Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım

X-ışını radyasyonunun iyonlaştırıcı etkileri nedeniyle, protein kristalografisi, büyük ölçüde, son otuz yılda kriyojenik koşullarla sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, fonksiyonu sırasında protein hareketlerinin mevcut bilgisi, büyük ölçüde, kriyojenik koşullar altında farklı durumlarda gözlenen statik yapılar arasındaki karşılaştırmalardan kaynaklanmaktadır. Bununla birlikte, kriyojenik sıcaklıklar kaçınılmaz olarak biyokimyasal reaksiyonun ilerlemesini veya protein molekülleri çalışırken farklı konformasyonel durumlar arasındaki karşılıklı dönüşümü engeller. Kristalografi ile atomik çözünürlükte protein yapısal dinamiklerini doğrudan gözlemlemek için, oda sıcaklığında kırınım deneyleri yapmak için sağlam ve rutin yöntemlere ihtiyaç vardır, bu da numune sunumu, veri toplama ve posterior veri analizinde teknik yenilikler gerektirir. Bu amaçla, seri kristalografideki son gelişmeler,^ara ürünlerin ve kısa ömürlü yapısal türlerin moleküler görüntülerini oda sıcaklığında ^1,2,3 olarak yakalamak için yeni yollar sunmuştur. Geleneksel kriyokristalografide yaygın olarak kullanılan “bir-kristal-bir-veri kümesi” stratejisinin aksine, seri kristalografi, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskobuna benzer bir veri toplama stratejisi benimser. Spesifik olarak, seri kristalografideki deneysel veriler, çok sayıda bireysel örneklemden küçük fraksiyonlar halinde toplanır, bunu veri fraksiyonlarının değerlendirildiği ve 3D yapı belirleme için eksiksiz bir veri kümesinde birleştirildiği yoğun veri işleme^{izler 4}. Bu “tek kristalli tek atış” stratejisi, yıkım stratejisi^5’ten önce bir kırınım yoluyla oda sıcaklığında protein kristallerine X-ışını radyasyon hasarını etkili bir şekilde hafifletir.

Seri kristalografi, bir veri kümesini tamamlamak için çok sayıda protein kristali gerektirdiğinden, protein örneklerinin sınırlı olduğu ve / veya hassas kristal kullanımının söz konusu olduğu birçok biyolojik sistem için büyük teknik zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bir diğer önemli husus, seri kırınım deneylerinde kristal bütünlüğünün en iyi şekilde nasıl korunacağıdır. In situ kırınım yöntemleri, protein kristallerinin kristalleşme odası 6,7,8,9’un mührünü kırmadan doğrudan büyüdükleri yerden difüzyon yapmalarına izin vererek bu endişeleri ele almaktadır. Bu elleçlemesiz yöntemler, büyük ölçekli seri kırınımla doğal olarak uyumludur. Son zamanlarda, kristal üzerine kristal konseptine dayanan in situ kırınım için bir kristalizasyon cihazının tasarımını ve uygulanmasını bildirdik – doğrudan monokristalin kuvars¹¹ üzerinde yetiştirilen protein kristalleri. Bu “kristal üzerine kristal” cihaz çeşitli avantajlar sunar. İlk olarak, çok az arka plan saçılması üreten monokristalin kuvars substrattan yapılmış bir X-ışını ve ışık şeffaf pencereye sahiptir, bu nedenle protein kristallerinden kırınım görüntülerinde mükemmel sinyal-gürültü oranları ile sonuçlanır. İkincisi, tek kristalli kuvars, cama eşdeğer mükemmel bir buhar bariyeridir, böylece protein kristalizasyonu için kararlı bir ortam sağlar. Buna karşılık, polimer bazlı substratlar kullanan diğer kristalizasyon cihazları, polimer malzeme önemli bir kalınlığa sahip olmadığı sürece buhar geçirgenliği nedeniyle kurumaya eğilimlidir, bu da sonuç olarak yüksek arka plan saçılmasına katkıda bulunur¹⁰. Üçüncüsü, bu cihaz, kristal bütünlüğünü korumak için kritik olan herhangi bir kristal manipülasyonu veya hasadı olmadan X-ışını ışınına çok sayıda protein kristalinin verilmesini sağlar¹¹.

Kristal üzerine kristal cihazları kullanarak seri X-ışını kırınım deneylerini kolaylaştırmak için, optik tarama ve X-ışını kırınım modları¹² arasında kolay geçişi kolaylaştırmak için bir difraktometre prototipi geliştirdik. Bu difraktometre küçük bir ayak izine sahiptir ve Argonne Ulusal Laboratuvarı’ndaki Gelişmiş Foton Kaynağı’nın (APS) iki ışın çizgisinde seri veri toplama için kullanılmıştır. Özellikle, Laue kırınımı için BioCARS 14-ID-B ve tek renkli salınım için LS-CAT 21-ID-D kullandık. Bu difraktometre donanımı, bir senkrotron veya X-ışını serbest elektron lazer ışın hattı iki temel yetenekle donatılmışsa gerekli değildir: (1) X-ışını ışını etrafında her yöne ±12 mm’lik bir hareket aralığına sahip motorlu numune konumlandırma; ve (2) incelenen protein kristalleri için güvenli olan ışık aydınlatması altında kristal görüntüleme için eksen üstü bir dijital kamera. Monokristal kuvars cihazı, taşınabilir bir difraktometre ve optik tarama, kristal tanıma ve otomatik yerinde veri toplama kontrol yazılımı ile birlikte seri kristalografi için inSituX platformunu oluşturur. Bu gelişme öncelikle polikromatik bir X-ışını kaynağı kullanan dinamik kristalografi uygulamalarından kaynaklansa da, bu teknolojinin monokromatik salınım yöntemlerini destekleme potansiyelini gösterdik^10,12. Otomasyon ile bu platform, uygun fiyatlı protein tüketimi ile oda sıcaklığında yüksek verimli bir seri veri toplama yöntemi sunar.

Bu katkıda, ıslak bir laboratuvarda çip üzerinde kristalizasyonun nasıl kurulacağını ve inSituX platformunu kullanarak bir senkrotron ışın hattında seri X-ışını veri toplamanın nasıl gerçekleştirileceğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Toplu iş yöntemi, aynı protein numunesi için elde edilen buhar difüzyon yöntemine benzer bir koşul altında çip üzerinde kristalizasyonu ayarlamak için kullanılır (Tablo 1). Başlangıç noktası olarak, buhar difüzyon yöntemi için bunun 1.2-1.5x konsantrasyonunda çökeltici kullanmanızı öneririz. Gerekirse, parti kristalizasyon koşulu ince ızgara taraması ile daha da optimize edilebilir. Kuvars gofretler optimizasyon denemeleri için gerekli değildir; bunun yerine cam kapaklar kullanılabilir (aşağıya bakınız). Optimizasyon denemelerini daha küçük ölçekte tutmak için kısmen yüklü kristalizasyon cihazları önerilir. Bir dizi protein örneği, parti yöntemi¹⁰ kullanılarak bu tür cihazlarda başarıyla kristalize edilmiştir (Tablo 1).

Cihazın kendisi aşağıdaki parçalardan oluşur: 1) bir dış halka; 2) iki kuvars gofret; 3) plastik veya paslanmaz çelikten bir yıkayıcı benzeri şim; 4) bir tutma halkası; 5) sızdırmazlık maddesi olarak mikroskop daldırma yağı (Şekil 1). Bir çipe yüklenen kristalizasyon çözeltisinin toplam hacmi, deneyin amacına bağlıdır. Kristalizasyon odasının kapasitesi, farklı kalınlıklarda ve / veya iç çaplarda bir şim seçilerek ayarlanabilir. 50-100 μm kalınlığında şimler kullanarak rutin olarak 10-20 μL kapasiteli kristalizasyon cihazları kuruyoruz. Tipik bir cihaz, seri veri toplama için yeterli on binlerce protein kristali üretebilir (Şekil 2).

Başarılı olduğunda, çip üzerinde kristalizasyon, X-ışını kırınımı için hazır her kuvars cihazında onlarca ila yüzlerce hatta binlerce protein kristali üretecektir. Bir senkrotron ışın hattında, böyle bir cihaz, kinematik bir mekanizma kullanılarak difraktometrenin üç eksenli bir çeviri aşamasına monte edilir. Monte edilmiş bir cihazın kristalleşme penceresi optik olarak taranır ve onlarca ila yüzlerce mikrografta görüntülenir. Bu mikrograflar daha sonra yüksek çözünürlüklü bir montaja dikilir. Işığa duyarlı kristaller için, istenmeyen fotoaktivasyonu önlemek için kızılötesi (IR) ışık altında optik tarama yapılabilir. Cihaz üzerinde rastgele dağıtılan protein kristallerini tanımlamak ve bulmak için bir bilgisayarlı görme yazılımı geliştirilmiştir. Bu kristaller daha sonra seri kristalografide veri toplama stratejisini bilgilendirmek veya yönlendirmek için boyutlarına, şekillerine ve konumlarına göre sıralanır. Örneğin, hedeflenen her kristal üzerinde tek veya birden fazla atış bulunabilir. Kullanıcılar hedeflenen kristaller aracılığıyla tek bir geçiş veya birden fazla rota planlayabilirler. Çeşitli seyahat rotalarını hesaplamak için yazılım uyguladık. Örneğin, en kısa yol, seyahat eden satıcı problemini ele alan algoritmalar kullanılarak hesaplanır¹³. Pompa-prob dinamik kristalografik uygulamalar için, lazer (pompa) ve X-ışını (prob) çekimlerinin zamanlaması ve süresi seçilebilir. Otomatik bir seri veri toplama, hedeflenen her kristali birbiri ardına X-ışını ışınına dönüştürmek için programlanmıştır.

InsituX difraktometrenin temel bileşenleri şunlardır: 1) bir cihaz tutucu; 2) üç eksenli çeviri aşaması; 3) optik tarama için bir ışık kaynağı; 4) bir X-ışını ışını durdurma; 5) ışığa duyarlı proteinler incelenirse lazerleri pompalayın; 6) IR’ye duyarlı bir kamera ile donatılmış Raspberry Pi mikrobilgisayarı; 7) motorları, kamerayı, ışık kaynaklarını, pompa lazerini senkronize etmek ve ışın hattı kontrolleri ile arayüz oluşturmak için kontrol yazılımı.