室温下的片上结晶和大规模连续衍射
Summary
本文描述了如何在晶对晶器件上设置蛋白质结晶，以及如何使用片上结晶平台在室温下执行自动串行数据收集。
Abstract
通过展示蛋白质如何在其功能状态之间转变，可以最好地理解生化反应和生物过程。由于低温是非生理性的，并且可能会阻止，阻止甚至改变蛋白质结构动力学，因此非常需要一种在室温下进行常规X射线衍射实验的稳健方法。本协议中使用的晶对晶装置及其随附的硬件和软件旨在在室温下对不同尺寸的蛋白质晶体进行 原位 X射线衍射，而无需任何样品操作。在这里，我们介绍了从器件组装、片上结晶、光学扫描、晶体识别到 X 射线拍摄计划和自动数据收集的关键步骤的协议。由于该平台不需要晶体收集或任何其他样品操作，因此可以将芯片上生长的数百至数千个蛋白质晶体以可编程和高通量的方式引入X射线束中。
Introduction
由于X射线辐射的电离效应，蛋白质晶体学在很大程度上仅限于过去三十年的低温条件。因此，目前对蛋白质功能期间运动的知识主要来自低温条件下在不同状态下观察到的静态结构之间的比较。然而，当蛋白质分子起作用时，低温不可避免地会阻碍生化反应的进展或不同构象状态之间的相互转化。为了通过晶体学以原子分辨率直接观察蛋白质结构动力学，需要在室温下进行衍射实验所需的稳健和常规方法，这需要在样品输送，数据收集和后验数据分析方面进行技术创新。为此，连续晶体学的最新进展为在室温1，2，3下捕获中间体和短寿命结构物种的分子图像提供了新的途径。与传统低温晶体学中广泛使用的“一晶一数据集”策略相比，连续晶体学采用类似于单粒子冷冻电子显微镜的数据收集策略。具体来说，从大量单个样品中收集连续晶体学中的实验数据，然后进行密集的数据处理，其中评估数据分数并将其组合成一个完整的数据集以进行 3D 结构测定4。这种“一晶一击”策略通过衍射前破坏策略有效地缓解了室温下X射线辐射对蛋白质晶体的损伤5。
由于连续晶体学需要大量的蛋白质晶体来完成数据集，因此它对许多蛋白质样品有限和/或涉及精细晶体处理的生物系统提出了重大技术挑战。另一个重要的考虑因素是如何在连续衍射实验中最好地保持晶体完整性。原位衍射方法通过允许蛋白质晶体直接从它们生长的地方衍射而不会破坏结晶室6，7，8，9的密封来解决这些问题。这些免操作方法自然与大规模连续衍射兼容。我们最近报道了基于晶体对晶体概念的原位衍射结晶装置的设计和实现 – 直接在单晶石英上生长的蛋白质晶体11。这种“晶体对晶体”设备具有多种优势。首先，它具有由单晶石英衬底制成的X射线和光透明窗口，其产生的背景散射很小，因此在蛋白质晶体的衍射图像中具有出色的信噪比。其次，单晶石英是相当于玻璃的优良蒸汽屏障，从而为蛋白质结晶提供了稳定的环境。相比之下，使用聚合物基材的其他结晶装置由于蒸汽渗透性而容易干燥，除非聚合物材料具有相当大的厚度，因此有助于高背景散射10。第三，该装置能够将大量蛋白质晶体输送到X射线束，而无需任何形式的晶体操作或收获，这对于保持晶体完整性至关重要11。
为了简化使用晶对晶器件的串行X射线衍射实验，我们开发了一个衍射仪原型，以促进在光学扫描和X射线衍射模式之间轻松切换12。该衍射仪占地面积小，已用于阿贡国家实验室先进光子源（APS）的两个光束线的串行数据收集。具体来说，我们使用BioCARS 14-ID-B进行劳厄衍射，LS-CAT 21-ID-D进行单色振荡。如果同步加速器或X射线自由电子激光束线配备了两个关键功能，则不需要这种衍射仪硬件：（1）电动样品定位，X射线束周围所有方向的行程范围为±12 mm;（2）轴上数码相机，用于在光照明下观察晶体，对正在研究的蛋白质晶体是安全的。单晶石英器件与便携式衍射仪以及用于光学扫描、晶体识别和自动 原位 数据收集的控制软件共同构成了用于连续晶体学的inSituX平台。虽然这一发展主要是由其使用多色X射线源的动态晶体学应用推动的，但我们已经证明了该技术支持单色振荡方法的潜力10，12。通过自动化，该平台提供了一种室温下高通量串行数据收集方法，并且蛋白质消耗量合理。
在本文中，我们详细描述了如何在湿实验室中建立片上结晶，以及如何使用inSituX平台在同步加速器光束线上进行串行X射线数据收集。
批量法用于在类似于相同蛋白质样品获得的气相扩散法的条件下建立片上结晶（表1）。首先，我们建议使用浓度为蒸汽扩散法1.2-1.5倍的沉淀剂。如有必要，可以通过精细网格筛选进一步优化批次结晶条件。优化试验不需要石英晶圆;可以使用玻璃盖玻片代替（见下文）。建议使用部分加载的结晶装置，以保持较小规模的优化试验。许多蛋白质样品已使用批量方法10 在此类设备上成功结晶（表1）。
设备本身由以下部分组成：1）外圈;2）两个石英晶片;3）一个塑料或不锈钢垫片;4）固定环;5）显微镜浸油作为密封剂（图1）。加载在一个芯片上的结晶溶液的总体积取决于实验的目的。结晶室的容量可以通过选择不同厚度和/或内径的垫片来调节。我们通常使用厚度为 50-100 μm 的垫片设置容量为 10-20 μL 的结晶装置。一个典型的设备可以产生数十到数千个足以用于串行数据收集的蛋白质晶体（图2）。
如果成功，片上结晶将在每个石英器件上产生数十到数百甚至数千个蛋白质晶体，准备进行X射线衍射。在同步加速器光束线上，这种装置使用运动学机构安装在衍射仪的三轴平移台上。安装设备的结晶窗口在数十到数百张显微照片中进行光学扫描和成像。然后将这些显微照片拼接成高分辨率蒙太奇。对于光敏晶体，可以在红外（IR）光下进行光学扫描，以避免意外的光活化。已经开发了一种计算机视觉软件来识别和定位随机分布在设备上的蛋白质晶体。然后根据这些晶体的大小、形状和位置对这些晶体进行排名，以告知或指导连续晶体学中的数据收集策略。例如，可以在每个目标晶体上定位单次或多次拍摄。用户可以规划通过目标晶体的单次通过或多条路线。我们已经实施了软件来计算各种旅行路线。例如，最短路线是使用解决旅行推销员问题13 的算法计算的。对于泵浦探头动态晶体学应用，可以选择激光（泵浦）和X射线（探头）射击的时间和持续时间。自动串行数据收集被编程为将每个目标晶体一个接一个地转移到X射线束中。
InplaceX衍射仪的关键部件包括：1）设备支架;2）三轴平移阶段;3）用于光学扫描的光源;4）X射线束停止;5）如果研究光敏蛋白，泵浦激光器;6）树莓派微电脑配备红外感应摄像头;7）控制软件，用于同步电机，相机，光源，泵浦激光器以及与光束线控制的接口。
Protocol
Representative Results
Discussion
早年在室温下进行的蛋白质晶体学在对抗X射线辐射损伤方面经历了巨大的困难。因此，它已被更强大的低温晶体学方法所取代，因为同步加速器X射线源变得容易获得20。随着X射线自由电子激光器的出现，室温蛋白质晶体学近年来得到了复兴，许多新的发展是由在生理相关温度下观察蛋白质结构动力学的愿望推动的2，21。基于晶体对晶…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
使用先进光子源是阿贡国家实验室为美国能源部运营的科学用户设施，得到了合同DE-AC02-06CH11357的支持。BioCARS的使用得到了美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所的支持，授权号为R24GM111072。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。LS-CAT 第 21 区的使用得到了密歇根经济发展公司和密歇根技术三走廊拨款 085P1000817 的支持。这项工作得到了伊利诺伊大学芝加哥分校，国立卫生研究院（R01EY024363）和国家科学基金会（MCB 2017274）对XY的资助。
Materials
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
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