPMERKING: Dit is een cruciale stap omdat het essentieel is om te voorkomen dat de wasoplossing wordt verwarmd. Als u dit niet doet, kan dit leiden tot achtergrondkleuring en onregelmatigheden in het uiteindelijke gelbeeld. Spoel de gel na het wassen twee keer af in ultrapuur water gedurende elk 5 minuten. Beeld de gels af met een gel-imager op 600 nm (figuur 2). Gebruik SDS-PAGE om de hoeveelheid individueel eiwit in de nanodeeltjesoplossing te kwantificeren als er een eiwitstandaard is voor vergelijking.OPMERKING: In dit voorbeeld worden seriële verdunningen van recombinant tot expressie gebrachte MOMP opgelost door SDS-PAGE en worden de dichtheden van de banden gekwantificeerd met behulp van instrumentsoftware. Genereer een standaardcurve met behulp van de dichtheden van de MOMP-banden. Los de MOMP-tNLP-monsters op dezelfde SDS-PAGE-gel op en bereken de MOMP-component van de deeltjes met behulp van de MOMP-standaardcurve (figuur 3). 7. Western en dot blots en opslag Voor western blotting, los de monsters op met SDS-PAGE en breng de gels over met behulp van een commercieel droog blottingsysteem met standaardinstellingen volgens het protocol van de fabrikant.Verwijder de vlekken uit de stapel nadat de overdracht is voltooid en incuber elke vlek ‘s nachts bij 4 °C in een geschikte blokkeringsbuffer met 0,2% Tween 20 en 0,5 mg / ml MAb40 of 0,2 mg / ml MAbHIS anti-His-tag-antilichaam gericht tegen het His-tag van Δ49ApoA1-eiwit.OPMERKING: De antilichaamverdunningen die worden gebruikt voor blotting zijn 1:1.000 voor MAb40 en 1:500-1.000 voor MAbHIS-antilichaam. Was elke vlek 3 keer gedurende 5 minuten met PBS-T (1x PBS, 0,2% Tween 20, pH 7,4). Incubeer de vlekken gedurende 1 uur in een blokkerende buffer met secundair antilichaam geconjugeerd aan een fluorofoor (bijv. IRDye) bij een verdunning van 1:10.000. Was de vlekken 3 keer gedurende 5 minuten opnieuw met PBS-T. Gebruik een fluorescentiebeeldcamera om de vlekken na de laatste wasbeurt in beeld te brengen. Voor dot blots, dep 3 μg gezuiverde MOMP-tNLP en leeg tNLP met behulp van een dot blot apparaat. Blokkeer en ontwikkel de vlekken met behulp van dezelfde methoden die hierboven zijn beschreven voor western blotting. 8. Beoordeling van endotoxine Kwantificeer endotoxineniveaus met behulp van een endotoxinetestsysteem op basis van de Limulus Amebocyte Lysate (LAL) -test. Bereid endotoxinevrije 25 mM Tris, pH 7,4, monsterbuffer met behulp van 1 M Tris-hydrochlorideoplossing en endotoxinevrij water.OPMERKING: Doorgaans moeten monsters worden verdund met behulp van deze monsterbuffer en moeten de verdunningen worden aangepast om het geschikte bereik voor afzonderlijke monsters te vinden. Hier worden MOMP-tNLP-monsters 500-voudig verdund in de monsterbuffer en wordt 25 μL in elke put van een apparaatpatroon geladen met een gevoeligheid van 0,05 EU/ml. De endotoxinespiegels van MOMP-tNLP en lege tNLP die in de hieronder beschreven muisstudies worden gebruikt, liggen tussen 0,4 en 12 EU/μg-eiwit, afhankelijk van het monster. 9. Lyofilisatie Lyofileer en bewaar de MOMP-tNLP nanodeeltjes voor langdurig (tot jaren) gebruik bij -20 °C. Om tNLP- en MOMP-tNLP-suspensies voor lyofilisatie voor te bereiden, voegt u trehalose toe als beschermmiddel tijdens het vries- en lyofilisatieproces.OPMERKING: Dit proces is uitgebreid gevalideerd voor een verscheidenheid aan tNLP-formuleringen 7,8. Deel het huidige volume van de MOMP-tNLP-oplossing door 9 om het volume van 1 M trehalose te verkrijgen in steriel, endotoxinevrij, gedeïoniseerd water dat nodig is om een eindconcentratie van 0,1 M trehalose te bereiken. Noteer het uiteindelijke volume en aliquot in endotoxinevrije polypropyleenbuizen van 15 ml of 50 ml naar wens. Vries de gemengde oplossing in op droogijs en lyofileer het een nacht met behulp van een lyofilisator. Bewaar de gedroogde formuleringen bij -20 °C totdat ze nodig zijn. Reconstitueer gelyofiliseerde tNLP’s met behulp van endotoxinevrij water. Rol zachtjes totdat de gelyofiliseerde cake volledig is opgelost en gerehydrateerd. Om trehalose te verwijderen, dialyseert u de oplossing tegen PBS met behulp van een 3,5 kDa cutoff dialysemembraan. 10. Adjuvante toevoeging OPMERKING: Deze en andere soortgelijke op NLP gebaseerde sub-unit vaccinformuleringen kunnen gemakkelijk lipofiele adjuvantia zoals CpG-ODN1826 en FSL-1 bevatten. CpG-ODN1826 is een gemodificeerd klasse B CpG-oligonucleotide (5′-tccatgacgttcctgacgtt-3′) met een volledige fosforothioaatruggegraat met een 5′ cholesterolgroep (5’-chol-C6). De conjugatie van CpG-ODN1826 aan tNLP’s wordt gemedieerd door de hydrofobe interacties tussen de cholesterolgroep en de fosfolipide bilaag van de tNLP en is aangetoond en goed gekarakteriseerd, zoals eerder gemeld 9,10. Voordat het in deze formuleringen wordt opgenomen, zuivert u het cholesterolgemodificeerde CpG door middel van reversed-phase chromatografie om verontreinigende endotoxine en eventuele niet-gemodificeerde CpG-moleculen te verwijderen.Na ontvangst van de leverancier, rehydrateer het gelyofiliseerde CpG-materiaal in endotoxinevrij water en zuiver het op een preparatieve C4 RP-HPLC-kolom met behulp van een scheidingsgradiënt bestaande uit 10 mM triethylammoniumacetaat (TEAA) (mobiele fase A) en acetonitril (mobiele fase B).OPMERKING: Aanvullende details zijn beschikbaar in tabel 2. Pool en lyofiliseer de fracties die cholesterol-gemodificeerd CpG bevatten. Om volledige verwijdering van resterende TEAA te garanderen, reconstitueert u de CpG met 15 ml endotoxinevrij water en lyofiliseert u deze drie keer. Na de uiteindelijke lyofilisatie, reconstitueer CpG in endotoxinevrij water (>20 mg / ml uiteindelijke CpG-concentratie), aliquot, en bewaar het bij -80 °C totdat het nodig is. Verdun voor toevoeging aan formuleringen de CpG tot een concentratie van 1-2,5 mg / ml.OPMERKING: FSL-1 is beschikbaar als een vaccin-kwaliteit, gelyofiliseerd poeder. Dit wordt gereconstitueerd met steriel en endotoxinevrij water in een concentratie van 1 mg / ml. Het vaccin wordt intramusculair (i.m.) toegediend, waarbij elke dosis 10 μg MOMP bevat in een totaal volume van 50 μl. Om de gewenste formuleringsdosis te bereiken, dialyseert u de nanodeeltjes in PBS en concentreert u ze met behulp van een centrifugale vacuümconcentrator voordat u adjuvante toevoegt. Wees hierbij voorzichtig om te voorkomen dat het monster volledig droogt – controleer het monstervolume elke 20-30 minuten tijdens het centrifugeren. Voeg het adjuvans onder steriele omstandigheden toe in een bioveiligheidskast. Om een succesvolle integratie te beoordelen, analyseert u de uiteindelijke formuleringen en hun componenten door analytische grootte-uitsluitingschromatografie (SEC).OPMERKING: Voor deze preparaten werd een SEC-kolom gebruikt in PBS-buffer (0,5 ml / m in stroomsnelheid) en elutie werd gedetecteerd met behulp van een UV-vis diode array-detector. De opname werd beoordeeld door de absorptie van de geadjuveerde deeltjes te vergelijken met die van de niet-geadjuveerde deeltjes bij 214 en 280 nm. Bewaar de adjuvante MOMP-tNLP en lege tNLP bij 4 °C vóór gebruik door dieren gedurende een periode van maximaal 14 dagen. Om de stabiliteit van een nieuwe tNLP-formulering volledig te beoordelen, analyseert u periodiek de opgeslagen tNLP’s door SEC.OPMERKING: De stabiliteit varieert van formulering tot formulering. 11. Serum testen Verkrijg vrouwelijke muizen van 3 weken oud (BALB/c, n = 6). Vaccineer de muizen intramusculair (i.m.) in elke achterpoot met 10 μg MOMP in de vorm van MOMP-tNLP geadjuveerd met 5 μg CpG en 1 μg FSL-1 (totaal volume per injectie = 50 ml). Observeer na vaccinatie de muizen totdat ze in staat zijn om sternale ligkracht te behouden. Vier weken na de eerste vaccinatie (prime), vaccineer de dieren een tweede keer (boost) met 10 μg MOMP in de vorm van MOMP-tNLP geadjuvaniseerd met 5 μg CpG en 1 μg FSL-1 (totaal volume per injectie = 50 ml). Op dag 56 na de eerste vaccinatie bloed verzamelen om antilichaamtiters te beoordelen. Begin met het verdoven van de muizen door i.p. een oplossing van xylazine (0,3 mg/20 g lichaamsgewicht) en ketamine (3,0 mg/20 g lichaamsgewicht) te injecteren. Knijp in de voor- en achterpoten om ervoor te zorgen dat er geen schokken optreden. Breng vaseline aan rond de ogen om droge ogen tijdens de anesthesie te voorkomen. Gebruik een micro-hematocriet capillaire buis om de retro-orbitale plexus te doorboren. Verzamel 100 ml bloed in een microcentrifugebuis. Observeer na bloedafname de muizen totdat ze herstellen van anesthesie en sternale lighouding kunnen behouden. Laat het bloed gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur stollen en laat vervolgens gedurende 10 minuten bij 2.000 × g draaien. Verzamel het serum en vries in bij -80 °C. Daag op dit moment de dieren uit met Chlamydia muridarum of euthanaseer ze. Euthanaseer de muizen door eerst i.p. een oplossing van xylazine (0,3 mg/20 g lichaamsgewicht) en ketamine (3,0 mg/20 g lichaamsgewicht) te injecteren, gevolgd door cervicale dislocatie. Test serumantistoffen die specifiek zijn voor MOMP met behulp van western blotting-technieken zoals hierboven beschreven. Pool muizensera van alle geïmmuniseerde muizen en gebruik het gepoolde serum in plaats van een primair antilichaam bij een verdunning van 1:5.000.