Cristallizzazione su chip e diffrazione seriale su larga scala a temperatura ambiente

A causa degli effetti ionizzanti delle radiazioni a raggi X, la cristallografia delle proteine, in larga misura, è stata limitata alle condizioni criogeniche negli ultimi tre decenni. Pertanto, l’attuale conoscenza dei movimenti delle proteine durante la sua funzione deriva in gran parte da confronti tra strutture statiche osservate in diversi stati in condizioni criogeniche. Tuttavia, le temperature criogeniche ostacolano inevitabilmente la progressione di una reazione biochimica o l’interconversione tra diversi stati conformazionali mentre le molecole proteiche sono al lavoro. Per osservare direttamente la dinamica strutturale delle proteine a risoluzione atomica mediante cristallografia, sono necessari metodi robusti e di routine per condurre esperimenti di diffrazione a temperatura ambiente, il che richiede innovazioni tecniche nella consegna del campione, nella raccolta dei dati e nell’analisi dei dati posteriori. A tal fine, i recenti progressi nella cristallografia seriale hanno offerto nuove strade per catturare le immagini molecolari di specie strutturali intermedie e di breve durata a temperatura ambiente ^1,2,3. In contrasto con la strategia “one-crystal-one-dataset” ampiamente utilizzata nella criocristallografia convenzionale, la cristallografia seriale adotta una strategia di raccolta dati simile a quella della crio-microscopia elettronica a singola particella. In particolare, i dati sperimentali in cristallografia seriale vengono raccolti in piccole frazioni da un gran numero di singoli campioni, seguiti da un’elaborazione intensiva dei dati in cui le frazioni di dati vengono valutate e combinate in un set di dati completo per la determinazione della struttura 3D⁴. Questa strategia “one-crystal-one-shot” allevia efficacemente il danno da radiazioni a raggi X ai cristalli proteici a temperatura ambiente attraverso una strategia di diffrazione prima della distruzione⁵.

Poiché la cristallografia seriale richiede un gran numero di cristalli proteici per completare un set di dati, pone importanti sfide tecniche per molti sistemi biologici in cui i campioni proteici sono limitati e / o è coinvolta una delicata manipolazione dei cristalli. Un’altra considerazione importante è come preservare al meglio l’integrità dei cristalli negli esperimenti di diffrazione seriale. I metodi di diffrazione in situ affrontano queste preoccupazioni consentendo ai cristalli proteici di diffrattarsi direttamente da dove crescono senza rompere il sigillo della camera di cristallizzazione 6,7,8,9. Questi metodi senza manipolazione sono naturalmente compatibili con la diffrazione seriale su larga scala. Abbiamo recentemente riportato la progettazione e l’implementazione di un dispositivo di cristallizzazione per la diffrazione in situ basato su un concetto di cristallo su cristallo – cristalli proteici cresciuti direttamente su quarzo monocristallino¹¹. Questo dispositivo “cristallo su cristallo” offre diversi vantaggi. In primo luogo, è dotato di una finestra trasparente a raggi X e luce fatta di un substrato di quarzo monocristallino, che produce poca dispersione dello sfondo, risultando quindi in eccellenti rapporti segnale-rumore nelle immagini di diffrazione da cristalli proteici. In secondo luogo, il quarzo monocristallino è un’eccellente barriera al vapore equivalente al vetro, fornendo così un ambiente stabile per la cristallizzazione delle proteine. Al contrario, altri dispositivi di cristallizzazione che utilizzano substrati a base di polimeri sono soggetti ad essiccazione a causa della permeabilità al vapore, a meno che il materiale polimerico non abbia uno spessore sostanziale, che di conseguenza contribuisce a un’elevata dispersione di fondo¹⁰. In terzo luogo, questo dispositivo consente la consegna di un gran numero di cristalli proteici al fascio di raggi X senza alcuna forma di manipolazione o raccolta dei cristalli, che è fondamentale per preservare l’integrità dei cristalli¹¹.

Per semplificare gli esperimenti seriali di diffrazione dei raggi X utilizzando i dispositivi cristallo su cristallo, abbiamo sviluppato un prototipo di diffrattometro per facilitare il passaggio tra la scansione ottica e le modalità di diffrazione dei raggi X¹². Questo diffrattometro ha un ingombro ridotto ed è stato utilizzato per la raccolta di dati seriali su due linee di luce dell’Advanced Photon Source (APS) presso l’Argonne National Laboratory. In particolare, abbiamo utilizzato BioCARS 14-ID-B per la diffrazione di Laue e LS-CAT 21-ID-D per l’oscillazione monocromatica. Questo hardware diffrattometrico non è necessario se una linea di fascio laser a raggi X o a raggi X a elettroni liberi è dotata di due funzionalità chiave: (1) posizionamento motorizzato del campione con un raggio di corsa di ±12 mm attorno al fascio di raggi X in tutte le direzioni; e (2) una fotocamera digitale in asse per la visualizzazione dei cristalli sotto l’illuminazione della luce che è sicura per i cristalli proteici in studio. Il dispositivo al quarzo monocristallino insieme a un diffrattometro portatile e al software di controllo per la scansione ottica, il riconoscimento dei cristalli e la raccolta automatica dei dati in situ costituiscono collettivamente la piattaforma inSituX per la cristallografia seriale. Sebbene questo sviluppo sia principalmente motivato dalle sue applicazioni di cristallografia dinamica che utilizzano una sorgente di raggi X policromatica, abbiamo dimostrato il potenziale di questa tecnologia per supportare i metodi di oscillazione monocromatica^10,12. Con l’automazione, questa piattaforma offre un metodo di raccolta dati seriale ad alta produttività a temperatura ambiente con un consumo di proteine accessibile.

In questo contributo, descriviamo in dettaglio come impostare la cristallizzazione su chip in un laboratorio umido e come eseguire la raccolta seriale di dati a raggi X su una linea di fascio di sincrotrone utilizzando la piattaforma inSituX.

Il metodo batch viene utilizzato per impostare la cristallizzazione su chip in una condizione simile a quella del metodo di diffusione del vapore ottenuto per lo stesso campione proteico (Tabella 1). Come punto di partenza, si consiglia di utilizzare il precipitante a una concentrazione di 1,2-1,5x di quello per il metodo di diffusione del vapore. Se necessario, la condizione di cristallizzazione del lotto può essere ulteriormente ottimizzata tramite uno screening a griglia fine. I wafer di quarzo non sono necessari per le prove di ottimizzazione; Al suo posto possono essere utilizzati vetrini di copertura (vedi sotto). Si consiglia di eseguire dispositivi di cristallizzazione parzialmente caricati per mantenere le prove di ottimizzazione su scala ridotta. Un certo numero di campioni di proteine sono stati cristallizzati con successo su tali dispositivi utilizzando il metodo batch¹⁰ (Tabella 1).

Il dispositivo stesso è costituito dalle seguenti parti: 1) un anello esterno; 2) due wafer di quarzo; 3) uno spessore simile a una rondella di plastica o acciaio inossidabile; 4) un anello di fissaggio; 5) olio ad immersione per microscopio come sigillante (Figura 1). Il volume totale della soluzione di cristallizzazione caricata su un chip dipende dallo scopo dell’esperimento. La capacità della camera di cristallizzazione può essere regolata scegliendo uno spessore di diverso spessore e/o diametro interno. Installiamo regolarmente dispositivi di cristallizzazione di capacità di 10-20 μL utilizzando spessori di 50-100 μm di spessore. Un dispositivo tipico può produrre da decine a migliaia di cristalli proteici adeguati per la raccolta seriale dei dati (Figura 2).

In caso di successo, la cristallizzazione su chip produrrà da decine a centinaia o addirittura migliaia di cristalli proteici su ciascun dispositivo al quarzo pronti per la diffrazione a raggi X. A una linea di fascio di sincrotrone, tale dispositivo è montato su uno stadio di traslazione a tre assi del diffrattometro utilizzando un meccanismo cinematico. La finestra di cristallizzazione di un dispositivo montato viene scansionata otticamente e ripresa in decine o centinaia di micrografie. Queste micrografie vengono poi cucite in un montaggio ad alta risoluzione. Per i cristalli fotosensibili, la scansione ottica può essere eseguita sotto luce infrarossa (IR) per evitare fotoattivazione involontaria. È stato sviluppato un software di visione artificiale per identificare e localizzare cristalli proteici distribuiti casualmente sul dispositivo. Questi cristalli vengono quindi classificati in base alle loro dimensioni, forma e posizione per informare o guidare la strategia di raccolta dei dati nella cristallografia seriale. Ad esempio, colpi singoli o multipli possono essere posizionati su ciascun cristallo mirato. Gli utenti potrebbero pianificare un singolo passaggio o più percorsi attraverso cristalli mirati. Abbiamo implementato un software per calcolare vari percorsi di viaggio. Ad esempio, il percorso più breve viene calcolato utilizzando algoritmi che risolvono il problema del commesso viaggiatore¹³. Per applicazioni cristallografiche dinamiche pompa-sonda, è possibile scegliere la tempistica e la durata delle riprese laser (pompa) e a raggi X (sonda). Una raccolta automatica di dati seriali è programmata per traslocare ogni cristallo mirato nel fascio di raggi X uno dopo l’altro.

I componenti chiave del diffrattometro insituX includono: 1) un supporto per dispositivo; 2) una fase di traslazione a tre assi; 3) una sorgente luminosa per la scansione ottica; 4) un arresto del fascio di raggi X; 5) pompare laser se vengono studiate proteine sensibili alla luce; 6) Microcomputer Raspberry Pi dotato di una fotocamera sensibile agli infrarossi; 7) software di controllo per sincronizzare motori, telecamera, sorgenti luminose, laser a pompa, e per interfacciarsi con i controlli beamline.