Surveillance en temps réel de la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines
Summary
L’adaptation métabolique est fondamentale pour les lymphocytes T car elle dicte la différenciation, la persistance et la cytotoxicité. Ici, un protocole optimisé pour surveiller la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines ex vivo est présenté.
Abstract
Lors de l’activation, le métabolisme des lymphocytes T s’adapte aux changements qui ont un impact sur leur devenir. Une augmentation de la phosphorylation oxydative mitochondriale est indispensable pour l’activation des lymphocytes T, et la survie des lymphocytes T mémoire dépend du remodelage mitochondrial. Par conséquent, cela affecte le résultat clinique à long terme des immunothérapies anticancéreuses. Les changements dans la qualité des lymphocytes T sont souvent étudiés par cytométrie en flux à l’aide de marqueurs de surface bien connus et non directement par leur état métabolique. Il s’agit d’un protocole optimisé pour mesurer la respiration mitochondriale en temps réel des cellules T humaines primaires à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire et des cytokines IL-2 et IL-15, qui affectent différemment le métabolisme des cellules T. Il est démontré que l’état métabolique des lymphocytes T peut être clairement distingué en mesurant la consommation d’oxygène lors de l’inhibition de complexes clés dans la voie métabolique et que la précision de ces mesures dépend fortement de la concentration optimale d’inhibiteurs et de la stratégie d’injection d’inhibiteurs. Ce protocole normalisé aidera à mettre en œuvre la respiration mitochondriale en tant que norme pour l’aptitude des lymphocytes T dans la surveillance et l’étude des immunothérapies contre le cancer.
Introduction
Le développement et la fonction corrects des lymphocytes T sont essentiels à la capacité du système immunitaire à reconnaître les antigènes et à y répondre. La phosphorylation oxydative mitochondriale (OxPhos) change en fonction de l’état de la cellule T. Les lymphocytes T naïfs utilisent principalement OxPhos pour produire de l’ATP, tandis que les lymphocytes T activés subissent une transition métabolique où la glycolyse devient dominante1. Après la phase effectrice, le petit sous-ensemble restant de lymphocytes T mémoire revient à un état métabolique dominé par OxPhos2,3. Les changements d’OxPhos suivent la différenciation des lymphocytes T à un tel degré que même des sous-ensembles de lymphocytes T peuvent être différenciés par leurs propriétés spécifiques d’OxPhos1. Inversement, OxPhos est important pour le fonctionnement des lymphocytes T, et il a été démontré que l’inhibition d’OxPhos bloque la prolifération et la production de cytokines des lymphocytes T4. Par conséquent, la capacité de quantifier les propriétés des lymphocytes T OxPhos de manière précise et reproductible est un outil puissant pour quiconque travaille avec des lymphocytes T.
Dans ce protocole, les propriétés des lymphocytes T OxPhos sont mesurées à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire. La fonction principale de cet analyseur est de mesurer en continu la teneur en oxygène des milieux de croissance des cellules à analyser. L’oxygène retiré du milieu de croissance est supposé être absorbé par les cellules. En traitant les cellules avec une variété d’inhibiteurs ou de modificateurs d’OxPhos, une baisse de l’absorption d’oxygène est associée à la fonction inhibée ou modulée. Par exemple, l’inhibition de l’ATP synthase entraînera une réduction de l’absorption cellulaire de l’oxygène qui serait autrement utilisé pour produire de l’ATP par phosphorylation oxydative. D’autres équipements, y compris l’électrode Clark et l’instrument Oroboros, offrent des fonctionnalités similaires, et chaque instrument présente des avantages et des inconvénients différents. Un large éventail de types de cellules peut être utilisé pour des études dans ces dispositifs, mais un type de cellule particulièrement difficile est les lymphocytes T primaires humains5. En raison de leur petite taille, de leur faible survie ex vivo et de leurs propriétés non adhérentes, les cellules T primaires humaines peuvent être difficiles à étudier.
Il s’agit d’un protocole pour étudier la respiration mitochondriale des cellules T primaires humaines par un analyseur extracellulaire. Le protocole est divisé en une série d’optimisation, où les concentrations optimales du nombre de cellules par puits, ainsi que la concentration optimale d’olligomycine et de FCCP, sont déterminées. En outre, une exécution d’essai, où les conditions optimisées sont utilisées.
En utilisant des PBMC humains d’origine sanguine et des cultures de lymphocytes T primaires ex vivo , ce protocole démontre l’importance d’une concentration optimale d’inhibiteurs et la pertinence d’utiliser une injection séparée au lieu d’une injection séquentielle d’inhibiteurs mitochondriaux lorsque vous travaillez avec des types de cellules sensibles. Enfin, il est démontré que ce test peut détecter de manière robuste des différences subtiles dans la respiration mitochondriale lors de la polarisation avec les cytokines IL-2 et IL-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
La quantification détaillée et correcte de la phosphorylation oxydative est un outil indispensable pour décrire les états énergétiques des lymphocytes T. L’état de la condition mitochondriale peut être directement lié au potentiel d’activation, à la survie et à la différenciation des lymphocytes T1,5. Avec ce protocole, il est possible de déterminer les différentes propriétés de la phosphorylation oxydative (voir tableau 4 pou…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kasper Mølgaard et Anne Rahbech ont reçu des subventions de Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard a également reçu une subvention du Børnecancerfonden.
Materials
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
- vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
- Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath–new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
- vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
- Chang, C. -. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).
