Cristalização no chip e difração serial em larga escala à temperatura ambiente

Devido aos efeitos ionizantes da radiação de raios-X, a cristalografia de proteínas, em grande medida, tem sido limitada a condições criogênicas nas últimas três décadas. Portanto, o conhecimento atual dos movimentos das proteínas durante sua função decorre em grande parte de comparações entre estruturas estáticas observadas em diferentes estados sob condições criogênicas. No entanto, as temperaturas criogênicas inevitavelmente dificultam a progressão de uma reação bioquímica ou interconversão entre diferentes estados conformacionais enquanto as moléculas de proteína estão em ação. Para observar diretamente a dinâmica estrutural de proteínas em resolução atômica por cristalografia, métodos robustos e rotineiros são necessários para a realização de experimentos de difração à temperatura ambiente, o que exige inovações técnicas na entrega de amostras, coleta de dados e análise posterior de dados. Para tanto, avanços recentes na cristalografia seriada têm oferecido novos caminhos para a captura de imagens moleculares de intermediários e espécies estruturais de curta duração à temperatura ambiente ^1,2,3. Em contraste com a estratégia “um-cristal-um-conjunto de dados” amplamente utilizada na criocristalografia convencional, a cristalografia seriada adota uma estratégia de coleta de dados semelhante à da microscopia crio-eletrônica de partícula única. Especificamente, os dados experimentais em cristalografia seriada são coletados em pequenas frações de um grande número de amostras individuais, seguidos por um processamento intensivo de dados no qual as frações de dados são avaliadas e combinadas em um conjunto de dados completo para determinação da estrutura 3D⁴. Essa estratégia de “um cristal-um-tiro” efetivamente alivia os danos da radiação de raios-X aos cristais de proteína à temperatura ambiente por meio de uma difração antes da estratégia de destruição⁵.

Como a cristalografia em série requer um grande número de cristais de proteína para completar um conjunto de dados, ela representa grandes desafios técnicos para muitos sistemas biológicos onde as amostras de proteína são limitadas e / ou o manuseio delicado de cristais está envolvido. Outra consideração importante é a melhor forma de preservar a integridade do cristal em experimentos de difração serial. Os métodos de difração in situ abordam essas preocupações, permitindo que os cristais de proteína difratem diretamente de onde crescem sem quebrar o selo da câmara de cristalização 6,7,8,9. Esses métodos livres de manuseio são naturalmente compatíveis com difração serial em larga escala. Recentemente, relatamos o projeto e a implementação de um dispositivo de cristalização para difração in situ baseado em um conceito cristal-em-cristal – cristais de proteína cultivados diretamente em quartzo monocristalino¹¹. Este dispositivo “cristal sobre cristal” oferece várias vantagens. Primeiro, possui uma janela transparente de raios-X e luz feita de um substrato de quartzo monocristalino, que produz pouca dispersão de fundo, resultando em excelentes relações sinal-ruído em imagens de difração de cristais de proteína. Em segundo lugar, o quartzo de cristal único é uma excelente barreira de vapor equivalente ao vidro, proporcionando assim um ambiente estável para a cristalização de proteínas. Em contraste, outros dispositivos de cristalização que utilizam substratos à base de polímeros são propensos à secagem devido à permeabilidade ao vapor, a menos que o material polimérico tenha uma espessura substancial, o que, consequentemente, contribui para o alto espalhamento de fundo¹⁰. Em terceiro lugar, esse dispositivo permite a entrega de um grande número de cristais de proteína ao feixe de raios-X sem qualquer forma de manipulação ou colheita de cristais, o que é fundamental para preservar a integridade do cristal¹¹.

Para agilizar os experimentos seriais de difração de raios X usando os dispositivos cristal sobre cristal, desenvolvemos um protótipo de difratômetro para facilitar a comutação entre os modos de varredura óptica e difração de raios X¹². Este difratômetro tem uma pegada pequena e tem sido usado para coleta de dados em série em duas linhas de luz da Fonte Avançada de Fótons (APS) no Argonne National Laboratory. Especificamente, utilizamos BioCARS 14-ID-B para difração de Laue e LS-CAT 21-ID-D para oscilação monocromática. Este hardware de difratômetro não é necessário se uma linha de luz de laser de elétrons livres de síncrotron ou raios-X estiver equipada com duas capacidades principais: (1) posicionamento motorizado da amostra com uma faixa de curso de ±12 mm ao redor do feixe de raios-X em todas as direções; e (2) uma câmera digital no eixo para visualização de cristais sob iluminação luminosa que seja segura para cristais de proteína em estudo. O dispositivo de quartzo monocristalino, juntamente com um difratômetro portátil e o software de controle para varredura óptica, reconhecimento de cristais e coleta automatizada de dados in situ, constituem coletivamente a plataforma inSituX para cristalografia serial. Embora esse desenvolvimento seja motivado principalmente por suas aplicações de cristalografia dinâmica utilizando uma fonte policromática de raios-X, demonstramos o potencial dessa tecnologia para suportar métodos de oscilação monocromática^10,12. Com a automação, essa plataforma oferece um método de coleta de dados seriais de alto rendimento à temperatura ambiente com consumo de proteína acessível.

Nesta contribuição, descrevemos em detalhes como configurar a cristalização no chip em um laboratório úmido e como realizar a coleta de dados de raios-X em série em uma linha de luz síncrotron usando a plataforma inSituX.

O método do lote é utilizado para configurar a cristalização em cavaco sob uma condição semelhante à do método de difusão de vapor obtido para a mesma amostra de proteína (Tabela 1). Como ponto de partida, recomendamos o uso de precipitante na concentração de 1,2-1,5x para o método de difusão de vapor. Se necessário, a condição de cristalização em lote pode ser otimizada por meio da triagem de grade fina. As bolachas de quartzo não são necessárias para ensaios de otimização; em vez disso, podem ser usadas coberturas de vidro (veja abaixo). Dispositivos de cristalização parcialmente carregados são recomendados para manter os testes de otimização em menor escala. Várias amostras de proteína foram cristalizadas com sucesso nesses dispositivos usando o método de lote¹⁰ (Tabela 1).

O dispositivo em si consiste nas seguintes partes: 1) um anel externo; 2) duas bolachas de quartzo; 3) um calço tipo arruela de plástico ou aço inoxidável; 4) um anel de retenção; 5) óleo de imersão do microscópio como selante (Figura 1). O volume total da solução de cristalização carregada em um chip depende do propósito do experimento. A capacidade da câmara de cristalização pode ser ajustada escolhendo um calço de diferentes espessuras e/ou diâmetro interno. Rotineiramente configuramos dispositivos de cristalização de 10-20 μL de capacidade usando calços de 50-100 μm de espessura. Um dispositivo típico pode produzir dezenas a milhares de cristais de proteína adequados para a coleta de dados seriados (Figura 2).

Quando bem-sucedida, a cristalização no chip produzirá dezenas a centenas ou mesmo milhares de cristais de proteína em cada dispositivo de quartzo pronto para difração de raios-X. Em uma linha de luz síncrotron, esse dispositivo é montado em um estágio de translação de três eixos do difratômetro usando um mecanismo cinemático. A janela de cristalização de um dispositivo montado é digitalizada opticamente e fotografada em dezenas a centenas de micrografias. Essas micrografias são então costuradas em uma montagem de alta resolução. Para cristais fotossensíveis, a varredura óptica pode ser realizada sob luz infravermelha (IR) para evitar fotoativação não intencional. Um software de visão computacional foi desenvolvido para identificar e localizar cristais de proteína distribuídos aleatoriamente no dispositivo. Esses cristais são então classificados de acordo com seu tamanho, forma e posição para informar ou orientar a estratégia de coleta de dados em cristalografia seriada. Por exemplo, tiros únicos ou múltiplos podem ser localizados em cada cristal alvo. Os usuários podiam planejar uma única passagem ou várias rotas através de cristais direcionados. Implementamos um software para calcular várias rotas de viagem. Por exemplo, a rota mais curta é calculada usando algoritmos que abordam o problema do caixeiro viajante¹³. Para aplicações cristalográficas dinâmicas bomba-sonda, o tempo e a duração dos disparos de laser (bomba) e raios-X (sonda) podem ser escolhidos. Uma coleta de dados serial automatizada é programada para translocar cada cristal alvo no feixe de raios-X, um após o outro.

Os principais componentes do difratômetro insituX incluem: 1) um suporte de dispositivo; 2) uma etapa de tradução de três eixos; 3) uma fonte de luz para varredura óptica; 4) uma parada de feixe de raios-X; 5) lasers de bomba se forem estudadas proteínas sensíveis à luz; 6) Microcomputador Raspberry Pi equipado com uma câmera sensível ao IR; 7) software de controle para sincronizar motores, câmera, fontes de luz, bomba de laser, e para interface com os controles da linha de luz.